专利名称：一种肽聚糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种肽聚糖的制备方法，具体来说涉及一种用味精发酵生产废水中的谷氨酸棒杆菌制备肽聚糖的方法。
背景技术：
肽聚糖是所有细菌细胞壁的主要组成成分，约占细胞壁干重的50％，肽聚糖对动物的免疫系统产生不同的免疫调节作用，是很好的免疫增强剂。目前国内外的研究人员主要通过发酵培养双歧杆菌、乳酸菌等来提取肽聚糖，不但肽聚糖的产量低，工艺成本高，而且大多处于实验阶段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低且产量高的肽聚糖制备方法。
本发明以味精发酵废水中含有的谷氨酸棒杆菌为原料，通过化学及酶解抽提，得到肽聚糖，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种肽聚糖的制备方法，其特征是由以下步骤组成(1)收集味精发酵废水，4000×g离心30min得菌体沉淀，用生理盐水离心洗涤；(2)将菌体悬浮在质量分数8％的三氯乙酸溶液中，控制1∶10稀释液的浓度在620nm波长下光密度值为0.78～0.82的范围内，沸水浴后冷却，5000×g离心分离10min得沉淀，沉淀用蒸馏水离心洗涤；(3)沉淀溶于含胰蛋白酶1mg/mL，pH7.9的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，缓冲液和沉淀的质量比是10∶1；37℃水浴振荡，1000×g离心分离30min，弃去沉淀，得上清液；(4)上清液经30000×g离心分离10min，沉淀用蒸馏水离心洗涤，再用乙醇、乙醚脱水干燥或冷干，得到肽聚糖。
上述技术方案优选条件如下所述的步骤(1)所述的生理盐水是质量分数0.9％NaCl，离心洗涤次数为3次；所述的步骤(2)沸水浴的时间是30min，所述的沉淀蒸馏水用离心洗涤次数为3次；所述的步骤(3)37℃水浴振荡时间是3h；所述的步骤(4)得到的沉淀用蒸馏水离心洗涤的次数是2次。
本发明通过废物利用，变废为宝，实现了肽聚糖的低成本高产率的制备方法。
具体实施例方式
以下的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。
实施例1收集味精发酵废水菌体蛋白(菌落糊)1000mL，4000×g离心30min得菌体沉淀，用含质量分数0.9％NaCl的生理盐水离心洗涤3次得湿菌体230克，将菌体悬浮在8％的三氯乙酸溶液中，控制1∶10稀释液的浓度是620nm波长下光密度值为0.8，沸水浴30min，冷却，5000×g离心10min，得沉淀，蒸馏水离心洗涤3次。沉淀溶于0.1mol/L含胰蛋白酶1mg/mL，pH7.9的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(把0.2mol/L NaH2PO4溶液70mL和0.2mol/L Na2HPO4溶液930mL两液混合后用蒸馏水稀释定容至2000mL)中，缓冲液和沉淀的质量比是10∶1。37℃水浴振荡3h，1000×g离心30min，弃去沉淀。上清液经30000×g离心10min，沉淀用蒸馏水离心洗涤2次，沉淀用乙醇、乙醚脱水干燥，得到肽聚糖13.5克。
实施例2将实施例1得到的产物通过经6mol/L HCL 105℃水解24h后，用氨基酸分析仪测定，得到产物中肽聚糖的含量是57.41％；加入0.5mL 2mol/L NaOH溶液，37℃水解30min，离心取上清液用Bradford法测定蛋白质含量，得到产物中蛋白质含量是6.38％±0.57％；采用改进的Reissig等(1955)的方法，测得产物中N-乙酰葡糖胺的含量是1.180±0.103μmol/mg；采用Barker和Summerson法(1941)，测得产物中N-乙酰胞壁酸的含量是1.142±0.175μmol/mg。
实施例3测定实施例1中得到菌体和肽聚糖(PG)氨基酸组成及含量，结果见表1。
表1本发明中菌体及PG氨基酸组成及含量
权利要求
1.一种肽聚糖的制备方法，其特征是由以下步骤组成(1)收集味精发酵废水，4000×g离心30min得菌体沉淀，用生理盐水离心洗涤；(2)将菌体悬浮在质量分数8％的三氯乙酸溶液中，控制1∶10稀释液的浓度在620nm波长下光密度值为0.78～0.82的范围内，沸水浴后冷却，5000×g离心10min得沉淀，沉淀用蒸馏水离心洗涤；(3)沉淀溶于含胰蛋白酶1mg/mL，pH7.9的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，缓冲液和沉淀的质量比是10∶1，37℃水浴振荡，1000×g离心分离30min，弃去沉淀，得上清液；(4)上清液经30000×g离心分离10min，沉淀用蒸馏水离心洗涤，再用乙醇、乙醚脱水干燥或冷干，得到肽聚糖。
2.根据权利要求1所述的一种肽聚糖的制备方法，其特征是步骤(1)所述的生理盐水是质量分数0.9％NaCl，离心洗涤次数为3次。
3.根据权利要求1所述的一种肽聚糖的制备方法，其特征是步骤(2)所述的沸水浴的时间是30min，所述的沉淀用蒸馏水离心洗涤次数为3次。
4.根据权利要求1所述的一种肽聚糖的制备方法，其特征是步骤(3)所述的37℃水浴的振荡时间是3h。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的一种肽聚糖的制备方法，其特征是步骤(4)得到的沉淀用蒸馏水离心洗涤的次数是2次。
全文摘要
本发明涉及一种肽聚糖的制备方法，其特征是通过离心分离出味精发酵废水中的谷氨酸棒杆菌，然后将菌体悬浮在质量分数8％的三氯乙酸溶液中得到沉淀，沉淀再溶于含胰蛋白酶1mg/mL，pH7.9的0.1mol/L磷酸盐缓冲液并通过1000×g离心分离将其中的未分解的菌体及杂质分离，得到的上清液用30000×g离心分离，得到的沉淀用蒸馏水离心洗涤，再用乙醇、乙醚脱水干燥或冷干即得产品。本发明通过废物利用，变废为宝，实现了肽聚糖的低成本高产率的制备方法。
文档编号C12P21/00GK1699589SQ20051003430
公开日2005年11月23日 申请日期2005年4月22日 优先权日2005年4月22日
发明者许国焕, 吴月嫦, 陶家发 申请人:广东省微生物研究所