专利名称：利用正反义探针共杂交技术提高基因芯片检测效率的方法
技术领域：
本发明属于核酸分子杂交技术，具体地讲是利用正反义探针共杂交技术提高基因芯片检测目的基因的效率。
背景技术：
DNA分子杂交是广泛应用的一项分子生物学检测目的基因的技术。其原理是单链DNA分子可以通过碱基互补形成碱基配对，使两条具有互补碱基序列的DNA单链形成DNA双链。基因芯片正是通过这种原理将一系列具有特异性序列的单链分子点于基质表面上，并与含有特定序列的目的基因DNA分子进行杂交形成杂合DNA双链分子(其中一条为目的基因链，另一条为探针链)，再经特定的显色技术收集杂交信号。通过杂交信号定量或定性判断目的基因。该技术自产生以来，已广泛应用于微生物鉴定、基因判读和基因表达分析等多个领域，是目前世界上广泛使用的一项新兴分子生物学技术。该技术发展的热点在于如何提高其检测目的基因的特异性和灵敏度，以及如何使其更好地应用于目的基因的定量分析。解决这些问题的关键是探针设计技术。
发明内容
目前国际上还没有一种类似于本发明的探针设计方法，用以提高DNA分子杂交效率，从而提高基因芯片检测目的基因的效率。实践中依然运用一条探针分子同目的基因DNA分子双链中的一条链进行杂交的方法。这种方法造成了杂交体系中目的基因另一条单链大量积累，严重影响杂交反应平衡向生成杂交产物的方向进行，同时浪费了另一条单链上的信号报告基团，使杂交信号减弱，降低杂交反应的灵敏度。当该方法应用于目的基因定量分析时，由于杂交反应平衡问题将严重影响定量分析的结果。
针对上述情况，本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种探针设计方法。为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的设计两条都具有特异性的探针分别固定在基因芯片基质表面的同一位点上，使之同目的基因的两条链同时杂交。这样，一方面避免了目的基因另一条DNA单链上的信号基团的浪费，同时促进分子杂交反应向有利于杂交产物生成的方向进行。
为了具体验证该技术的可行性，本技术首先通过选择大肠杆菌基因组DNA中的23SrRNA基因中的DNA片段作为待检测的目的基因，并通过设计和该基因能够特异杂交的DNA寡核苷酸序列作为探针进行本发明的检测实施例。
所选择扩增的大肠杆菌基因组DNA中的23S rRNA基因片段的序列(988bp)如下TCAGAGGCGA TGAAGGACGT GCTAATCTGC GATAAGCGTC GGTAAGGTGATATGAACCGT TATAACCGGC GATTTCCGAA TGGGGAAACC CAGTGTGATTCGTCACACTA TCATTAACTG AATCCATAGG TTAATGAGGC GAACCGGGGGAACTGAAACA TCTAAGTACC CCGAGGAAAA GAAATCAACC GAGATTCCCCCAGTAGCGGC GAGCGAACGG GGAGGAGCCC AGAGCCTGAA TCAGTGTGTGTGTTAGTGGA AGCGTCTGGA AAGGCGCGCG ATACAGGGTG ACAGCCCCGTACACAAAAAT GCACATACTG TGAGCTCGAT GAGTAGGGCG GGACACGTGGTATCCTGTCT GAATATGGGG GGACCATCCT CCAAGGCTAA ATACTCCTGACTGACCGATA GTGAACCAGT ACCGTGAGGG AAAGGCGAAA AGAACCCCGGCGAGGGGAGT GAAAAAGAAC CTGAAACCGT GTACGTACAA GCAGTGGGAG
CCTCTTTTAT GGGGTGACTG CGTACCTTTT GTATAATGGG TCAGCGACTTATATTCTGTA GCAAGGTTAA CCGAATAGGG GAGCCGAAGG GAAACCGAGTCTTAACCGGG CGTTAAGTTG CAGGGTATAG ACCCGAAACC CGGTGATCTAGCCATGGGCA GGTTGAAGGT TGGGTAACAC TAACTGGAGG ACCGAACCGACTAATGTTGA AAAATTAGCG GATGACTTGT GGCTGGGGGT GAAAGGCCAATCAAACCGGG AGATAGCTGG TTCTCCCCGA AAGCTATTTA GGTAGCGCCTCGTGAATTCA TCTCCGGGGG TAGAGCACTG TTTCGGCAAG GGGGTCATCCCGACTTACCA ACCCGATGCA AACTGCGAAT ACCGGAGAAT GTTATCACGGGAGACATACG GCGGGTGCTA ACGTCCGTCG TGAAGAGGGA AACAACCCAGACCGCCAGCT AAGGTCCCAA AGTCATGGTT AAGTGGGA用PCR方法扩增上述大肠杆菌基因组DNA样品中的23S rRNA基因片段，同时进行地高辛标记。扩增时使用的PCR引物序列如下引物序列1TCAGAGGCGATGAAGGAC引物序列2TCCCACTTAACCATGACTTTG本发明运用生物信息学方法所设计的探针序列如下探针序列3 AGGTTAACCGAATAGGGGAG探针序列4 CTCCCCTATTCGGTTAACCT探针序列5 TAGCAAGGTTAACCGAATAGGGGAGCCGAA探针序列6 TTCGGCTCCCCTATTCGGTTAACCTTGCTA探针序列7 GACTGCGTACCTTTTGTATAAT探针序列8 ATTATACAAAAGGTACGCAGTC探针序列9 GAGCCTCTTTTATGGGGTGACT探针序列10 AGTCACCCCATAAAAGAGGCTC探针序列11 GGCGAAAAGAACCCCGGCGAGG探针序列12 CCTCGCCGGGGTTCTTTTCGCC探针序列3、5、7、9和11称为第一组探针，这组探针可以和目的基因中的一条DNA单链杂交(我们称其为目标DNA正链)；探针序列4、6、8、10和12称为第二组探针，这组探针可以和目的基因中的另一条DNA单链杂交(我们称其为目标DNA负链)。杂交之后，运用分子杂交-酶联免疫显色技术验证双分子共杂交的效率，并与常规的单探针杂交效率进行比较。该验证方法包括以下步骤1、用PCR方法扩增23S rRNA基因的DNA片段，同时进行地高辛标记。
PCR反应体系如下成分浓度 加样量PCR缓冲液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL 0.3μL引物序列一 10μmol/L2μL引物序列二 10μmol/L2μLdNTPs 每种2.5mmol/L0.3μLDIG-dUTP1mmol/L 0.3μL模板DNA(大肠杆菌DNA) 2μL双蒸水 33.1μL总体积 50μL
PCR方法中扩增程序为1)95℃10min2)95℃30s3)55℃20s4)72℃30s5)回到第2)步，重复5次6)95℃30s7)68℃30s8)回到第6)步，重复25次9)72℃2min2、将设计的特异性寡核苷酸基因探针点在带有正电荷的尼龙膜(Amersham公司，美国)上。分别制作三种尼龙膜，第一种膜又分两类，一类点接0.2μL第一组探针(探针序列3、5、7、9和11)，另一类点接0.2μL第二组探针(探针序列4、6、8、10和12)，用于常规的单分子杂交，两组探针的浓度都是10μmol/L；第二种膜是将上述两组探针中的每一个都单独点接在尼龙膜上，一共10个点样点，每一个点的点样量是0.2μL(浓度为10μmol/L)，用于双分子单杂交；第三种膜是将探针序列3、5、7、9、11点在尼龙膜上，点好样的尼龙膜在长波紫外灯下进行交联5-10min，然后再将探针4、6、8、10、12点在尼龙膜的对应位点上，具体对应关系为探针序列4点在探针序列3的位点上，探针序列5点在探针序列6的位点上，探针序列7点在探针序列8的位点上，探针序列9点在探针序列10的位点上，探针序列12点在探针序列11的位点上，在长波紫外灯下进行交联5-10min，用于双分子共杂交，10种探针中的每种点样量都是0.1μL(浓度为10μmol/L)。点好样的尼龙膜在长波紫外灯下进行交联5-10min。同时将0.2μL标记有地高辛基团的23S rRNA基因片段也点在每一张尼龙膜上，作为阳性对照。
3、杂交和杂交斑点的酶联免疫显色，按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒的说明书进行。
地高辛标记PCR产物和寡核苷酸探针杂交方法如下*预杂交预杂交液先预热到50℃，把点入寡核苷酸探针的尼龙膜放入预杂交袋中，加入预杂交液，封好口，于50℃预杂交30min。
*PCR扩增产物的变性DIG标记的PCR产物加热到95℃，10min，迅速插入冰浴。
*地高辛标记的靶DNA分子与尼龙膜杂交把预杂交好的尼龙膜放入杂交袋，加入变性的DIG标记的PCR产物10μL，再加入1mL杂交液(Roche公司的Dig Easy Hyb溶液)，封好口。50℃杂交1hr，温和摇动。
*杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶连免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。
*结果判读尼龙膜上的深蓝色斑点为阳性杂交结果，表明探针已检出样品中所含有的特异性序列。
图1第一组探针与10μL(约0.1μg)23S rRNA基因的杂交结果。
图2第一组探针与1μL(约0.01μg)23S rRNA基因的杂交结果。
图3第二组探针与10μL(约0.1μg)23S rRNA基因的杂交结果。
图4第二组探针与1μL(约0.01μg)23S rRNA基因的杂交结果。
图5第一组和第二组探针点在一张膜上与10μL(约0.1μg)23S rRNA基因的杂交结果。
图6第一组和第二组探针点在一张膜上与1μL(约0.01μg)23S rRNA基因的杂交结果。
图7第一组和第二组探针点在一张膜上与0.2μL(约0.002μg)23S rRNA基因的杂交结果。
图8双杂交探针与10μL(约0.1μg)23S rRNA基因的杂交结果。
图9双杂交探针与1μL(约0.01μg)23S rRNA基因的杂交结果。
图10双杂交探针与0.2μL(约0.002μg)23S rRNA基因的杂交结果。
具体实施例方式
实施例1第一组探针和第二组探针分别与标记的23S rRNA基因的杂交1.杂交膜的制备将0.2μL的序列3、序列5、序列7、序列9和序列11(浓度为10μmol/L)分别点在尼龙膜的不同位点上，然后在长波紫外灯下交联5-10min。同样，将0.2μL的序列4、序列6、序列8、序列10和序列12(浓度为10μmol/L)分别点在尼龙膜的不同位点上，然后在长波紫外灯下交联5-10min。以上两种杂交膜各制备2张。
2.23S rRNA基因的PCR扩增及地高辛标记PCR反应体系成分 浓度 加样量PCR缓冲液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL 0.3μL引物序列一10μmol/L2μL引物序列二10μmol/L2μLdNTPs 每种2.5mmol/L0.3μLDIG-dUTP 1mmol/L 0.3μL模板DNA(大肠杆菌DNA) 2μL双蒸水 33.1μL总体积 50μLPCR扩增条件1)95℃ 10min2)95℃ 30s3)55℃ 20s4)72℃ 30s5)回到第2)步，重复5次6)95℃ 30s7)68℃ 30s8)回到第6)步，重复25次9)72℃ 2min3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交*预杂交将预杂交液预热到50℃，把点入寡核苷酸探针的4张尼龙膜放入杂交袋中，加入预杂交液，封好口。于50℃水浴中预杂交30min。
*PCR扩增产物的变性将DIG标记的PCR产物加热到95℃，保持10min，然后迅速插入冰浴。
*地高辛标记的靶DNA分子与尼龙膜上的探针杂交把预杂交好的4张尼龙膜分别装入4个杂交袋中，含有第一组探针和第二组探针杂交膜的杂交袋分别加入10μL(约0.1μg)和1μL(约0.01μg)变性的DIG标记的PCR产物，再分别加入1mL杂交液，封好口。50℃杂交1hr，温和摇动。
*杂交阳性斑点的酶联免疫显色杂交斑点的酶连免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明进行。
*结果判读杂交结果是，在加入10μL(约0.1μg)PCR产物进行杂交的尼龙膜上，序列3、序列5、序列7、序列9和序列11的点样位置上均为深蓝色斑点，即为阳性杂交结果，见图1；在加入1μL(约0.01μg)PCR产物的尼龙膜上，序列3、序列5、序列7、序列9和序列11的点样位置上均无深蓝色斑点，即为阴性杂交结果，见图2；在加入10μL(约0.1μg)PCR产物进行杂交的尼龙膜上，序列4、序列6、序列8、序列10和序列12的点样位置上均为深蓝色斑点，即为阳性杂交结果，见图3；在加入1μL(约0.01μg)PCR产物的尼龙膜上，序列4、序列6、序列8、序列10和序列12的点样位置上均无深蓝色斑点，即为阴性杂交结果，见图4。实验表明，在该实验条件下，这种仅能和目标DNA的一条链(正链或负链)杂交的探针，可以检测到10μL(约0.1μg)的目标DNA，不能检测到1μL(约0.01μg)的标记产物。
图1和图2中的各个点分别是 图3和图4中的各个点分别是1阳性对照1阳性对照2探针序列3 2探针序列43探针序列5 3探针序列64探针序列7 4探针序列85探针序列9 5探针序列106探针序列11 6探针序列12实施例2正反义探针与23S rRNA基因的单杂交1.杂交膜的制备将浓度为10μmol/L的10种探针(第一组和第二组)各0.1μL分别独立地点在尼龙膜上，构成杂交用DNA微阵列，一共制备3张膜，然后在长波紫外下交联5-10min。
2.23S rRNA基因的PCR扩增及地高辛标记PCR反应体系和条件同实施例1。
3.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交预杂交和PCR扩增产物的变性同实施例1。在进行杂交时，3个杂交袋分别放入1个点有10种探针的杂交膜，然后分别加入变性的DIG标记的PCR产物10μL(0.1μg)、1μL(0.01μg)和0.2μL(0.002μg)，再加入1mL杂交液，封好口，50℃杂交1hr，温和摇动。杂交斑点的酶连免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。
*结果判读杂交结果是，在加入10μL(0.1μg)PCR产物进行杂交的尼龙膜上，探针序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12的位置上均出现深蓝色斑点，即为阳性杂交结果，见图5；在加入1μL(0.01μg)PCR产物进行杂交的尼龙膜上，上述10个探针序列位置也均出现深蓝色斑点，即为阳性杂交结果，见图6；在加入0.2μL(0.002μg)PCR产物进行杂交的尼龙膜上，上述10个探针序列位置均无深蓝色斑点出现，即为阴性杂交结果，见图7。这一结果表明，在该实验条件下，将分别能与目标DNA的正链和负链进行杂交的探针点在同一张膜上的方法，可以检测到1μL(约0.01μg)的目标DNA，而不能检出0.2μL(0.002μg)的标记产物。相对于实施例1，其灵敏度提高10倍。
图5、图6和图7中的各个点分别是
1阳性对照2探针序列33探针序列44探针序列55探针序列66探针序列77探针序列88探针序列99探针序列1010探针序列1111探针序列12实施例3正反义探针与23S rRNA基因的共杂交1.杂交膜的制备将浓度为10μmol/L的探针序列3、序列5、序列7、序列9和序列11各0.1μL独立地点在尼龙膜上，在长波紫外灯下交联5-10min，于4℃阴干30min；然后按照上面的序列点样顺序，在已经点样的位置上分别点接0.1μL序列4、序列6、序列8、序列10和序列12。也就是说，第一个点样位点含有序列3和序列4，第二个点样位点含有序列5和序列6，第三个点样位点含有序列7和序列8，第四个点样位点含有序列9和序列10，第五个点样位点含有序列11和序列12。然后，在长波紫外灯下交联5-10min，于4℃阴干30min。
2.23S rRNA基因的PCR扩增及地高辛标记PCR反应体系和条件同实施例1。
2.PCR扩增及地高辛标记2.靶基因扩增产物与尼龙膜上探针的杂交预杂交和PCR扩增产物的变性同实施例1。在进行杂交时，3个杂交袋分别放入1个点有10种探针的杂交膜，然后分别加入变性的DIG标记的PCR产物10μL(0.1μg)、1μL(0.01μg)和0.2μL(0.002μg)，再加入1mL杂交液，封好口，50℃杂交1hr，温和摇动。杂交斑点的酶连免疫显色按照Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒说明书进行。
*结果判读杂交结果是，在加入10μL(0.1μg)PCR产物进行杂交的尼龙膜上，由探针序列3和序列4、序列5和序列6、序列7和序列8、序列9和序列10以及序列11和序列12形成的5个位置上均出现深蓝色斑点，即为阳性杂交结果，见图8；在加入1μL(0.01μg)PCR产物进行杂交的尼龙膜上，上述5个位置也均出现深蓝色斑点，即为阳性杂交结果，见图9；在加入0.2μL(0.002μg)PCR产物进行杂交的尼龙膜上，上述5个位置同样出现深蓝色斑点，即为阴性杂交结果，见图10。这一结果表明，在该实验条件下，采用正反义探针共杂交方法，可以检测到0.2μL(约0.002μg)的目标DNA。与实施例1中常规单杂交探针相比，其灵敏度提高50倍，与实施例2中的正反义探针单杂交相比，其灵敏度提高5倍。
图8、图9和图10中的各个点分别是1阳性对照2探针序列3和探针序列4混合样品；3探针序列5和探针序列6混合样品；4探针序列7和探针序列8混合样品；5探针序列9和探针序列10混合样品；6探针序列11和探针序列12混合样品。
权利要求
1.利用正反义探针共杂交技术提高基因芯片检测效率的方法，其特征在于，设计两条分别能和所检测的目的基因的两条核酸链同时杂交的探针，与目的基因的两条链同时杂交形成核酸杂合分子。
2.根据权利要求1所述的利用正反义探针共杂交技术提高基因芯片检测效率的方法，其特征在于，它包括正反义探针共杂交方法，其简要步骤如下将分别能和目的基因的正链和负链进行杂交的一对寡核苷酸探针先后固定在芯片基质的同一个位点上，然后与标记的被检测样品进行杂交。
3.根据权利要求1所述的利用正反义探针共杂交技术提高基因芯片检测效率的方法，其特征在于，它包括正反义探针单杂交方法，其简要步骤如下将分别能和目的基因的正链和负链进行杂交的一对寡核苷酸探针同时固定在芯片基质的不同位点上，然后与标记的被检测样品进行杂交。
4.利用正反义探针共杂交技术提高基因芯片检测效率的方法在基因芯片和所有核酸杂交反应中的应用。
5.正反义探针共杂交技术的称谓，其特征在于，仅将把能和目的基因的两条核酸链分别杂交的两条探针同时应用在同一杂交反应体系中的探针设计和基因芯片设计方法，称为正反义探针共杂交技术。
全文摘要
本发明公开了一种利用正反义探针共杂交技术提高基因芯片检测效率的方法，属于核酸分子杂交技术领域。其技术方案是通过设计两条能够和目的基因的核酸双链分别杂交的探针，形成稳定的探针—目的基因杂交产物，促进杂交反应向形成产物的方向进行，大幅度提高杂交信号的强度。应用该方法设计的正反义探针所制备的杂交膜，可以大大提高探针与目的基因的结合效率。在相同条件下，与常规的单探针杂交相比，检测目的基因的灵敏度提高50倍。该方法可应用于高灵敏度基因检测芯片的制备和所有核酸杂交实验。
文档编号C12Q1/68GK1766122SQ200510014860
公开日2006年5月3日 申请日期2005年8月25日 优先权日2005年8月25日
发明者黄熙泰, 刘寅, 李永君, 郑泽军, 魏晓娜 申请人:南开大学