专利名称：一种永生化人骨髓基质干细胞系及其建立方法
技术领域：
本发明属于生物技术学科人类和哺乳动物细胞(组织)工程领域，涉及体外分离、纯化、鉴定、基因转染、永生化及多向诱导人骨髓基质干细胞，特别涉及一种永生化人骨髓基质干细胞系及其建立方法。
背景技术：
由于某种因素如外伤、感染、肿瘤等而使骨丧失了一些或一段骨质，形成较大的间隙，称为骨缺损，绝大多数骨缺损都难以愈合，最后形成骨不连。由于缺损间隙大，成骨细胞难以爬过间隙而不能发生正常的愈合过程，仅由纤维组织充填。为此，许多学者进行了相关的研究，取得了一些成绩，但是对于大段的骨缺损，仍然是矫形外科的难题。近年来，随着科学技术迅速发展，骨缺损的修复进入组织工程学修复研究时代的转变。种子细胞、支架材料、生长因子是组织工程的三要素。目前，作为骨组织工程的种子细胞有4种来源骨、骨外膜、骨髓和骨外组织。比较而言，骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Stem Cells，BMSCss)来源不受限，取材方便，对供体损伤小，易于分离培养，体外增殖能力强，大量传代培养后仍具有成骨能力，目前在临床骨缺损的修复中占有重要的地位。而且BMSCs作为其它非组织工程的种子细胞也具有广阔前景，许多实验证实BMSCs具有成体干细胞特性，表现为较强的增殖能力和向多种间充质细胞分化的潜能。不但在骨组织工程，在其他组织工程研究中也占有重要地位。
目前，对BMSCs及其在组织工程方面的研究虽已取得了很大的进展，但该领域的研究尚处于探索阶段，以下问题有待解决。
(1)对BMSCs本身特性的研究和在骨组织工程方面的利用研究，都希望利用纯的干细胞成分，但实验证明体外的BMSCs均为各种细胞的混杂。如何才能有效地获得纯的BMSCs，有待于对BMSCs的细胞学特点和分化各阶段细胞标志物的研究。
(2)BMSCs的增殖、分化的控制需要合适的条件。如何使既控制增殖，避免成肿瘤，又能在适当的时候启动沿所需路径的分化，还有待进一步研究。
(3)BMSCs间相互作用、与造血干细胞间相互作用、与不同成熟阶段的细胞的相互作用直接对其生长、分化产生影响，但目前这些作用的机制还不清楚。
(4)对BMSCs在各种力学条件下的改变还知之甚少，而BMSCs在骨髓中及用于骨组织工程显然要受到周围环境力的作用。对这方面的研究将促进对BMSCs全面了解和有效利用。
(5)BMSCs在体外培养存在细胞老化问题，并由此限制了可获得的细胞数量，无法达到组织工程的要求。
(6)目前的骨组织工程研究中，已证实BMSCs能与多种材料相容生长并在体内成骨。但这些材料自身的缺陷使得人们不断尝试使用新的载体材料。如何促进BMSCs与理想材料相容生长并成骨将是今后骨组织工程研究的重要方面。
综上所述，目前人骨髓基质干细胞还没有完全定性，它的的分离、纯化及扩增方法均处于探索中，获得的人骨髓基质干细胞鉴定结果也不尽一致，世界范围内还没有已建立人骨髓基质干细胞系的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种永生化人骨髓基质干细胞系及其建立方法，为研究人骨髓基质干细胞的生物学行为提供标准细胞系，为组织工程基础研究提供平台，为临床应用提供足量种子细胞，并为建立人骨髓基质干细胞系提供一种有效、可靠的方法。
本发明的技术方案是设计一种永生化人骨髓基质干细胞系，原代人骨髓基质干细胞来源于正常流产胎儿骨髓组织.其特征在于，该永生化人骨髓基质干细胞系体外培养能无限克隆，但不具备转化细胞或癌细胞的特征，在细胞生物学特征上是正常细胞，且具有多向分化潜能；具体包括1)形态特征 H.E染色，永生化人骨髓基质干细胞完全贴壁后呈纤维样或多角型，核多为圆形。电镜显示，细胞核质比大，线粒体、内质网等细胞器发达，属生长旺盛的成纤维样细胞；2)生长特性 细胞数较少时，可见典型的单克隆生长方式；当细胞生长至75％融合时，呈纤维样。生长曲线表明，细胞接种1～2天生长缓慢，3～5天进入对数生长期，细胞倍增时间为40.08小时。从细胞生长曲线及1年以上扩增细胞生长情况看，该细胞系为永生化人骨髓基质干细胞系；3)流式细胞分析特征 永生化人骨髓基质干细胞表达CD29，CD44，CD106，不表达CD14，CD34，CD45，HLA-DR分子。从mRNA和蛋白表达水平证实本研究获得的永生化人骨髓基质干细胞系并非造血细胞；4)染色体核型分析 传至112代的人骨髓基质干细胞染色体数目为2n＝46，其中，中部着丝粒染色体有5对，臂比值为1.33±0.02～1.07±0.03；亚中部着丝粒染色体有7对，臂比值为3.18±0.03～1.45±0.07；端部着丝粒染色体有6对，小染色体有4对，性染色体1对，染色体核型正常；
5)生物学特征 体外连续培养过程中，永生化人骨髓基质干细胞具有克隆形成能力，无裸鼠致瘤性，在软琼脂内不能生长，血清依赖性无显著降低，仍具有接触抑制性。不具备转化细胞或癌细胞的特征，是正常细胞；6)成体干细胞特征 永生化人骨髓基质干细胞可以定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞以及心肌细胞，具备成体干细胞的特性；所述的人骨髓基质干细胞的获取包括以下步骤1)分离培养原代人骨髓基质干细胞无菌采取6～8月龄正常流产胎儿双侧股骨、肱骨、胫骨骨髓，PBS冲洗髓腔；Percoll细胞分离液分离细胞，DMEM低糖培养基(DMEM-L)+10％Hyclone胎牛血清为基础培养液培养，获得原代呈成纤维样细胞。
2)纯化人骨髓基质干细胞0.25％胰酶消化原代细胞并传代，用有限稀释法获得纯化的单细胞克隆生长的人骨髓基质干细胞。
所述的永生化是通过导入外源性人端粒酶逆转录酶基因(Human telomerase reversetranscriptase，hTERT)激活端粒酶而得到的参考文献J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，等著。金冬雁，黎孟枫，等译。分子克隆实验指南。北京科学出版社。2002年，第三版1276-1282。采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCIneo-hTERT导入单克隆培养的人骨髓基质干细胞。在24孔板内利用脂质体LipofectAMINE 2000将pCIneo-hTERT导入BMSCs-2细胞，24小时后1∶10传代细胞，72小时后G418 200μg/mL加压筛选，10d后100μg/mL，20天左右出现明显抗性克隆。挑选27个克隆细胞扩大培养，其中8个克隆的细胞可以扩大至培养瓶内长期培养。体外连续培养3个月时，克隆3、8在培养中污染；克隆1、6、7细胞发生衰老死亡，可能是细胞仅渡过了细胞增长的M1期，延缓了衰老；克隆2、4、5生长良好，同时渡过了细胞增长的M1、M2期，得以永生化。3个克隆的细胞给予保存，克隆2继续培养，至今在体外已连续传代179PDs(Population doubles，细胞一分为二为一个PDs)，命名为MSCxj细胞系。
所述的经流式细胞仪检测，细胞表达CD29，CD44，CD106，不表达CD34，CD45，CD14，HLA-DR分子。
所述的具有成体干细胞特性经条件培养液诱导培养24天，可以分化为成骨、软骨、心肌样细胞。成骨诱导条件培养基基础培养基加地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C，终浓度分别为10-8mol/L，50mg/L，10mmol/L；软骨诱导条件培养基基础培养基加地塞米松、TGF-β、维生素C，终浓度分别为10-8mol/L，5ug/L，10mmol/L；心肌细胞诱导条件培养基基础培养基加3umol/L 5-氮胞苷。基础培养基DMEM-L+10％Hyclone胎牛血清。
所述的具备正常细胞的生物学特性是不具备以往导入病毒基因等所建立的细胞所特有的转化细胞的特征。比如，永生化人骨髓基质干细胞有克隆形成能力，不具备裸鼠致瘤性，无悬浮生长能力，具有血清依赖性，因此不具备转化细胞的特征，是正常细胞。
本发明特点如下1.永生化人骨髓基质干细胞系经多种方法鉴定，本发明分离、克隆、转染hTERT基因的永生化人骨髓基质干细胞系具有以下特征1.1形态特征 H.E染色如图1所示，永生化人骨髓基质干细胞完全贴壁后呈纤维样或多角型，核多为圆形。电镜显示如图2所示，细胞核质比大，线粒体、内质网等细胞器发达，属生长旺盛的成纤维样细胞。
1.2生长特性 细胞数较少时，可见典型的单克隆生长方式；当细胞生长至75％融合时，呈纤维样。生长曲线表明如图3所示，细胞接种1～2天生长缓慢，3～5天进入对数生长期，细胞倍增时间为40.08h。从细胞生长曲线及1年以上扩增细胞生长情况看，该细胞系为永生化人骨髓基质干细胞系。
1.3流式细胞分析特征 永生化人骨髓基质干细胞表达CD29，CD44，CD106，不表达CD34，CD45，CD14，HLA-DR分子如图4所示。从细胞表面特征分子分析证实本研究获得的永生化人骨髓基质干细胞系并非造血系细胞。
1.4染色体核型分析 传至112代的人骨髓基质干细胞染色体数目为2n＝46，其中，中部着丝粒染色体有5对，臂比值为1.33±0.02～1.07±0.03；亚中部着丝粒染色体有7对，臂比值为3.18±0.03～1.45±0.07；端部着丝粒染色体有6对，小染色体有4对，性染色体1对，染色体核型正常如图5所示。
1.5生物学特征 体外连续培养过程中，永生化人骨髓基质干细胞具有克隆形成能力，无裸鼠致瘤性，在软琼脂内不能生长，血清依赖性无显著降低，仍具有接触抑制性。不具备转化细胞的特征，具有正常二倍体细胞的生物学特征。如图6所示。
1.6成体干细胞的可塑性 永生化人骨髓基质干细胞可以定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞以及心肌细胞如图7、8、9、10所示，具备成体干细胞的特性。
2.建立人骨髓基质干细胞系的方法
2.1分离培养原代人骨髓基质干细胞无菌采取6～8月龄正常流产胎儿双侧股骨、肱骨、胫骨骨髓，PBS冲洗髓腔；Percoll细胞分离液分离细胞，DMEM低糖培养基(DMEM-L)+10％Hyclone胎牛血清为基础培养液培养，获得原代呈成纤维样细胞。
2.2纯化人骨髓基质干细胞0.25％胰酶消化原代细胞并传代，有限稀释法获得纯化的单细胞克隆生长的人骨髓基质干细胞。
2.3人骨髓基质干细胞表面标志检测经流式细胞仪检测，人骨髓基质干细胞表达CD29，CD44，CD106，不表达CD34，CD45，CD14，HLA-DR分子，表明培养细胞不是造血系细胞。
2.4人骨髓基质干细胞的成体干细胞特性经条件培养液诱导培养24天，可以分化为成骨、软骨、心肌样细胞。成骨诱导条件培养基基础培养基加地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C，终浓度分别为10-8mol/L，50mg/L，10mmol/L；软骨诱导条件培养基基础培养基加地塞米松、TGF-β、维生素C，终浓度分别为10-8mol/L，5ug/L，10mmol/L；心肌细胞诱导条件培养基基础培养基加3umol/L 5-氮胞苷。基础培养基DMEM-L+10％Hyclone胎牛血清。
2.5导入外源性hTERT激活端粒酶采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCIneo-hTERT导入单克隆培养的人骨髓基质干细胞。
1)取单细胞克隆培养的BMSCs第7代细胞接种24孔板，计数，每孔约1×105个细胞。
2)24～48小时后细胞长到80％时，用无血清、无抗生素的L-DMEM培养液洗涤细胞2次，每孔加该培养液0.5ml。
3)配制A液无血清、无抗生素L-DMEM 48μl加2μl LipofectAMINE 2000。
4)配制B液无血清、无抗生素L-DMEM 48μl加2μl(1μg)质粒pCIneo-hTERT。
5)B液配制好后，轻轻混匀，室温放置5分钟，与A液轻柔混匀，室温放置30分钟，以形成脂质体-DNA复合物。
6)将以上AB混合液缓慢滴加到细胞培养液中，边加边混匀。
7)常规条件下培养6小时后，更换为含10％胎牛血清的L-DMEM完全培养基。
8)24小时后1∶10传代。
72小时后用G418 200μg/mL加压筛选，10天后100μg/mL，20天左右出现明显抗性克隆。挑选27个克隆细胞扩大培养，其中8个克隆的细胞可以扩大至培养瓶内长期培养。体外连续培养3个月时，克隆3、8在培养中污染；克隆1、6、7细胞发生衰老死亡，可能是细胞仅渡过了细胞增长的M1期，延缓了衰老；克隆2、4、5生长良好，同时渡过了细胞增长的M1、M2期，得以永生化。3个克隆的细胞给予保存，克隆2继续培养，至今在体外已连续传代179PDs，命名为MSCxj细胞系。
2.6永生化人骨髓基质干细胞表面标志检测取第112代细胞经流式细胞仪检测，人骨髓基质干细胞表达CD29，CD59，CD116，不表达CD34，CD45，CD112，HLA-DR。
2.7永生化人骨髓基质干细胞的成体干细胞特性取第112代细胞，经诱导培养，人骨髓基质干细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞，具有成体干细胞的多向分化特征。软骨诱导条件培养基基础培养基加地塞米松、TGF-β、维生素C，终浓度分别为10-8mol/L，5ug/L，10mmol/L；成骨诱导条件培养基基础培养基加地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C，终浓度分别为10-8mol/L，50mg/L，10mmol/L；心肌细胞诱导条件培养基基础培养基加3umol/L 5-氮胞苷。
2.8永生化人骨髓基质干细胞的生物学特性取第112代细胞，永生化人骨髓基质干细胞进行克隆形成实验，裸鼠致瘤性实验，悬浮生长能力实验，血清依赖性实验，接触抑制实验。染色体核型析。结果显示细胞克隆形成率与转染前相似时，仍具有血清依赖性和接触抑止，不具备悬浮生长能力，在裸鼠皮下种植无致瘤性，染色体核型分析仍为二倍体，说明细胞具备正常细胞生物学行为，无转化细胞或癌细胞特征。
2.9永生化人骨髓基质干细胞的冷冻与复苏冷冻以40％DMEM-L培养基+10％DMSO+50％Hyclone胎牛血清为冷冻液冻存细胞，并将其分装于冷冻1.8mL冻存管。4℃条件30分钟，负80℃过夜，投入液氮保存冷冻。
解冻取出冷冻细胞管，迅速投入37℃水域中解冻。培养液清洗解冻细胞2遍，收集细胞。胎盘蓝染色检测，细胞成活率达89％以上。
采用以上分离、纯化、基因转染及冷冻保存的方法，已获得大量纯化的永生化人骨髓基质干细胞。目前稳定培养，已经传179PDs。这种永生化人骨髓基质干细胞系及其建立方法有效、可靠，为研究人骨髓基质干细胞的生物学行为提供标准细胞系，为组织工程基础研究提供平台，为临床应用提供足量种子细胞。
图1是永生化人骨髓间充质干细胞HE染色观察×20；图2.是永生化人骨髓基质干细胞超微结构SEM观察；图3是永生化人骨髓基质干细胞生长曲线和群体倍增时间(40.08h)；图4是永生化人骨髓基质干细胞MSCxj细胞表面分子检测；图5是永生化人骨髓基质干细胞染色体核型分析；图6是永生化人骨髓基质干细胞裸鼠致瘤性实验无肿瘤生长HEX100；图7是永生化人骨髓基质干细胞分化为成骨样细胞的检测第127PDs MSCxj成骨诱导24d成骨鉴定；图7a是成骨诱导24d HE×400；图7b是成骨诱导24d，ALP染色，钙-钴法×200；图7c是成骨诱导24d有I型胶原表达，免疫细胞化学SABC法，DAB显色×400；图7d是成骨诱导24d骨钙素表达，免疫荧光×200；图7e是成骨诱导24d钙结节形成，茜素红染色×40；图8是永生化人骨髓基质干细胞分化为软骨细胞的检测；图8-1是是永生化人骨髓基质干细胞成软骨诱导24d甲苯胺蓝染染色细胞成多角型×400；图8-2是永生化人骨髓基质干细胞成软骨诱导24d细胞表达II型胶原SABC DAB显色×200；图9a是是永生化人骨髓基质干细胞向心肌细胞诱导后细胞连接形成合胞体样结构生长，细胞变为短柱状，突起位于两端，相互连接(伊红染色×400)；图9b是是永生化人骨髓基质干细胞的细胞表达肌动蛋白免疫荧光×400；图10是永生化人骨髓基质干细胞向成骨、软骨、心肌细胞诱导后RT-PCR检测I型胶原、骨钙素、II型胶原、MLC-2V的mRNA表达(Mmark；C-阴性对照；1，2，3，4诱导第6，12，18，24d细胞mRNA表达；C+阳性对照)具体实施方式
1.建立人骨髓基质干细胞系1.1分离、克隆纯化原代人骨髓基质干细胞骨髓来源西京医院妇产科6-8月水囊引产胎儿，取胎儿双侧股骨、胫骨、肱骨，用完全培养基反复冲洗髓腔。吸取冲洗的培养液入离心管，250×g离心10分钟，弃去上清；用5mL完全培养基重悬细胞，然后沿管壁缓慢滴加入底部装有Percoll(比重1073g/L)分离液的离心管中，900×g离心30分钟，吸取界面云雾状白膜层，加入PBS混匀细胞，250×g离心10分钟，洗涤2遍，计数。以2×106接种于50ml培养瓶，6天后第一次换液，此后2～3天换液一次，细胞90％汇合时0.25％胰酶消化，1∶3传代，传代细胞90％汇合时0.25％胰酶消化，进行有限稀释法克隆培养1)消化液消化后制成单细胞悬液并计数。2)细胞计数后，以10倍等阶式稀释细胞悬液为103个/mL，将此细胞悬液100倍稀释即为10个细胞/ml，最后将10个细胞/ml的细胞悬液经2倍稀释，即为5细胞/ml。3)将稀释好的细胞悬液分别接种于96孔板中，每孔加液0.1ml。然后5％CO2，37℃条件下培养。4)两天后，倒置显微镜下观察培养板各孔细胞数，挑选只含一个细胞的孔，做好标记并补加0.1ml培养液，继续培养。5)培养期间，视培养液PH值的变化，决定是否更换培养液。细胞培养一周左右，孔中即形成较大克隆。待克隆长到70％融合时，用消化法分离克隆细胞，转种于24孔培养板、6孔板及培养瓶中培养扩大培养。6)共选取培养17个生长良好的成纤维样细胞克隆，将所有的单克隆细胞均扩大培养，并冻存。7)选取形态较好的克隆2、5的细胞进行鉴定和基因转染实验。
1.2人骨髓基质干细胞的鉴定1.2.1细胞表面标志检测取第6代细胞0.25％胰酶消化，离心，PBS洗涤收获细胞，计数调整细胞密度为1×106/mL，分别于CD14，CD29，CD34，CD44，CD45，CD106，HLA-DR单克隆抗体室温闭光反应30分钟，送流式细胞仪检测表面标记。
1.2.2人骨髓基质干细胞的成体干细胞特征1.2.2.1人骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化取生长良好的第6代细胞，更换培养液为成骨条件培养液培养，分别取诱导后6、12、18、24天细胞以2×105/mL接种于孔底预先铺好1cm2经过酸处理过的细胞玻璃爬片的24孔板，36小时细胞完全贴壁后，进行成骨细胞的鉴定，检测免疫细胞化学法检测I型胶原和骨钙素的表达钙-钴法检测碱性磷酸酶表达；茜素红染色检测钙结节1.2.2.2人骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化向软骨细胞诱导分化取生长良好的第6代细胞，更换培养液为成软骨条件培养液，分别取诱导后6、12、18、24天以2×105/ml接种于孔底预先铺好1cm2经过酸处理过的细胞玻璃爬片的24孔板，36小时细胞完全贴壁后，取出玻片40g/L多聚甲醛固定20分钟后作以下软骨细胞鉴定甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖的表达；免疫细胞化学法检测II型胶表达。
1.2.2.3人骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化向心肌细胞诱导分化取生长良好的第6代细胞，更换培养液为心肌细胞诱导条件培养液，分别取诱导后6、12、18、24天以2×105/ml接种于孔底预先铺好1cm2经过酸处理过的细胞玻璃爬片的24板，36小时细胞完全贴壁后，取出玻片40g/L多聚甲醛固定20分钟后作以下心肌细胞鉴定伊红染色观察细胞形态；免疫细胞化学法检测肌动蛋白表达。
1.2.2.4人骨髓基质干细胞向成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞诱导后mRNA水平的鉴定(RT-PCR检测)取3种诱导前和诱导后6、12、18、24天的细胞，成骨诱导检测I型胶原、骨钙素，成软骨诱导检测II型胶原，心肌细胞诱导检测心室肌特异性肌球蛋白轻链MLC-2V的mRNA表达RNA的提取细胞接种于35mm平皿，待长满约80％后，吸弃培养液，PBS洗涤细胞3次→加1ml Trizol，室温放置5分钟→吹打均匀，移入1.5ml离心管→加氯仿200μl，震荡15s混匀→室温孵育5分钟→4℃，12000rpm离心15分钟→吸取上层水样带，转移入另一离心管→加6/10体积异丙醇，混匀→4℃，12000rpm离心10分钟→弃上清，加75％乙醇1ml洗涤→4℃，7500rpm离心5分钟→弃上清，干燥5分钟，加无RNase水20μl重溶→加入RQ1 RNase-Free DNase以消化混杂的基因组DNA→参照文献颜子颖，王海林译.精编分子生物学实验指南。科学出版社，1998120-145。进行RNA的琼脂糖变性胶(1％)电泳分析，核酸蛋白分析仪进行浓度和纯度的测定。-70℃保存备用。
RT-PCR根据Gene Bank数据库人I型胶原、骨钙素、II型胶原、MLC-2V的mRNA序列，采用PCGENE软件设计PCR扩增的两条引物表1 RT-PCR引物设计(5’→3’)
RT-PCR，reverse transcription-polymerase chain reaction.
采用TitanTMOne Tube RT-PCR Kit进行RT-PCR。反应体系为2μl模板RNA，0.2mM dNTP，0.4μM引物，5mM DTT，10u RNasin，1.5mM MgCl2，1μl Enzyme Mix，加无菌双蒸水至50μl。RT-PCR参数50℃30分钟；94℃10s，56℃30s，68℃45s，10个循环；94℃10s，56℃30s，68℃2分钟，25个循环；68℃，7分钟。同时设空白对照和阴性对照(第3代人血管内皮细胞总RNA)。RT-PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳分析。
1.3基因转染和细胞培养取克隆培养生长良好的第5代细胞接种24孔板，每孔约1×105个细胞。待长到80％汇合时，按LipofectAMINE 2000转染试剂盒说明书，参考文献J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，等著。金冬雁，黎孟枫，等译。分子克隆实验指南。北京科学出版社。2002年，第三版1276-1282。进行pCIneo-hTERT的转染。
1)取单细胞克隆培养的BMSCs第7代细胞接种24孔板，计数，每孔约1×105个细胞。
2)24～48小时后细胞长到80％时，用无血清、无抗生素的L-DMEM培养液洗涤细胞2次，每孔加该培养液0.5ml。
3)配制A液无血清、无抗生素L-DMEM 48μl加2μl LipofectAMINE 2000。
4)配制B液无血清、无抗生素L-DMEM 48μl加2μl(1μg)质粒pCIneo-hTERT。
5)B液配制好后，轻轻混匀，室温放置5分钟，与A液轻柔混匀，室温放置30分钟，以形成脂质体-DNA复合物。
6)将以上AB混合液缓慢滴加到细胞培养液中，边加边混匀。
7)常规条件下培养6小时后，更换为含10％胎牛血清的L-DMEM完全培养基。
8)24小时后1∶10传代。
72小时后用G418 200μg/mL加压筛选，10天后100μg/mL，20天左右出现明显抗性克隆。挑选27个克隆细胞扩大培养，其中8个克隆的细胞可以扩大至培养瓶内长期培养。体外连续培养3个月时，克隆3、8在培养中污染；克隆1、6、7细胞发生衰老死亡，克隆2、4、5生长良好，给予保存，克隆2继续培养，至今在体外已连续传代179PDs，命名为MSCxj细胞系。
1.4永生化人骨髓基质干细胞的鉴定取第112代永生化人骨髓基质干细胞做实验对象，鉴定方法同1.2。
1.5永生化人骨髓基质干细胞的生物学特征1.5.1生长曲线和群体倍增时间将第112PDs的MSCxj按1×104/孔接种于24孔板，3～4天换液1次，每隔2天用0.25％胰蛋白酶消化细胞，血细胞计数板计数。每个时间点设3个平行孔，每个孔计数3次，取其平均值绘制细胞的生长曲线，并按以下公式计算群体倍增时间(population doubling time，PDT)PDT＝[log2/(logNt-loN0)]×t，其中N0和Nt分别代表接种时和培养t小时后的细胞数。
1.5.2染色体核型分析取对数生长期细胞，加秋水仙素至浓度0.4μg/ml，继续培养3小时。0.25％胰蛋白酶消化细胞，用无血清培养基洗涤细胞1次，200g离心5分钟，弃上清；75mmol/LKCl重悬细胞沉淀，室温放置8分钟。然后加入1滴甲醇/冰醋酸(3∶1)固定液，混匀后4℃离心，弃上清；加1ml固定液，4℃放置30分钟，重悬后4℃离心，弃上清；继续加入固定液，混匀离心。根据细胞沉淀加适量固定液，重悬后将细胞悬液滴加在洁净的玻片上，空气干燥，然后将玻片浸入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液中，30℃处理10～20分钟，系列甲醇脱水，Giemsa染色10分钟左右，常规脱水封片，光镜下观察。
1.5.3致瘤性收集第112代的细胞，调整细胞密度为1×107个/ml，于5周龄Balb/c nu-/nu-裸鼠背部皮下接种细胞悬液0.2ml，定期观察。宫颈癌细胞系Hela及第7代原代细胞分别为阳性和阴性对照。
1.5.4悬浮生长能力采用软琼脂克隆实验观察细胞的悬浮生长能力。在24孔板制备含0.5％琼脂的底层凝胶，取第112PDs的MSCxj，制备成单细胞悬液，按照25、50、100、200、400和800个/孔的密度配成0.3％琼脂培养基作为上层胶。培养2～3周后相差显微镜下观察克隆形成情况。Hela及第7代原代细胞分别为阳性和阴性细胞对照。
1.5.5血清依赖性取第112代的细胞按3000个细胞/孔接种于96孔培养板。接种后24小时分别换为无FCS以及含2％、5％和10％FCS的L-DMEM，每组8孔。换液后第5天以四唑盐(MTT)比色实验比较细胞增殖率。具体方法如下终止培养后，每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，37℃继续孵育4～6小时，然后小心吸弃孔内液体，每孔加入150μl二甲基亚砜，振荡10分钟使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定各孔490nm波长处的吸光度A值，统计学分析。
1.5.6接触抑制性第112代细胞以1×105个/ml的密度接种于25ml培养瓶，观察细胞接近汇合和汇合时的生长情况。
权利要求
1.一种永生化人骨髓基质干细胞系及其建立方法，原代人骨髓基质干细胞来源于正常流产胎儿骨髓组织，其特征在于，该永生化人骨髓基质干细胞系体外培养能无限克隆增殖、且具有多向分化潜能；具体包括1)形态特征 H.E染色，永生化人骨髓基质干细胞完全贴壁后呈纤维样或多角型，核多为圆形，细胞核质比大，线粒体、内质网等细胞器发达，属生长旺盛的成纤维样细胞；2)生长特性 细胞数较少时，可见典型的单克隆生长方式；当细胞生长至75％融合时，呈纤维样，生长曲线表明，细胞接种1～2天生长缓慢，3～5天进入对数生长期，细胞倍增时间为40.08小时，从细胞生长曲线及1年以上扩增细胞生长情况看，该细胞系为永生化人骨髓基质干细胞系；3)流式细胞分析特征 永生化人骨髓基质干细胞表达CD29，CD44，CD106，不表达CD34，CD45，CD14，HLA-DR分子，从细胞表面分子标志证实本研究获得的永生化人骨髓基质干细胞系并非造血系细胞；4)染色体核型分析 传至112代的人骨髓基质干细胞染色体数目为2n＝46，其中，中部着丝粒染色体有5对，臂比值为1.33±0.02～1.07±0.03；亚中部着丝粒染色体有7对，臂比值为3.18±0.03～1.45±0.07；端部着丝粒染色体有6对，小染色体有4对，性染色体1对，染色体核型正常；5)生物学特征 体外连续培养过程中，永生化人骨髓基质干细胞具有克隆形成能力，无裸鼠致瘤性，在软琼脂内不能生长，血清依赖性无显著降低，仍具有接触抑制性，不具备转化细胞或癌细胞的特征，是正常细胞；6)成体干细胞特征 永生化人骨髓基质干细胞可以定向诱导分化为成骨、软骨以及心肌样细胞，具备成体干细胞的特性。
2.根据权利要求1所述的一种永生化人骨髓基质干细胞系及其建立方法，其特征在于，人骨髓基质干细胞的获取包括以下步骤1)分离培养原代人骨髓基质干细胞无菌采取6～8月龄正常流产胎儿骨髓，PBS冲洗髓腔；Percoll细胞分离液分离细胞，DMEM-L+10％Hyclone胎牛血清为基础培养液培养，获得原代呈成纤维样细胞；2)纯化人骨髓基质干细胞0.25％胰酶消化原代细胞并传代，有限稀释法获得纯化的克隆生长的人骨髓基质干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种永生化人骨髓基质干细胞系及其建立方法，其特征在于其永生化是通过导入外源性hTERT基因激活端粒酶而得到的采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCIneo-hTERT导入单克隆培养的人骨髓基质干细胞；培养液加G418筛选约20天后，抗性细胞克隆形成，移液枪转移、扩增，经加压筛选获hTERT稳定表达的细胞克隆，同时细胞端粒酶活性转为阳性；获得永生化细胞系。
4.根据权利要求1所述的一种永生化人骨髓基质干细胞系及其建立方法，其特征在于经流式细胞仪检测，细胞表达CD29，CD44，CD106，不表达CD34，CD45，CD14，HLA-DR分子。
5.根据权利要求1所述的一种永生化人骨髓基质干细胞系及其建立方法，其特征在于具有成体干细胞特性经诱导培养，可以分化为成骨、软骨以及心肌样细胞，软骨诱导条件培养基成骨诱导条件培养基基础培养基加地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C，终浓度分别为10-8mol/L，50mg/L，10mmol/L；基础培养基加地塞米松、TGF-β、维生素C，终浓度分别为10-8mol/L，5ug/L，10mmol/L；心肌细胞诱导条件培养基基础培养基加3umol/L 5-氮胞苷。
6.根据权利要求1所述的一种永生化人骨髓基质干细胞系及其建立方法，其特征在于具备正常细胞的生物学特性，不具备以往导入病毒基因等所建立的细胞所特有的转化细胞的特征，永生化人骨髓基质干细胞有克隆形成能力，不具备裸鼠致瘤性，无悬浮生长能力，具有血清依赖性，因此细胞具备正常细胞生物学行为，无转化细胞或癌细胞生物学特征。
全文摘要
本发明属于一种永生化人骨髓基质干细胞系及其建立方法，原代人骨髓基质干细胞来源于正常流产胎儿骨髓组织，有限稀释法进行单细胞克隆培养纯化原代细胞，通过转染pCIneo－hTERT基因获得永生化。该人骨髓基质干细胞系体外培养能无限克隆增殖，但不具备转化细胞或癌细胞的特征，在细胞生物学特征上是正常细胞；细胞可以定向诱导分化为成骨、软骨以及心肌样细胞，具有多向分化潜能，仍具备成体干细胞的特性。可以在生物工程领域得到应用。这种永生化人骨髓基质干细胞系及其建立方法，为研究人骨髓基质干细胞的生物学行为提供标准细胞系，为组织工程基础研究提供平台，为临床应用提供足量种子细胞，并为建立人骨髓基质干细胞系提供一种有效、可靠的方法。
文档编号C12N5/10GK1810957SQ20051004196
公开日2006年8月2日 申请日期2005年4月19日 优先权日2005年4月19日
发明者胡蕴玉, 滕勇, 白建萍, 吕荣, 李丹 申请人:中国人民解放军第四军医大学