专利名称：一种抗醛糖还原酶蛋白单克隆抗体的制备与鉴定方法
技术领域：
本发明是一种单克隆抗体的制备与鉴定方法，属于生物工程肝癌辅助诊断试剂的技术领域。
背景技术：
1960年HERS首先在精囊和胎盘组织中分离出醛糖还原酶“AR”，70年代以来，许多科研工作者已经在不同组织分离和纯化出醛糖还原酶，这些组织包括神经、肌肉、肾脏、脑组织、晶体等。AR属于醛—酮还原酶家族，其辅酶是辅酶II(NADPH)，AR在体内呈单体存在，人AR含有315个氨基酸，大约36KD。来自不同哺乳动物的AR有80％以上的氨基酸顺序相同，这种序列的保守性提示这种蛋白质可能在细胞中起着重要的生理作用。AR生理功能还不是很清楚，但很多研究表明AR在糖尿病并发症的发生与发展中起着关键作用。近年来，相关研究发现在动脉粥样硬化(As)过程中，AR也起着非常重要的作用。一些研究还发现AR基因在大鼠原发性肝癌中高水平地表达。另有报道证明，一种从大鼠肝细胞瘤中诱导表达被称为spot17的蛋白，其部分序列与大鼠AR有高度的同源性。这些都提示在快速生长的癌细胞中，AR参与了有毒代谢产物的解毒作用。曹德良博士等，发现了一个新的基因，其编码的蛋白氨基酸序列与AR具有71％的同源性，被他们称为醛糖还原酶相似蛋白“ARL-1”。AR及ARL-1与人类原发性肝癌的关系是近年来发展的一个新课题。曹德良博士等研究发现29％的原发性肝癌组织高表达AR，ARL-1在54％的原发性肝癌组织中呈高水平表达，而在正常肝组织中，AR及ARL基因表达极低或不表达。由于AR及ARL-1具有还原各种醛及醛类衍生物的作用，而很多致肝癌的化学物质和抗肝癌的化疗药物均含有活性醛基，因此，AR及ARL-1与肝癌的发生发展及其抗药性之间可能存在某种关系。
我们以往研究中，用抗ARL-1多克隆抗体，在大多数肝癌患者检测到ARL-1抗原，在很多AFP阴性的肝癌患者能检测到ARL-1抗原；有些AFP阳性的非肝癌患者，如怀孕早期、生殖腺胚胎瘤等，ARL-1阴性；在健康成人检测不到ARL-1抗原。提示ARL-1蛋白有潜在的肝癌诊断价值。由于多克隆抗体特异性差，存在交叉反应，因此本室制备了抗ARL-1单克隆抗体。有报道ARL-1高表达的肝癌组织AR不表达，AR高表达的肝癌组织ARL-1不表达，单纯用抗ARL-1单克隆抗体则会漏检高表达AR的肝癌患者。
迄今为止，未报道过联合利用抗AR单克隆抗体和抗ARL-1单克隆抗体诊断肝癌，所报道的AR单克隆抗体也均未分析其识别AR抗原的部位。
发明内容
技术问题本发明目的在于提供一种抗醛糖还原酶蛋白单克隆抗体的制备与鉴定方法；该方法产生的抗AR单克隆抗体分别高度特异抗AR抗原的不同区段；产生的抗AR单克隆抗体可以作为一种新的肝癌早期诊断辅助试剂联合应用抗AR单克隆抗体和抗ARL-1单克隆抗体，可能找到一个新的、特异性高的肝癌早期诊断指标，将有助于肝癌的早期诊断，从而提高肝癌的生存率，改善其预后。
技术方案为了明确AR及ARL-1在肝癌中的作用，我们用本室表达纯化的AR的重组蛋白GST-AR作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，制备了高特异性的抗AR单克隆抗体，并与本室制备的抗醛糖还原酶相似蛋白(aldosereductase-like protein，ARL-1)单克隆抗体的特性进行比较。为更好地分析AR蛋白的功能，本发明方法分析了所制备的AR单克隆抗体识别AR抗原的部位。
抗醛糖还原酶单克隆抗体的制备方法为①从正常人胎盘组织提取总RNA；②根据已知AR序列，并使用“clustalx、antheprot”软件得到AR的抗原性分区、以及AR与醛糖还原酶相似蛋白“ARL-1”的序列比对同源性分区，针对AR全长、以及分别命名为dAR、dA1、dA2、dA3、dA4的五段截短部分设计六对引物，上游引物均含EcoR I酶切位点gc gaa ttc，下游引物均含NotI酶切位点gc ggc cgc；③通过逆转录聚合酶链式反应“RT-PCR”获得AR全长及dAR、dA1、dA2、dA3、dA4五段截短基因；④采用基因重组手段，将以上获得的AR全长及dAR、dA1、dA2、dA3、dA4五段截短基因，共六段基因分别插入表达载体pGEX-4T-1(His)6C，将重组质粒转化入E.coli Rosetta，诱导表达AR全长及截短蛋白，获得GST-AR蛋白及GST-dAR、GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4截短蛋白；⑤采用杂交瘤技术制备抗AR单克隆抗体将纯化的全长醛糖还原酶蛋白-谷光甘肽转移酶“GST-AR”重组蛋白免疫“Balb/c”小鼠，制备脾细胞悬液，在聚乙二醇“PEG”作用下与处于对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，将融合细胞培养于含次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶“HAT”的培养基；利用纯化的GST-AR蛋白包被酶标板，同时GST包被酶标板作为对照，根据方阵滴定结果，AR按1∶5000包被，GST按1∶3000包被，包被量均为100ng/孔；将待测的每一个杂交瘤集落孔的培养上清同时等量加入包被GST-AR和包被GST的酶标板孔，同时在GST-AR和GST包被系统分别设三孔为对照，一孔加新鲜细胞培养液作为空白对照，另一孔在新鲜细胞培养液中加入1ul免疫小鼠的血清作为阳性对照(P)，还有一孔在新鲜细胞培养液中加入1ul正常小鼠的血清作为阴性对照(N)，采用间接酶联免疫吸附实验“ELISA”法进行检测，TMB底物显色，测定OD450值；P/N≥2.1，表示包被系统有效，GST-AR阳性(P1)，同时GST阴性(N1)，P1/N1≥2.1者为阳性，阳性对应的原细胞培养孔用有限稀释法亚克隆2～3次，至100％培养孔阳性，扩大培养，建立稳定分泌抗AR蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，获得三株能稳定分泌抗AR单克隆抗体的细胞株，分别命名为ARB3、AR7B3G4、ARF10；将细胞培养在含20％新生牛血清“FCS”的RPMI1640培养液中，收集细胞培养上清，纯化上清得到三株抗醛糖还原酶单克隆抗体。
采用的逆转录聚合酶链式反应“RT-PCR”的逆转录“RT”体系及过程为在20ul总反应体系中加入10ul胎盘总RNA，2.5ul OligdT，混匀，70℃变性10m，迅速冰浴5m加入4ul 5*MMLV Buffer、0.5ul RNASEin、2ul 10mMdNTP、1ulMMLV，混匀，42℃ 50m，得到逆转录产物；采用的PCR体系为在25ul PCR总反应体系中加入2.5ul 10*Taq DNA聚合酶Buffer、2ul 25mM MgCl2、2ul2.5mM dNTP，2ul逆转录产物，0.3ul TaqDNA聚合酶，0.5ul 10pM上游特异引物，0.5ul 10pM下游特异引物，15.2ul水，PCR程序为94℃ 4m；95℃ 25s，58℃ 20s，72℃ 20s；72℃ 8m；4℃保温。
用clustalx、antheprot软件对AR与ARL-1进行序列比对，得到两者同源性分布区段图，采用基因重组方法诱导表达AR“第80～142氨基酸位置”与ARL-1差异较大的一段蛋白GST-dAR，并用clustalx、antheprot软件得到了AR的抗原性分布区段，将AR分为四段，采用同样基因重组方法诱导表达AR四段截短蛋白GST-dA1“AR第1～79氨基酸位置”、GST-dA2“AR第80～99氨基酸位置”、GST-dA3“AR第111～142氨基酸位置”、GST-dA4“AR第143～316氨基酸位置”，利用AR全长及截短蛋白、采用间接ELISA法、Western blot法，以筛选特异性强的抗AR单抗，并分析制备的抗AR单克隆抗体识别AR抗原的部位。
抗醛糖还原酶单克隆抗体的鉴定方法为①细胞上清McAb的效价测定将纯化的抗AR单克隆抗体用1×PBS按1∶200开始连续倍比稀释，采用间接ELISA法测定OD450，能与靶抗原发生免疫反应的单抗最大稀释度即为其效价；②McAb的Ig亚类测定采用Boehringer Mannheim公司小鼠Ig亚型测定试剂盒“Mouse McAb Isotyping test Kit”的亚类检测试纸进行测定；③McAb特异性鉴定以及识别AR抗原区段分析采用免疫印迹法“Western blot”检测，选择GST-AR、GST-dAR、GST-ARL、GST纯化蛋白，GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4诱导表达蛋白、表达菌株E.coli Rosetta的蛋白，及正常人胎盘组织蛋白，与制备的单克隆抗体进行反应GST-AR、GST-dAR、GST-ARL、GST纯化蛋白经BCA蛋白定量试剂盒测定，蛋白浓度分别为6mg/ml，3mg/ml，5mg/ml，2mg/ml，用1*PBS均稀释成1mg/ml。收集表达GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4蛋白的菌液及Rosetta菌液，10000转/分，离心1分钟，用1*PBS重悬；各样品加入1/4体积的4×上样缓冲液，煮沸5分钟；纯化蛋白取1μl“蛋白总量0.75ug”，菌液蛋白及组织蛋白分别取15ul，进行10％SDS-PAGE电泳；将蛋白转移到PVDF膜上，10％的脱脂奶粉4℃封闭过夜；分别用本发明产生的单克隆抗体“一抗，1∶5000稀释”和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG“二抗，1∶5000稀释”室温下孵育1小时，最后用ECL底物显色。
经鉴定，由纯化ARB3、AR7B3G4、ARF10细胞株的培养上清而得到的三株抗AR单克隆抗体，Ig亚类均为IgG1，轻链属于κ型；均抗GST-AR，并与胎盘组织中的AR蛋白反应，而与GST-ARL、GST、表达菌液蛋白无交叉反应；ARB3分泌的单克隆抗体还抗GST-dA1蛋白、AR7B3G4分泌的单克隆抗体还抗GST-dA3蛋白，ARF10分泌的单克隆抗体还抗GST-dA4蛋白；上述单克隆抗体均特异性抗AR蛋白，ARB3分泌的单克隆抗体识别AR第1～79个氨基酸位置，AR7B3G4分泌的单克隆抗体识别AR第111～142个氨基酸位置，ARF10分泌的单克隆抗体识别AR第143～316个氨基酸位置。
具体制备工艺为1.人胎盘组织总RNA的提取取正常人新鲜胎盘组织按每50mg组织加入1ml Trizol，冰浴状态下匀浆，冰上静置5min。每1ml Trizol试剂加入0.2ml氯仿，剧烈震荡，冰上静置3min，13000rpm，4℃离心15min，取上清，按每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，冰上静置10min，13000rpm，4℃离心10min。沉淀用75％乙醇洗涤，10000rpm 4℃离心5m，弃上清，控干。用适量DEPC水溶解RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)根据GenbankTMNM 001628已知AR序列，并利用clustalx、antheprot软件得到AR的抗原性分区、以及AR与醛糖还原酶相似蛋白“ARL-1”的序列比对同源性分区，再针对AR全长、以及分别命名为dAR、dA1、dA2、dA3、dA4的五段截短部分，设计六对引物，上游引物均含EcoR I酶切位点gc gaa ttc，下游引物均含Not I酶切位点gc ggc cgc。取0.5ml离心管，在20ul总反应体系中加入10ul胎盘总RNA，2.5ul OligdT，混匀，70℃变性10m，迅速冰浴5min加入4ul 5*MMLV Buffer、0.5ul RNASEin、2ul 10mMdNTP、1ul MMLV，混匀，42℃50m。取0.2ml PCR反应管，在25ul PCR总反应体系中加入2.5ul 10*TaqBuffer、2ul 25mM MgCl2、2ul 2.5mM dNTP，2ul逆转录产物，0.3ul Taq聚合酶，0.5ul 10pM AR上游特异引物5’-gc gaa ttc gca agc cgt ctc ctg ctc-3’，下游特异引物5’-gc ggc cgc tca aaa ctc ttc atg gaa ggg-3’，扩增AR基因；以上游特异引物5’-gc gaa ttc tgc acg tac cat gag aag-3’，下游特异引物5’-gc ggc cgc cgc ccacgt gtc cag aat-3’扩增dAR；以上游引物5’-gc gaa ttc gca agc cgt ctc ctg ctc-3’，下游引物5’-gc ggc cgc cca cag ctt gct gac gat-3’扩增dA1；以上游引物5’-gc gaattc tgc acg tac cat gag aag-3’，下游引物5’-gc ggc cgc cag gtc gct gag tgt ctt-3’扩增dA2；以上游引物5’-gc gaa ttc tgg ccg act ggc ttt aag-3’，下游引物5’-gc ggc cgccgc cca cgt gtc cag aat-3’扩增dA3；以上游引物5’-gc gaa ttc gcc atg gaa gag ctggtg-3’，下游引物5’-gc ggc cgc tca aaa ctc ttc atg gaa ggg-3’扩增dA4。PCR程序为94℃ 4m；95℃ 25s，58℃ 20s，72℃ 20s；72℃ 8m；4℃保温。PCR产物用1～1.5％琼脂糖胶电泳分离，溴化乙锭(EB)染色，用紫外检测仪观察结果。
3.pGEX-4T-1(His)6C-AR、pGEX-4T-1(His)6C-dAR、pGEX-4T-1(His)6C-dA1、pGEX-4T-1(His)6C-dA2、pGEX-4T-1(His)6C-dA3、及pGEX-4T-1(His)6C-dA4重组质粒的构建利用EcoR I、Not I酶切位点分别将AR、dAR、dA1、dA2、dA3、dA4的PCR产物插入质粒pGEX-4T-1(His)6C，构建pGEX-4T-1(His)6C-AR、pGEX-4T-1(His)6C-dAR、pGEX-4T-1(His)6C-dA1、pGEX-4T-1(His)6C-dA2、pGEX-4T-1(His)6C-dA3、及pGEX-4T-1(His)6C-dA4重组质粒。采用的酶切体系为20ul总反应体系中加入12ul水，2ul 10×O+Buffer(MBI)，5U(0.5ul)EcoRI(MBI)，5U(0.5ul)Not I(MBI)，20ug(5ul)质粒DNA或PCR产物，混匀，37℃水浴4h，也可过夜，利用申能博彩胶回收试剂盒按说明书操作回收纯化酶切产物，进行连接。采用的连接体系为20ul总反应体系中加入4ul水，2ul 10×T4 DNA连接酶Buffer，3ul质粒载体酶切纯化产物，10ulPCR酶切纯化产物，1ulT4 DNA连接酶，16℃过夜。经酶切、PCR、测序等手段证明以上重组质粒插入子正确。
4.GST-AR、GST-dAR蛋白表达与纯化，GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4蛋白的诱导表达将重组质粒转化进宿主菌E.coli Rosetta，细菌在含氨苄青霉素(80ug/ml)和氯霉素(34ug/ml)的LB培养基里培养至A600＝0.4，加IPTG 0.1mM，26℃过夜诱导表达GST-AR蛋白，26℃4.5h诱导表达GST-dAR，收集细菌，1*PBS重悬，高压破碎，离心(12000g，4℃)收集上清，过滤，采用Pharmacia Biotech公司的Glutathione sepharose 4B柱，按说明书操作，纯化GST-AR及GST-dAR蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定GST-AR蛋白浓度为6mg/ml，GST-dAR浓度为3mg/ml。采用同样重组蛋白表达方法，37℃3h诱导表达GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4蛋白。
5.用杂交瘤技术制备抗AR单克隆抗体纯化的重组蛋白GST-AR、弗氏完全佐剂、生理盐水按体积比10∶440∶450混合乳化，免疫Balb/c小鼠，GST-AR剂量为60μg/只，每只小鼠腹腔注射0.45ml，三周后加强免疫一次，剂量相同，佐剂改为弗氏不完全佐剂，三周后加强免疫第二次，佐剂为弗氏不完全佐剂，三周后60ug纯GST-AR抗原溶于生理盐水，每只注射0.45ml，不加佐剂。末次免疫第四天融合，融合当日摘取小鼠眼球采血，分离收集血清作为阳性对照。制备GST-AR免疫小鼠的脾细胞悬液，在聚乙二醇(PEG)作用下与处于对数生长期的Sp/20骨髓瘤细胞按3～20∶1的细胞数之比进行融合，将融合细胞培养于含次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶(HAT)的培养基中采用间接ELISA法筛检抗体。用GST-AR重组蛋白包被酶标板，同时GST包被酶标板作为对照，根据方阵滴定结果，AR按1∶5000包被，GST按1∶3000包被，包被量均为100ng/孔。检测时，将待测的每一个杂交瘤集落孔的培养上清同时等量加入包被GST-AR和包被GST的酶标板孔，同时在GST-AR和GST包被系统分别设三孔为对照，一孔加新鲜细胞培养液作为空白对照，一孔在新鲜细胞培养液中加入1ul免疫小鼠的血清作为阳性对照(P)，一孔在新鲜细胞培养液中加入1ul正常小鼠的血清作为阴性对照(N)。间接ELISA法检测，TMB底物显色，测定OD450值。P/N≥2.1，表示包被系统有效，GST-AR阳性(P1)，同时GST阴性(N1)，P1/N1≥2.1者为阳性，阳性对应的原细胞培养孔用有限稀释法亚克隆2～3次，至100％培养孔阳性，扩大培养，建立稳定分泌抗AR蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，将细胞培养在含20％新生牛血清“FCS”的RPMI1640培养液中，收集细胞培养上清，采用Millipore公司抗体纯化试剂盒按说明纯化上清得到抗体。
6.抗AR单克隆抗体的特性鉴定①细胞上清McAb的效价测定将纯化的抗AR单克隆抗体用1×PBS按1∶200开始连续倍比稀释，采用间接ELISA法测定OD450，能与靶抗原发生免疫反应的单抗最大稀释度即为其效价。
②McAb的Ig亚类测定采用Boehringer Mannheim公司小鼠Ig亚型测定试剂盒(Mouse McAb Isotyping test Kit)的亚类检测试纸进行测定。
③McAb特异性鉴定以及识别AR抗原区段分析采用免疫印迹法(Westernblot)检测。选择GST-AR、GST-dAR、GST-ARL、GST纯化蛋白，GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4诱导表达蛋白、表达菌株E.coli Rosetta的蛋白，及正常人胎盘组织蛋白与制备的单克隆抗体进行反应GST-AR、GST-dAR、GST-ARL、GST纯化蛋白经BCA蛋白定量试剂盒测定，蛋白浓度分别为6mg/ml，3mg/ml，5mg/ml，2mg/ml，用1*PBS均稀释成1mg/ml。收集表达GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4蛋白的菌液及Rosetta菌液，10000转/分，离心1分钟，用1*PBS重悬。各样品加入1/4体积的4×上样缓冲液，煮沸5分钟。纯化蛋白取1μl(蛋白总量0.75ug)，菌液蛋白取15ul进行10％SDS-PAGE电泳。将蛋白转移到PVDF膜上，10％的脱脂奶粉4℃封闭过夜。分别用本发明产生的单克隆抗体(一抗，1∶5000稀释)和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(二抗，1∶5000稀释)室温下孵育1小时，最后用ECL底物显色。
已知的AR序列可在网上查到进入National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)站点，网址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/，在Search栏选择“Nucleotide”，在for栏输入基因银行GenbankTM中AR的序列号NM 001628，即可查得已公布的AR序列。
clustalx和antheprot软件可上网下载安装可在google搜索引擎输入“clustalx软件”或“antheprot软件”关键词，进入搜索到的站点下载安装，例如，Clustalx软件可在搜到的“clustalX 1.81汉化版-全方位下载{WWW.FIXDOWN.COM}”站点下载，网址http//www.fixdown.com/soft/22125.htm；antheprot可在搜到的“生物谷ANTHEPROT生物医学软件下载”站点下载，网址http//www.bioon.com/Soft/Class1/Class9/200408/79.asp。下载安装后根据软件提供的帮助说明进行操作，即可得到AR的抗原性分区图和AR与抗醛糖还原酶相似蛋白“ARL-1”的序列比对同源性分区图。
六对引物分别为①For ARUp5’-gc gaa ttc gca agc cgt ctc ctg ctc-3’Down5’-gc ggc cgc tca aaa ctc ttc atg gaa ggg-3’②For dARUp5’-gc gaa ttc tgc acg tac cat gag aag-3’Down5’-gc ggc cgc cgc cca cgt gtc cag aat-3’③For dA1
Up5’-gc gaa ttc gca agc cgt ctc ctg ctc-3’Down5’-gc ggc cgc cca cag ctt gct gac gat-3’④For dA2Up5’-gc gaa ttc tgc acg tac cat gag aag-3’Down5’-gc ggc cgc cag gtc gct gag tgt ctt-3’⑤For dA3Up5’-gc gaa ttc tgg ccg act ggc ttt aag-3’Down5’-gc ggc cgc cgc cca cgt gtc cag aat-3’⑥For dA4Up5’-gc gaa ttc gcc atg gaa gag ctg gtg-3’Down5’-gc ggc cgc tca aaa ctc ttc atg gaa ggg-3’有益效果①本发明提供了一种抗醛糖还原酶蛋白单克隆抗体的制备与鉴定方法。②通过本发明方法产生三株稳定分泌抗AR蛋白不同区段的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，分别命名为ARB3、AR7B3G4、ARF10。经鉴定，该三株细胞分泌的抗AR单克隆抗体的Ig亚类均为IgG1，轻链属于κ型；均抗GST-AR，并与胎盘组织中的AR蛋白反应，而与GST-ARL、GST蛋白无交叉反应。ARB3分泌的单克隆抗体还抗GST-dA1蛋白、AR7B3G4分泌的单克隆抗体还抗GST-dA3蛋白、ARF10分泌的单克隆抗体还抗GST-dA4蛋白。说明上述单克隆抗体均特异性抗AR蛋白，ARB3分泌的单克隆抗体识别AR第1～79个氨基酸位置，AR7B3G4分泌的单克隆抗体识别AR第111～142个氨基酸位置，ARF10分泌的单克隆抗体识别AR第143～3l6个氨基酸位置。③本发明方法产生的识别AR不同区段的抗AR单克隆抗体，有利于更好地分析AR蛋白的功能；④联合应用抗AR单克隆抗体和抗ARL-1单克隆抗体，可能找到一个新的、特异性高的肝癌早期诊断指标，将有助于肝癌的早期诊断，从而提高肝癌的生存率，改善其预后。
具体实施例方式
抗人AR蛋白单克隆抗体的制备与鉴定1.人胎盘组织总RNA的提取取正常人新鲜胎盘组织按每50mg组织加入1ml Trizol，冰浴状态下匀浆，
冰上静置5min。每1ml Trizol试剂加入0.2ml氯仿，剧烈震荡，冰上静置3min，13000rpm，4℃离心15min，取上清，按每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，冰上静置10min，13000rpm，4℃离心10min。沉淀用75％乙醇洗涤，10000rpm 4℃离心5m，弃上清，控干。用适量DEPC水溶解RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)根据GenbankTMNM 001628已知AR序列，并利用clustalx、antheprot软件得到AR的抗原性分区、以及AR与醛糖还原酶相似蛋白“ARL-1”的序列比对同源性分区，再针对AR全长、以及分别命名为dAR、dA1、dA2、dA3、dA4的五段截短部分，设计六对引物，上游引物均含EcoR I酶切位点gc gaa ttc，下游引物均含Not I酶切位点gc ggc cgc。取0.5ml离心管，在20ul总反应体系中加入10ul胎盘总RNA，2.5ul OligdT，混匀，70℃变性10m，迅速冰浴5min加入4ul 5*MMLV Buffer、0.5ul RNASEin、2ul 10mMdNTP、1ul MMLV，混匀，42℃50m。取0.2ml PCR反应管，在25ul PCR总反应体系中加入2.5ul 10*TaqBuffer、2ul 25mM MgCl2、2ul 2.5mM dNTP，2ul逆转录产物，0.3ul Taq聚合酶，0.5ul 10pMAR上游特异引物5’-gc gaa ttc gca agc cgt ctc ctg ctc-3’，下游特异引物5’-gc ggc cgc tca aaa ctc atc atg gaa ggg-3’，扩增AR基因；以上游特异引物5’-gc gaa ttc tgc acg tac cat gag aag-3’，下游特异引物5’-gc ggc cgc cgc ccacgt gtc cag aat-3’扩增dAR；以上游引物5’-gc gaa ttc gca agc cgt ctc ctg ctc-3’，下游引物5’-gc ggc cgc cca cag ctt gct gac gat-3’扩增dA1；以上游引物5’-gc gaattc tgc acg tac cat gag aag-3’，下游引物5’-gc ggc cgc cag gtc gct gag tgt ctt-3’扩增dA2；以上游引物5’-gc gaa ttc tgg ccg act ggc ttt aag-3’，下游引物5’-gc ggc cgccgc cca cgt gtc cag aat-3’扩增dA3；以上游引物5’-gc gaa ttc gcc atg gaa gag ctggtg-3’，下游引物5’-gc ggc cgc tca aaa ctc ttc atg gaa ggg-3’扩增dA4。PCR程序为94℃ 4m；95℃ 25s，58℃ 20s，72℃ 20s；72℃ 8m；4℃保温。
PCR产物用1～1.5％琼脂糖胶电泳分离，溴化乙锭(EB)染色，用紫外检测仪观察结果。
3.pGEX-4T-1(His)6C-AR、pGEX-4T-1(His)6C-dAR、pGEX4T-1(His)6C-dA1、pGEX-4T-1(His)6C-dA2、pGEX-4T-1(His)6C-dA3、及pGEX-4T-1(His)6C-dA4重组质粒的构建
利用EcoR I、Not I酶切位点分别将AR、dAR、dA1、dA2、dA3、dA4的PCR产物插入质粒pGEX-4T-1(His)6C，构建pGEX4T-1(His)6C-AR、pGEX-4T-1(His)6C-dAR、pGEX-4T-1(His)6C-dA1、pGEX-4T-1(His)6C-dA2、pGEX-4T-1(His)6C-dA3、及pGEX-4T-1(His)6C-dA4重组质粒。采用的酶切体系为20ul总反应体系中加入12ul水，2ul 10×O+Buffer(MBI)，5U(0.5ul)EcoRI(MBI)，5U(0.5ul)Not I(MBI)，20ug(5ul)质粒DNA或PCR产物，混匀，37℃水浴4h，也可过夜，利用申能博彩胶回收试剂盒按说明书操作回收纯化酶切产物，进行连接。采用的连接体系为20ul总反应体系中加入4ul水，2ul 10×T4 DNA连接酶Buffer，3ul质粒载体酶切纯化产物，10ulPCR酶切纯化产物，1ulT4 DNA连接酶，16℃过夜。经酶切、PCR、测序等手段证明以上重组质粒插入子正确。
4.GST-AR、GST-dAR蛋白表达与纯化，GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4蛋白的诱导表达将重组质粒转化进宿主菌E.coli Rosetta，细菌在含氨苄青霉素(80ug/ml)和氯霉素(34ug/ml)的LB培养基里培养至A600＝0.4，加IPTG 0.1mM，26℃过夜诱导表达GST-AR蛋白，26℃ 4.5h诱导表达GST-dAR，收集细菌，1*PBS重悬，高压破碎，离心(12000g，4℃)收集上清，过滤，采用Pharmacia Biotech公司的Glutathione sepharose 4B柱，按说明书操作，纯化GST-AR及GST-dAR蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定GST-AR蛋白浓度为6mg/ml，GST-dAR浓度为3mg/ml。采用同样重组蛋白表达方法，37℃3h诱导表达GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4蛋白。
5.用杂交瘤技术制备抗AR单克隆抗体纯化的重组蛋白GST-AR、弗氏完全佐剂、生理盐水按体积比10∶440∶450混合乳化，免疫Balb/c小鼠，GST-AR剂量为60μg/只，每只小鼠腹腔注射0.45ml，三周后加强免疫一次，剂量相同，佐剂改为弗氏不完全佐剂，三周后加强免疫第二次，佐剂为弗氏不完全佐剂，三周后60ug纯GST-AR抗原溶于生理盐水，每只注射0.45ml，不加佐剂。末次免疫第四天融合，融合当日摘取小鼠眼球采血，分离收集血清作为阳性对照。制备GST-AR免疫小鼠的脾细胞悬液，在聚乙二醇(PEG)作用下与处于对数生长期的Sp/20骨髓瘤细胞按3～20∶1的细胞数之比进行融合，将融合细胞培养于含次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶(HAT)的培养基中采用间接ELISA法筛检抗体。用GST-AR重组蛋白包被酶标板，同时GST包被酶标板作为对照，根据方阵滴定结果，AR按1∶5000包被，GST按1∶3000包被，包被量均为100ng/孔。检测时，将待测的每一个杂交瘤集落孔的培养上清同时等量加入包被GST-AR和包被GST的酶标板孔，同时在GST-AR和GST包被系统分别设三孔为对照，一孔加新鲜细胞培养液作为空白对照，一孔在新鲜细胞培养液中加入1ul免疫小鼠的血清作为阳性对照(P)，一孔在新鲜细胞培养液中加入1ul正常小鼠的血清作为阴性对照(N)。间接ELISA法检测，TMB底物显色，测定OD450值。P/N≥2.1，表示包被系统有效，GST-AR阳性(P1)，同时GST阴性(N1)，P1/N1≥2.1者为阳性，阳性对应的原细胞培养孔用有限稀释法亚克隆2～3次，至100％培养孔阳性，扩大培养，建立稳定分泌抗AR蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，将细胞培养在含20％新生牛血清“FCS”的RPMI1640培养液中，收集细胞培养上清，采用Millipore公司抗体纯化试剂盒按说明纯化上清得到抗体。
所得细胞系命名为AR7B3G4。将细胞培养在含20％新生牛血清“FCS”的RPMI1640培养液中，收集细胞培养上清，采用Millipore公司试剂盒按说明纯化上清得到抗体。
6.抗AR单克隆抗体的特性鉴定①细胞上清McAb的效价测定将纯化的抗AR单克隆抗体用1×PBS按1∶200开始连续倍比稀释，采用间接ELISA法测定OD450，能与靶抗原发生免疫反应的单抗最大稀释度即为其效价。经测定AR7B3G4细胞株分泌的单克隆抗体的效价为1∶1×104。
②McAb的Ig亚类测定采用Boehringer Mannheim公司小鼠Ig亚型测定试剂盒(Mouse McAb Isotyping test Kit)的亚类检测试纸进行测定。AR7B3G4细胞株分泌的单克隆抗体为IgG1，轻链属于κ型。
③McAb特异性鉴定以及识别AR抗原区段分析采用免疫印迹法(Westernblot)检测。选择GST-AR、GST-dAR、GST-ARL、GST纯化蛋白，GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4诱导表达蛋白、表达菌株E.coli Rosetta的蛋白，及正常人胎盘组织蛋白与制备的单克隆抗体进行反应GST-AR、GST-dAR、GST-ARL、GST纯化蛋白经BCA蛋白定量试剂盒测定，蛋白浓度分别为6mg/ml，3mg/ml，5mg/ml，2mg/ml，用1*PBS均稀释成1mg/ml。收集表达GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4蛋白的菌液及Rosetta菌液，10000转/分，离心1分钟，用1*PBS重悬。各样品加入1/4体积的4×上样缓冲液，煮沸5分钟。纯化蛋白取1μl(蛋白总量0.75ug)，菌液蛋白取15ul进行10％SDS-PAGE电泳。将蛋白转移到PVDF膜上，10％的脱脂奶粉4℃封闭过夜。分别用本发明产生的单克隆抗体(一抗，1∶5000稀释)和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(二抗，1∶5000稀释)室温下孵育1小时，最后用ECL底物显色。经鉴定AR7B3G4分泌的单克隆抗体抗GST-AR、GST-dAR、GST-dA3、胎盘组织蛋白，不抗GST-ARL、GST、GST-dA1、GST-dA2、GST-dA4蛋白，说明该单克隆抗体特异性抗AR蛋白，且识别AR抗原第111～142个氨基酸位置。
权利要求
1.一种抗醛糖还原酶“AR”单克隆抗体的制备方法，其特征在于该方法为①从正常人胎盘组织提取总RNA；②根据已知AR序列，并使用“clustalx、antheprot”软件得到AR的抗原性分区、以及AR与醛糖还原酶相似蛋白“ARL-1”的序列比对同源性分区，针对AR全长、以及分别命名为dAR、dA1、dA2、dA3、dA4的五段截短部分设计六对引物，上游引物均含EcoR I酶切位点gc gaa ttc，下游引物均含NotI酶切位点gc ggc cgc；③通过逆转录聚合酶链式反应“RT-PCR”获得AR全长及dAR、dA1、dA2、dA3、dA4五段截短基因；④采用基因重组手段，将以上获得的AR全长及dAR、dA1、dA2、dA3、dA4五段截短基因，共六段基因分别插入表达载体pGEX-4T-1(His)6C，将重组质粒转化入E.coli Rosetta，诱导表达AR全长及截短蛋白，获得GST-AR蛋白及GST-dAR、GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4截短蛋白；⑤采用杂交瘤技术制备抗AR单克隆抗体将纯化的全长醛糖还原酶蛋白—谷光甘肽转移酶“GST-AR”重组蛋白免疫“Balb/c”小鼠，制备脾细胞悬液，在聚乙二醇“PEG”作用下与处于对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，将融合细胞培养于含次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶“HAT”的培养基；利用纯化的GST-AR蛋白包被酶标板，同时GST包被酶标板作为对照，根据方阵滴定结果，AR按1∶5000包被，GST按1∶3000包被，包被量均为100ng/孔；将待测的每一个杂交瘤集落孔的培养上清同时等量加入包被GST-AR和包被GST的酶标板孔，同时在GST-AR和GST包被系统分别设三孔为对照，一孔加新鲜细胞培养液作为空白对照，另一孔在新鲜细胞培养液中加入1ul免疫小鼠的血清作为阳性对照(P)，还有一孔在新鲜细胞培养液中加入1ul正常小鼠的血清作为阴性对照(N)，采用间接酶联免疫吸附实验“ELISA”法进行检测，TMB底物显色，测定OD450值；P/N≥2.1，表示包被系统有效，GST-AR阳性(P1)，同时GST阴性(N1)，P1/N1≥2.1者为阳性，阳性对应的原细胞培养孔用有限稀释法亚克隆2～3次，至100％培养孔阳性，扩大培养，建立稳定分泌抗AR蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，获得三株能稳定分泌抗AR单克隆抗体的细胞株，分别命名为ARB3、AR7B3G4、ARF10；将细胞培养在含20％新生牛血清“FCS”的RPMI1640培养液中，收集细胞培养上清，纯化上清得到三株抗醛糖还原酶单克隆抗体。
2..根据权利要求1所述的抗醛糖还原酶单克隆抗体的制备方法，其特征在于采用的逆转录聚合酶链式反应“RT-PCR”的逆转录“RT”体系及过程为在20ul总反应体系中加入10ul胎盘总RNA，2.5ul OligdT，混匀，70℃变性10m，迅速冰浴5m加入4ul 5*MMLV Buffer、0.5ul RNASEin、2ul 10mMdNTP、1ulMMLV，混匀，42℃50m，得到逆转录产物；采用的PCR体系为在25ul PCR总反应体系中加入2.5ul 10*Taq DNA聚合酶Buffer、2ul 25mM MgCl2、2ul2.5mM dNTP，2ul逆转录产物，0.3ul TaqDNA聚合酶，0.5ul 10pM上游特异引物，0.5ul 10pM下游特异引物，15.2ul水，PCR程序为94℃4m；95℃25s，58℃20s，72℃20s；72℃8m；4℃保温。
3.根据权利要求1所述的抗醛糖还原酶单克隆抗体的制备方法，其特征在于用clustalx、antheprot软件对AR与ARL-1进行序列比对，得到两者同源性分布区段图，采用基因重组方法诱导表达AR“第80～142氨基酸位置”与ARL-1差异较大的一段蛋白GST-dAR，并用clustalx、antheprot软件得到了AR的抗原性分布区段，将AR分为四段，采用同样基因重组方法诱导表达AR四段截短蛋白GST-dA1“AR第1～79氨基酸位置”、GST-dA2“AR第80～99氨基酸位置”、GST-dA3“AR第111～142氨基酸位置”、GST-dA4“AR第143～316氨基酸位置”，利用AR全长及截短蛋白、采用间接ELISA法、Western blot法，以筛选特异性强的抗AR单抗，并分析制备的抗AR单克隆抗体识别AR抗原的部位。
4.一种用于权利要求1所述的抗醛糖还原酶单克隆抗体的鉴定方法，其特征在于抗AR单克隆抗体(McAb)的特性鉴定方法为①细胞上清McAb的效价测定将纯化的抗AR单克隆抗体用1×PBS按1∶200开始连续倍比稀释，采用间接ELISA法测定OD450值，能与靶抗原发生免疫反应的单抗最大稀释度即为其效价；②McAb的Ig亚类测定采用Boehringer Mannheim公司小鼠Ig亚型测定试剂盒“Mouse McAb Isotyping test Kit”的亚类检测试纸进行测定；③McAb特异性鉴定以及识别AR抗原区段分析采用免疫印迹法“Western blot”检测，选择GST-AR、GST-dAR、GST-ARL、GST纯化蛋白，GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4诱导表达蛋白、表达菌株E.coli Rosetta的蛋白，及正常人胎盘组织蛋白，与制备的单克隆抗体进行反应GST-AR、GST-dAR、GST-ARL、GST纯化蛋白经BCA蛋白定量试剂盒测定，蛋白浓度分别为6mg/ml，3mg/ml，5mg/ml，2mg/ml，用1*PBS均稀释成1mg/ml。收集表达GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4蛋白的菌液及Rosetta菌液，10000转/分，离心1分钟，用1*PBS重悬；各样品加入1/4体积的4×上样缓冲液，煮沸5分钟；纯化蛋白取1μl“蛋白总量0.75ug”，菌液蛋白及组织蛋白分别取15ul，进行10％SDS-PAGE电泳；将蛋白转移到PVDF膜上，10％的脱脂奶粉4℃封闭过夜；分别用本发明产生的单克隆抗体“一抗，1∶5000稀释”和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG“二抗，1∶5000稀释”室温下孵育1小时，最后用ECL底物显色。
全文摘要
抗醛糖还原酶蛋白“AR”单克隆抗体的制备与鉴定方法产生的抗AR单克隆抗体分别高度特异抗AR抗原的不同区段；产生的抗AR单克隆抗体可以作为一种新的肝癌早期诊断辅助试剂联合应用抗AR单克隆抗体和抗醛糖还原酶相似蛋白“ARL－1”单克隆抗体，可能找到一个新的、特异性高的肝癌早期诊断指标，将有助于肝癌的早期诊断，从而提高肝癌的生存率，改善其预后。经鉴定，由纯化ARB3、AR7B3G4、ARF10细胞株的培养上清而得到的三株抗AR单克隆抗体，Ig亚类均为IgG1，轻链属于κ型；均抗GST－AR，并与胎盘组织中的AR蛋白反应，且分别识别AR第1～79氨基酸、第111～142氨基酸、第143～316氨基酸位置，而与GST－ARL、GST、表达菌液蛋白无交叉反应。
文档编号C12N15/13GK1693461SQ20051003906
公开日2005年11月9日 申请日期2005年4月26日 优先权日2005年4月26日
发明者谢维, 马达, 金俊飞, 张建琼 申请人:东南大学