专利名称：固固态发酵苹果渣生产饲料蛋白的方法
技术领域：
本发明属于苹果渣发酵生产菌体曲子和饲料蛋白的方法。
背景技术：
通常所言饲料蛋白(Feeding protein)即单细胞蛋白(Single cell protein，SCP)，又称微生物蛋白或菌体蛋白，是指酵母菌、真菌、霉菌、及非病性细菌等单细胞生物体内所含蛋白质，含量高达45％-74％，且各种氨基酸搭配合理、种类齐全，维生素和微量元素丰富，不含胆固醇等，这些优点都是一般农作物饲料所不能比拟的。
中国是世界上最大的苹果产地，年产量2200多万吨，比世界总产量的三分之一还多。陕西省又是我国最大的苹果生产基地，目前全省苹果种植总面积达602万亩，年总产量550多万吨，居全国第一位。从上世纪90年代以来，全国大量引进苹果浓缩汁加工生产线，仅陕西省就有二十多条，2003年生产苹果浓缩汁达30万吨，几乎占到世界贸易总量的三分之一，出口三十多个国家和地区，成为全国最大的苹果浓缩汁集中产区。在生产大量浓缩果汁的同时，每年仅陕西就要排放60多万吨的苹果渣。除少量晒干后，作为简单饲料添加利用外，绝大部分因为水分含量高，蛋白含量低，没有营养价值，极易腐烂发臭，无法全部利用而被遗弃。特别是水果加工旺季，果汁加工厂周围，渣皮堆积如山，经微生物分解，酸臭难闻，不但严重污染环境，而且造成巨大纤维素和半纤维素资源的浪费。
利用果渣生产蛋白饲料是一条废物利用的良好途径，当前利用(果渣)纤维素资源转化为蛋白饲料的研究比较多。Joshi，VK(Bioresourcetechnology.1996，56，251-255)、Rahmat，H(World journal of microbiology &biotechnology.1995，11(2)168-170)、Roussos，S.(Advances in solid-statefermentation.1997257-271)、Sandhu，D.K(Journal of Scientific & IndustrialResearch.1997，(56)286-90)等，以及张玉臻(食品与发酵工业，1996，329-32)、籍保平(生物工程进展，1999，19(5)30-33)、张长霞(山东食品发酵，2003，420-22)、高再兴(西北大学学报，2003，33(6)701-704)、李巨秀(西北农林科技大学学报，2003，31(增)79-81)、常显波(西北农林科技大学学报(自然科学版)32(1)40-46)、张乃锋(农业新技术，2004，246-47)、王艳华(中国饲料，2004，835-35)、罗雯(科学技术与工程，2004，4(5)371-374)等分别报道了他们利用筛选的单菌种或混合菌种，采用单独固态发酵法以苹果渣为主要原料发酵生产饲料蛋白的研究。由于初始培养基成分、采用菌种以及单独固态发酵工艺参数的不同，因此产物的蛋白含量不尽相同，从15％到35％均有报道。苹果渣发酵生产饲料蛋白的过程是“氮素”的浓缩过程，例如发酵原料从20％的粗蛋白含量发酵到40％的含量，就需要一半质量的碳水化合物在发酵过程中变成H2O和CO2。同时由于微生物的生长环境的客观要求，蛋白含量不可能太高，蛋白含量在此没有可比性。同时，对于发酵时间的选取也不尽相同，一般在48-108h之间。如中国专利申请03127919.8公开了一种苹果渣双菌发酵制备饲料蛋白的方法，其发酵时间也长达48-72h。总体考虑，单独固态发酵法存在种子培养基消耗多、接种量大、设备应用相对较多及发酵时间较长等不足，从经济角度而言，投资与生产成本较高，对于生产饲料蛋白这种附加值较低的产品，工业化生产难于实施，目前仍处于实验研究和初步产业化阶段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简单、设备使用少、投资低、产品营养价值高、生产成本低、适合工业化生产和中、小养殖场及果农进行自给生产的固固态发酵苹果渣生产饲料蛋白的方法。克服现有单独固态发酵生产饲料蛋白种子培养基用量多，菌种液态培养复杂，设备复杂，投资和生产成本较高的不足。
本发明的另一个目的在于提供一种苹果渣菌体曲子的生产方法，以便于中、小型养殖场与果农进行自给生产。
苹果渣发酵生产菌体曲子的方法(1)首先将粉碎的苹果渣配料成固态发酵培养基A，接入培养成熟的混合菌种进行固态发酵；(2)然后将发酵产物低温快速干燥得到苹果渣菌体曲子产品。
固态发酵参数为种子接种量8-20mL/100g底物 料层厚度3-4.5cm发酵时间48-54h发酵温度30-34℃。
低温快速干燥条件为干燥时间24-36h干燥温度32-36℃。
固态发酵培养基A中成分及含量为苹果渣65％-75％，麸皮15％-20％，棉子饼5％-10％，尿素1％-3％，(NH4)2SO41％-2％，KH2PO41％-2％，然后加水调节初始含水量为60％-75％。
混合菌种组成及其体积混合比是产朊假丝酵母∶果酒酵母∶绿色木霉＝(4-5.5)∶(1.5-3)∶(2-4)。
苹果渣发酵生产饲料蛋白的方法(1)首先将粉碎的苹果渣配料成固态发酵培养基A，接入培养成熟的混合菌种进行固态发酵；(2)然后将发酵产物低温快速干燥；(3)最后将上述干燥后产品接入固态发酵培养基B中再次进行固态发酵，即得苹果渣饲料蛋白产品。
一次固态发酵参数为种子接种量8-20mL/100g底物料层厚度3-4.5cm发酵时间48-54h 发酵温度30-34℃二次固态发酵参数为转接量4％-6％(g/g) 料层厚度3-5.5cm发酵温度30-34℃ 发酵时间72-96h。
低温快速干燥条件为干燥时间24-36h 干燥温度32-36℃。
固态发酵培养基A中成分及含量为苹果渣65％-75％，麸皮15％-20％，棉子饼5％-10％，尿素1％-3％，(NH4)2SO41％-2％，KH2PO41％-2％，然后加水调节初始含水量为60％-75％。
苹果渣固态发酵培养基B中成分及含量为苹果渣75％-85％，麸皮10％-20％，尿素2％-4％，(NH4)2SO41％-3％，KH2PO42％-4％，然后加水调节初始含水量为50％-75％。
混合菌种组成及其体积混合比是产朊假丝酵母∶果酒酵母∶绿色木霉＝(4-5.5)∶(1.5-3)∶(2-4)。
与单独固态发酵相比较，本方法的主要优点1、发酵过程中不需要大型发酵罐进行液态培养，生产工艺相对简单，投资与生产费用也相对较低。
2、菌种以固态形式(菌体曲子)接入下一步固态培养体系，不仅用量较少，而且贮藏运输方便，菌种不易死亡。而液态发酵菌种培养成熟后，需要在较短时间内进行下一步发酵生产，不然容易造成菌种的死亡和自溶且液态培养基用量大，运输贮藏不便。
3、生产的菌体曲子，既可以作为进一步生产发酵的菌种，又可以作为产品直接销售，供中小型养殖场或果农进行自给生产，使本发明方法便于推广应用，更利于彻底解决苹果渣处理的难题。
4、由于单位接种量较大，菌体生长迅速，发酵时间相对较短。
附图1为固固态发酵苹果渣生产饲料蛋白的工艺流程图。
具体实施例方式
实施例1饲料蛋白的生产种子培养基马铃薯(土豆)200g，蔗糖20g，水若干；其制作方法为将马铃薯切成小块，加适量的自来水沸煮20-30min，过滤，取滤液并加自来水至1000mL，加入20g蔗糖，溶解并混合均匀。
种子菌种的培养取300mL种子培养基置入500mL锥形瓶并在121℃下灭菌20min，冷却室温后接入斜面菌种，在空气浴摇床30-32℃下，120-140rpm培养36-54h，得到培养成熟的种子菌种。
固态发酵培养基A组成为苹果渣65％，麸皮21％，棉子饼10％，尿素2％，(NH4)2SO41％，KH2PO41％，加水调节初始含水量为60％。
接入的混合菌种及比例产朊假丝酵母∶果酒酵母∶绿色木霉＝4∶2∶3。
固态培养基B组成为干苹果渣74％，麸皮20％，尿素2％，(NH4)2SO42％，KH2PO42％，加水调节初始含水量为65％。
鲜湿苹果渣经过热风干燥箱75℃干燥并粉碎过24目筛后制成固态发酵培养基A，然后按15mL/100底物的量接入种子培养成熟的混合菌种，在32℃下，固态发酵48h后将固态发酵物转移入快速干燥箱，34℃干燥30h，再以6％的量转接入固态发酵培养基B中，32℃、不灭菌、料层厚度4.5cm条件下，固态培养84h后取出发酵样品，经干燥、造粒、包装即得到苹果渣饲料蛋白产品。
对比的单独固态发酵实验鲜湿苹果渣经过热风干燥箱75℃干燥并粉碎后配料成固态发酵培养基，其组成为干苹果渣74％，麸皮20％，尿素2％，(NH4)2SO42％，KH2PO42％。按10mL/100底物的量接入种子培养成熟的混合菌种(混合比例产朊假丝酵母∶果酒酵母∶绿色木霉＝4∶2∶3。)，初始含水量65％，料层厚度4.5cm，不灭菌条件下，32℃固态培养96h后取出发酵样品，经干燥造粒、包装即得到苹果渣饲料蛋白产品。
进行上述两种不同发酵形式的产品主要成分、微量元素和氨基酸组成测定结果如表1、表2和表3所示表1主要成分含量(％)
表2微量元素含量(mg/kg)
表2氨基酸含量(％)
测定方法粗蛋白的测定采用国标GB/T6432-86，即微量凯氏定氮法。
真蛋白的测定采用改进的微量凯氏定氮法——称取固态发酵产物5g，用40mL 75％乙醇浸提24h，充分搅拌，抽滤，滤渣再用40mL 75％乙醇反复洗涤2次，以洗去无机氮和尿素，同时沉淀蛋白质。将沉淀于65℃下干燥至恒重，准确称取1g左右进行硝化，再用微量凯氏定氮法测定，即上述国标GB/T6432-86。
粗脂肪含量的测定采用国标GB/T6433-86，即索氏提抽法。
粗纤维含量的测定采用国标GB/T6434-86，即酸碱洗涤法。
灰分含量的测定采用国标GB/T6438-86，即化灰法。
氨基酸的测定由西北农林科技大学分析测试中心121-MB型氨基酸分析仪测定。
由上述测定结果可见，以苹果渣为主要原料，经混合菌种液固态发酵后，产物主要成分都发生明显变化，粗蛋白、真蛋白和粗脂肪含量分别提高了76.7％、165.6％和50.1％，而粗纤维则降低了36.63％，经17种必要的氨基酸测定分析，其含量急剧提高且丰富、齐全，尤其是对于禽畜生长十分重要的丝氨酸、赖氨酸、酪氨酸和精氨酸等分别比发酵原料提高了124.1％、322.1％、56.1％和84.6％，营养价值显著增加。
由微量元素的测定可知，有益元素含量丰富，而重金属元素含量符合同类饲料基料国家卫生标准要求(GB13078-91)。经权威部门农业部饲料质量监督检测中心(西安)检测发酵产品，沙门氏菌均未检出，黄曲霉毒素B1 0.0039mg/kg远远小于同类饲料基料如麸皮、玉米(0.05mg/kg)等国家饲料卫生标准(GB13078-91)的要求。经陕西省疾病预防控制中心进行毒理检验，产品属实际无毒级，可作为蛋白饲料广泛应用于养殖领域。
实施例2菌体曲子的生产种子菌种的培养与实施例1相同。
鲜湿苹果渣经过热风干燥箱75℃干燥并粉碎过24目筛后制成固态发酵培养基A(苹果渣70％，麸皮20％，棉子饼5％，尿素2％，(NH4)2SO41％，KH2PO42％，加水调节初始含水量为65％。)，然后按15mL/100底物的量接入种子培养成熟的混合菌种(产朊假丝酵母∶果酒酵母∶绿色木霉＝3.5∶1.5∶3)，在32℃下，固态发酵54h后将固态发酵物转移至快速干燥箱，34℃干燥30h可得苹果渣菌体曲子。
权利要求
1.苹果渣发酵生产菌体曲子的方法，其特征在于(1)首先将粉碎的苹果渣配料成固态发酵培养基A，接入培养成熟的混合菌种进行固态发酵；(2)然后将发酵产物低温快速干燥得到苹果渣菌体曲子产品。
2.根据权利要求1所述的苹果渣发酵生产菌体曲子的方法，其特征在于固态发酵参数为种子接种量8-20mL/100g底物料层厚度3-4.5cm发酵时间48-54h发酵温度30-34℃。
3.根据权利要求1所述的苹果渣发酵生产菌体曲子的方法，其特征在于低温快速干燥条件为干燥时间24-36h干燥温度32-36℃。
4.根据权利要求1所述的苹果渣发酵生产菌体曲子的方法，其特征在于固态发酵培养基A中成分及含量为苹果渣65％-75％，麸皮15％-20％，棉子饼5％-10％，尿素1％-3％，(NH4)2SO41％-2％，KH2PO41％-2％，然后加水调节初始含水量为60％-75％。
5.根据权利要求1-4任意之一所述的苹果渣发酵生产菌体曲子的方法，其特征在于混合菌种组成及其体积混合比是产朊假丝酵母∶果酒酵母∶绿色木霉＝(4-5.5)∶(1.5-3)∶(2-4)。
6.固固态发酵苹果渣生产饲料蛋白的方法，其特征在于(1)首先将粉碎的苹果渣配料成固态发酵培养基A，接入培养成熟的混合菌种进行固态发酵；(2)然后将发酵产物低温快速干燥；(3)最后将上述干燥后产品接入固态发酵培养基B中再次进行固态发酵，即得苹果渣饲料蛋白产品。
7.根据权利要求6所述的固固态发酵苹果渣生产饲料蛋白的方法，其特征在于一次固态发酵参数为种子接种量8-20mL/100g底物料层厚度3-4.5cm发酵时间48-54h发酵温度30-34℃二次固态发酵参数为转接量4％-6％(g/g)料层厚度3-5.5cm发酵温度30-34℃发酵时间72-96h。
8.根据权利要求6所述的固固态发酵苹果渣生产饲料蛋白的方法，其特征在于固态发酵培养基A中成分及含量为苹果渣65％-75％，麸皮15％-20％，棉子饼5％-10％，尿素1％-3％，(NH4)2SO41％-2％，KH2PO41％-2％，然后加水调节初始含水量为60％-75％。
9.根据权利要求6所述的固固态发酵苹果渣生产饲料蛋白的方法，其特征在于苹果渣固态发酵培养基B中成分及含量为苹果渣75％-85％，麸皮10％-20％，尿素2％-4％，(NH4)2SO41％-3％，KH2PO42％-4％，然后加水调节初始含水量为50％-75％。
10.根据权利要求6-9任意之一所述的固固态发酵苹果渣生产饲料蛋白的方法，其特征在于混合菌种组成及其体积混合比是产朊假丝酵母∶果酒酵母∶绿色木霉＝(4-5.5)∶(1.5-3)∶(2-4)。
全文摘要
本发明公开了一种固固态发酵苹果渣生产饲料蛋白的方法。其生产工艺过程如下首先将粉碎的苹果渣配料成固态发酵培养基A，接入培养成熟的混合菌种进行固态发酵；然后将发酵产物低温快速干燥；最后将上述干燥后产品接入固态发酵培养基B中再次进行固态发酵，即得苹果渣饲料蛋白产品。与单独固态发酵相比较，该固固态发酵工艺生产过程中不需要大型发酵罐进行液态培养，生产工艺相对简单，投资与生产费用也相对较低。菌种以固态形式接入下一步固态培养体系，不仅用量较少，而且贮藏运输方便，菌种不易死亡。
文档编号C12N1/00GK1673343SQ20051004194
公开日2005年9月28日 申请日期2005年4月12日 优先权日2005年4月12日
发明者宋纪蓉, 徐抗震, 马海霞, 黄洁 申请人:西北大学