专利名称：一种高效分离纯化脂肪酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种高效分离纯化脂肪酶的方法。本发明尤其涉及一种从微生物深层发酵液中直接分离纯化脂肪酶。该方法具有分离纯化步骤少、收得率高、纯度高、成本低等优点。
背景技术：
从微生物深层发酵液中分离纯化酶的常用方法有(1)沉淀分离通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出，达到与其他溶质分离。沉淀分离的方法有很多种，诸如盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、复合沉淀、选择性变性沉淀等。沉淀分离纯化酶的收得率高，一般在80％以上，但纯度较低，一般在30-50％之间。
(2)层析分离利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数等)的不同，使各组分在两相中的分布程度不同而达到分离。层析分离中一个相是固定的，称为固定相，另一相是流动的，称为流动相。当流动相经过固定相时，各组分的移动速度不同，从而使不同的组分分离纯化。常用的有吸附层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等。层析分离方法分离纯化酶的收得率低，一般在15-40％之间，纯度在60％以上。
亲和层析是利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术。酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶之间都是具有专一而可逆的亲和力的分子对。在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液(流动相)中的另一方分子进行亲和层析。亲和层析具有较强的选择性，因此，分离纯化酶纯度高。但由于固相亲和层析吸附剂的空间位阻作用，吸附容量低，制备亲和层析柱价格高，所以只有较少的酶使用这一方法。该法分离纯化酶的收得率一般在15-50％之间，纯度在90％以上。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效分离纯化脂肪酶的方法。此法克服了常用分离纯化方法中，在酶的纯度提高的前提下，而收得率降低的问题。应用此种方法可较方便、大量地制备亲和层析吸附剂。此种吸附剂有别于亲和层析中所采用的固相吸附剂，而是采用液相吸附剂，后者是不溶于水的油相，便于直接从发酵液中分离纯化脂肪酶。
在达到上述目的中，根据本发明提供了一种高效分离纯化脂肪酶的方法。此法利用脂肪酶作用的底物——植物油作为亲和层析吸附剂，先将其乳化，然后直接添加到发酵液中。由于油不溶于水，从而利用管式离心机，进行油-水-固三相分离。由于脂肪酶与其底物——植物油有较强的亲和力，在离心分离时，大部分脂肪酶被吸附在油相中，脂肪酶可通过硫酸铵沉淀出来。
在本说明书中所采用的植物油是指豆油、橄榄油、棕榈油、花生油、玉米油等，用聚乙烯醇(PVA，聚合度1750±50)作乳化剂，在高速匀浆机中，充分乳化，制得植物油乳化液。
根据本发明方法，将植物油乳化液加入到发酵液中，混合均匀，脂肪酶便与植物油乳化液亲和吸附。植物油乳化液在发酵液中的浓度为7-15％。发酵液温度为10-30℃，pH5.0-7.0.在发酵罐或螺旋式搅拌机中，将反应混合物进行混合，搅拌转速60-200转/分，搅拌时间10-30分钟，然后静置1-3小时，反应混合物经管式离心机分离成油-水-固三相，此时，大部分脂肪酶被吸附在油相中，后者加30-50％的饱和硫酸铵溶液，将脂肪酶沉淀出来，通过管式离心机收集沉淀。
植物油在使用前要充分乳化，先配制3％的聚乙烯醇(PVA，聚合度1750±50)，将3份该溶液加入到1份植物油中，在高速匀浆机中，8,000-10,000转/分，分两次处理，共处理6分钟，制成比较稳定的25％植物油乳化液。
具体实施例方式
制备植物油乳化液。先将聚乙烯醇(PVA，聚合度1750±50)加入到烧开的自来水中，搅拌，直到全部溶解，冷却后，用玻璃纤维或少许棉过滤，配成3％溶液。将3份该溶液加入到1份植物油中，在高速匀浆机中，8,000-10,000转/分，分两次处理，共处理6分钟，制成比较稳定的25％植物油乳化液。控制好发酵液的温度、pH，添加合适的植物油乳化液，在发酵罐或螺旋式搅拌机中混合，然后静置一段时间，反应物混合物经管式离心机分离成油-水-固三相，大部分脂肪酶被吸附在油相中。在油相中加30-50％的饱和硫酸铵溶液，将脂肪酶沉淀出来。通过管式离心机收集沉淀。
下列实例将进一步说明本发明。
实施例1制备25％的豆油乳液。取豆油1.88kg，3％PVA5.63kg，在高速匀浆机中，8,000-10,000转/分，分两次处理，其处理6分钟，调节100L发酵液的pH为6.3，控制温度25℃，将豆油乳化液7.51kg加入到100L发酵液中，搅拌转速100转/分，搅拌时间15分钟，然后静置1.5小时。反应混合物经管式离心机分离成油-水-固三相，在油相中添加35％的饱和硫酸铵溶液，沉淀用管式离心机收集。脂肪酶的纯度达82.5％，收得率达73.2％实施例2按所述的相同步骤重复进行实施例1，但将豆油改成橄榄油，发酵罐温度控制在15℃，搅拌完后，静止时间3小时。脂肪酶的纯度达85.1％，收得率达71.4％。
实施例3按所述的相同步骤重复进行实施例1，但将豆油改成玉米油，发酵罐温度控制在20℃，发酵液pH改为5.0，搅拌完后，静置时间2小时。脂肪酶的纯度达83.3％，收得率达72.5％。
权利要求
1.一种高效分离纯化脂肪酶的方法，包括将植物油乳化液加入到pH5.0-7.0、温度10-30℃的发酵液中，进行亲和吸附反应。
2.按照权利要求1的方法，其中所述植物油包括豆油、橄榄油、棕榈油、花生油、玉米油等可用作脂肪酶产生的诱导物。
3.按照权利要求1的方法，其中所述植物油乳化液，是用3％聚乙烯醇(PVA，聚合度1750±50)作乳化剂，将3份该液加入到1份植物油中，在高速匀浆机中，8,000-10,000转/分，分两次处理，共处理6分钟，制成比较稳定的25％植物油乳化液。
4.按照权利要求1的方法，其中所述植物油乳化液在发酵液中的添加比例为7-15％。
5.按照权利要求1的方法，其中所述植物油乳化液在添加后要搅拌均匀。
6.按照权利要求5的方法，其中所述搅拌是在发酵罐或螺旋式搅拌器中，搅拌转速60-200转/分下进行的。
7.按照权利要求5的方法，搅拌时间为10-30分钟。
8.按照权利要求7的方法，在搅拌后，发酵液要静置1-3小时。
9.按照权利要求8的方法，在静置后，反应混合物经管式离心机分离成油—水—固三相。
10.按照权利要求9的方法，取油相，并将30-50％的饱和硫酸铵溶液加入其中，通过管式离心机收集沉淀。
全文摘要
本发明公开了一种高效分离纯化脂肪酶的方法。此法包括制备植物油乳化液，并将该乳化液添加到适宜的温度、pH的发酵液中，搅拌后静止一段时间，反应混合物经管式离心机分离成油—水—固三相，此时，大部分脂肪酶被吸附在油相中，后者加一定饱和度的硫酸铵溶液，将脂肪酶沉淀出来。通过管式离心机收集沉淀。沉淀经真空干燥即成脂肪酶制剂。整个分离纯化过程脂肪酶纯度可达80％以上，收得率可达70％以上。
文档编号C12N9/18GK1854292SQ20051003412
公开日2006年11月1日 申请日期2005年4月18日 优先权日2005年4月18日
发明者邓开健, 何倩松 申请人:广州市开恒生物科技有限公司