专利名称：一种葡萄酒降酸酵母及其培养方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物，具体地说是一种葡萄酒降酸酵母(F-20-7)及其培养方法。
背景技术：
葡萄酒的质量主要取决于葡萄质量，在气候条件不良的年份(低温、高湿)或由于采收过早往往导致葡萄原料的质量不能充分体现，造成葡萄浆果成熟度不够、含酸量高(主要是苹果酸含量高)，所以在葡萄酒生产过程中往往会遇到降酸的问题。由乳酸菌进行的苹果酸-乳酸发酵(malolacticfermentation，MLF)，可使L-苹果酸(二元酸)分解为L-乳酸(一元酸)，二元酸向一元酸的转化使葡萄酒总酸下降，酸涩感降低，通常苹果酸-乳酸发酵可使总酸降低1～3g/L，所以，苹果酸-乳酸发酵是名副其实的生物降酸。MLF可使新生葡萄酒的酸涩、粗糙感消失，使酒的口感达到平衡，且增加了葡萄酒的风味和微生物稳定性；经MLF后的红葡萄酒，酸度下降，果香、醇香加浓，口感柔软、肥硕，根据现代葡萄酒酿造的基本原理，MLF是生产优质干红葡萄酒中不可或缺的过程。由于MLF是在酒精发酵后进行的，属于二次发酵，增加了工序，且不易控制，所以，人们希望获得在葡萄酒酿造过程中能够同时酒精发酵和MLF的降酸酵母。为解决这一问题，近二十年来人们通过基因工程手段对不同种属乳酸菌的苹果酸-乳酸酶基因mle进行了克隆重组、转化酿酒酵母及其表达的研究，期待获得在酒精发酵的同时能够进行MLF的葡萄酒酵母，取得了一定研究进展。酒酒球菌(Oenococcus oeni)是葡萄酒中MLF的主要启动者和完成者，是MLF结束后葡萄酒中唯一存在的能够进行MLF的乳酸菌菌种。人们也尝试将酒酒球菌的苹果酸-乳酸酶基因mleA克隆重组、并转化酿酒酵母，但未能得到将L-苹果酸转化成L-乳酸的阳性转化子。原生质体融合技术作为一种新的基因重组手段在农业、医药、食品和环境治理等研究领域已得到广泛应用，并呈现出能够克服遗传障碍、实现远缘杂交的优势，成为工业微生物育种的重要方法之一。
发明内容
本发明通过酿酒特性优良的葡萄酒酵母与优良酒酒球菌SD-2a间的原生质体融合，构建出了在酒精发酵的同时能够进行MLF的降酸酵母。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种葡萄酒降酸酵母及其培养方法，其特殊之处在于其是以葡萄酒酵母1450及酒酒球菌SD-2a为亲株，应用原生质体融合技术构建的。
葡萄酒降酸酵母细胞形态、大小、菌落特征均与葡萄酒酵母1450相似。
葡萄酒降酸酵母培养基配方分别为YPD培养基酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，蒸馏水配制，自然pH值，121℃灭菌20min。
ATB培养基酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖1％，MgSO4·7H2O 0.02％，MnSO4·4H2O 0.005％，盐酸半胱氨酸0.05％，番茄汁25％(v/v)，蒸馏水配制，自然pH值，115℃灭菌20min。配制固体培养基时添加1.5％的琼脂，配制高渗培养基时添加17％的蔗糖。
融合子初筛培养基酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖1％，MgSO4·7H2O0.02％，MnSO4·4H2O 0.005％，盐酸半胱氨酸0.05％，番茄汁25％(v/v)，琼脂1.5％，蒸馏水配制，自然pH值，115℃灭菌20min。使用前加热融化培养基，待其温度降至55℃时，于其中加入100ug/mL的放线菌酮及20ug/mL的氨苄青霉素，迅速混匀倒平皿。
目标融合子筛选培养基酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖10％，MgSO4·7H2O0.02％，MnSO4·4H2O 0.005％，番茄汁10％(v/v)，DL-苹果酸10g/L，溴甲酚绿0.004％，蒸馏水配制，pH值调至3.8，115℃灭菌20min。
融合子及葡萄酒酵母1450酒精发酵力——苹果酸降解力测试培养基酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖200g/L，番茄汁20ml/L，L-苹果酸3g/L，MnSO4·4H2O 0.005％，蒸馏水配制，pH值调至3.0。
酒酒球菌SD-2a苹果酸降解力测试培养基酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖2g/L，番茄汁20ml/L，L-苹果酸3g/L，MnSO4·4H2O 0.005％，酒精度11％(v/v)，蒸馏水配制，pH值调至3.2。
酒酒球菌SD-2a和葡萄酒酵母原生质体制备过程为对于酒酒球菌SD-2a，采用处于对数生长中期的菌体细胞，以SMM为渗透压稳定液，溶菌酶酶解浓度为1mg/mL，于37℃水浴酶解30min，制备原生质体。
对于葡萄酒酵母1450，采用处于对数生长中期的菌体细胞，经0.3％β-巯基乙醇-0.1％EDTANa2于37℃预处理10～15min，再以PBS为渗透压稳定液，蜗牛酶浓度为2％，于37℃水浴酶解40min，制备原生质体。
原生质体融合及融合子初筛过程为采用PEG-4000 30％(w/v)、融合温度30℃、融合时间30min、酵母细胞数/乳酸菌细胞数1/100、Cacl2浓度50mmol/L的融合条件，以经过PEG处理的酵母细胞为对照，以100ug/mL放线菌酮+20ug/mL氨苄青霉素作为融合子筛选的选择压力，在连续培养9天后，共获得了117株菌落形态类似葡萄酒酵母1450的融合子。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下本发明F-20-7可在酒精发酵的同时降解苹果酸，其酒精发酵能力接近葡萄酒酵母1450；苹果酸降解能力介于两亲株之间，相对接近酒酒球菌SD-2a。
四
图1为葡萄酒酵母1450、融合子F-20-7的发酵曲线图；图2为葡萄酒酵母1450、融合子F-20-7、酒酒球菌SD-2a苹果酸降解力比较图；五具体实施例方式本发明应用原生质体融合技术，构建出一种葡萄酒降酸酵母。
本发明主要利用的培养基配方分别为YPD培养基酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，蒸馏水配制，自然pH值，121℃灭菌20min。
ATB培养基酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖1％，MgSO4·7H2O 0.02％，MnSO4·4H2O 0.005％，盐酸半胱氨酸0.05％，番茄汁25％(v/v)，蒸馏水配制，自然pH值，115℃灭菌20min。配制固体培养基时添加1.5％的琼脂，配制高渗培养基时添加17％的蔗糖。
融合子初筛培养基酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖1％，MgSO4·7H2O0.02％，MnSO4·4H2O 0.005％，盐酸半胱氨酸0.05％，番茄汁25％(v/v)，琼脂1.5％，蒸馏水配制，自然pH值，115℃灭菌20min。使用前加热融化培养基，待其温度降至55℃时，于其中加入100ug/mL的放线菌酮及20ug/mL的氨苄青霉素，迅速混匀倒平皿。
目标融合子筛选培养基酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖10％，MgSO4·7H2O0.02％，MnSO4·4H2O 0.005％，番茄汁10％(v/v)，DL-苹果酸10g/L，溴甲酚绿0.004％，蒸馏水配制，pH值调至3.8，115℃灭菌20min。
融合子及葡萄酒酵母1450酒精发酵力——苹果酸降解力测试培养基酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖200g/L，番茄汁20ml/L，L-苹果酸3g/L，MnSO4·4H2O 0.005％，蒸馏水配制，pH值调至3.0。
酒酒球菌SD-2a苹果酸降解力测试培养基酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖2g/L，番茄汁20ml/L，L-苹果酸3g/L，MnSO4·4H2O 0.005％，酒精度11％(v/v)，蒸馏水配制，pH值调至3.2。
1、酒酒球菌SD-2a和葡萄酒酵母原生质体制备对于酒酒球菌SD-2a，采用处于对数生长中期的菌体细胞，以SMM为渗透压稳定液，溶菌酶酶解浓度为1mg/mL，于37℃水浴酶解30min，制备原生质体。
对于葡萄酒酵母1450，采用处于对数生长中期的菌体细胞，经0.3％β-巯基乙醇-0.1％EDTANa2于37℃预处理10～15min，再以PBS为渗透压稳定液，蜗牛酶浓度为2％，于37℃水浴酶解40min，制备原生质体。
2、原生质体融合及融合子初筛采用PEG-4000 30％(w/v)、融合温度30℃、融合时间30min、酵母细胞数/乳酸菌细胞数1/100、Cacl2浓度50mmol/L的融合条件，以经过PEG处理的酵母细胞为对照，以100ug/mL放线菌酮+20ug/mL氨苄青霉素作为融合子筛选的选择压力，在连续培养9天后，共获得了117株菌落形态类似葡萄酒酵母1450的融合子。
3、融合子复筛及其稳定性检验将在融合子初筛培养基平板上长出的融合子菌落编号，并用灭菌牙签将其转接至融合子初筛培养基平板上。将连续转接三次后仍能生长的融合子经ATB液体活化培养后接种至目标融合子筛选培养基中，于25℃静置发酵。待酒精发酵结束后，将发酵液振荡摇匀，观察其颜色变化状况。融合子F-20的发酵液与其它发酵液相比，颜色明显变蓝，可初步判定其为目标融合子。F-20发酵液带有明显的酒精味，MLF纸层析显示，与其它发酵液相比，其苹果酸斑点明显变小，并有乳酸斑点出现。因此可判定F-20为目标融合子。经连续传代10次后，其仍能在融合子初筛培养基中生长；能够进行酒精发酵，且其发酵液颜色变蓝，经纸层析鉴定，其仍具备MLF能力。所以，融合子F-20的遗传性状是稳定的。
4、融合子F-20单细胞分离培养取F-20斜面菌种经YPD配制成适宜浓度的菌悬液，经显微操作，挑取20个细胞体积较大的单细胞，编号为F-20-1～F-20-20，分别接入20支试管装YPD液体培养基中，于25℃、180rpm下振荡培养。48h后，20支试管中，接入F-20-2、F-20-3、F-20-1、F-20-19、F-20-20的6支保持澄清，其余各管均有不同程度的浑浊及菌体沉淀。保持澄清的试管可能是因为所接入的细胞是死细胞或细胞未接入试管中造成的，其余各管的生长状况不同可能由各细胞生活力、在挑取过程中所受的损伤程度及对环境的适应能力等方面的差异造成的。从中挑取6株浑浊度较高、管底菌体沉淀较多的单克隆菌株F-20-4、F-20-6、F-20-7、F-20-12、F-20-15、F-20-17，经充分振荡混匀后，测定其OD600，其中F-20-7的OD600值最大，说明其生物量大，细胞生活力强，所以可选用F-20-7作为测定融合子酒精发酵力及苹果酸降解力的供试单克隆菌株。
单克隆菌株F-20-7，其细胞形态、大小、菌落特征均与葡萄酒酵母1450相似。
5、融合子F-20-7酒精发酵力与苹果酸降解力试验分别取对数生长中期的F-20-7和1450菌液，按10％的接种量，经离心去上清液后，将菌体转接至融合子及葡萄酒酵母1450酒精发酵力、苹果酸降解力测定培养基中，根据CO2失重，绘制发酵曲线，比较两者的发酵速度；测定两者发酵液的终酒度，分析其有无显著差异。
由图1可看出，1450完成酒精发酵所需时间为5d，F-20-7完成酒精发酵所需时间为6d，融合子F-20-7的发酵速率略低于葡萄酒酵母1450，说明其酒精发酵力与1450相比略有下降；两者发酵液的最终酒度见表1-1，经t检验，两者发酵液在终酒度上并无显著性差异。
由图1及图2可看出，单克隆融合子F-20-7在酒精发酵的同时进行降酸，其降酸速率介于葡萄酒酵母1450及酒酒球菌SD-2a之间，相对接近SD-2a。由表1-2可看出，F-20-7在酒精发酵结束时，可降解77.6％的苹果酸，其苹果酸降解力高于葡萄酒酵母1450，低于酒酒球菌SD-2a。
综上所述，F-20-7可在酒精发酵的同时降解苹果酸，其酒精发酵能力接近葡萄酒酵母1450；苹果酸降解能力介于两亲株之间，相对接近酒酒球菌SD-2a。
其中SSM缓冲液配制蔗糖0.5mol/L，MgCl2·6H2O 0.02mol/L，马来酸0.02mol/L，蒸馏水配制，pH调至6.5，121℃灭菌20min。
PB及PBS配制取0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液87.7ml，与0.2mol/L的磷酸二氢钠水溶液12.3ml混合均匀121℃灭菌20min，即得到pH6.0的磷酸盐缓冲液PB。于PB中添加1mol/L的山梨醇经0.45um mol/L膜过滤除菌得到高渗磷酸盐缓冲液PBS。
表1 葡萄酒酵母1450、单克隆融合子F-20-7发酵终酒度
表2 1450、F-20-7、SD-2a苹果酸降解力比较
上述葡萄酒酵母1450及酒酒球菌SD-2a，公众均可从通常的商业途径获得，申请人也可应公众要求，保证从申请日起20年内向公众发放。
权利要求
1.一种葡萄酒降酸酵母及其培养方法，其特征在于其是以葡萄酒酵母1450及酒酒球菌SD-2a为亲株，应用原生质体融合技术构建的。
2.根据权利要求1所述的一种葡萄酒降酸酵母及其培养方法，其特征在于葡萄酒降酸酵母细胞形态、大小、菌落特征均与葡萄酒酵母1450相似。
3.根据权利要求2所述的一种葡萄酒降酸酵母及其培养方法，其特征在于葡萄酒降酸酵母培养基配方分别为YPD培养基酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，蒸馏水配制，自然pH值，121℃灭菌20min；ATB培养基酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖1％，MgSO4·7H2O 0.02％，MnSO4·4H2O 0.005％，盐酸半胱氨酸0.05％，番茄汁25％(v/v)，蒸馏水配制，自然pH值，115℃灭菌20min。配制固体培养基时添加1.5％的琼脂，配制高渗培养基时添加17％的蔗糖；融合子初筛培养基酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖1％，MgSO4·7H2O 0.02％，MnSO4·4H2O 0.005％，盐酸半胱氨酸0.05％，番茄汁25％(v/v)，琼脂1.5％，蒸馏水配制，自然pH值，115℃灭菌20min，使用前加热融化培养基，待其温度降至55℃时，于其中加入100ug/mL的放线菌酮及20ug/mL的氨苄青霉素，迅速混匀倒平皿；目标融合子筛选培养基酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖10％，MgSO4·7H2O0.02％，MnSO4·4H2O 0.005％，番茄汁10％(v/v)，DL-苹果酸10g/L，溴甲酚绿0.004％，蒸馏水配制，pH值调至3.8，115℃灭菌20min；膏0.5％融合子及葡萄酒酵母1450酒精发酵力——苹果酸降解力测试培养基酵母，蛋白胨1％，葡萄糖200g/L，番茄汁20ml/L，L-苹果酸3g/L，MnSO4·4H2O 0.005％，蒸馏水配制，pH值调至3.0；酒酒球菌SD-2a苹果酸降解力测试培养基酵母膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖2g/L，番茄汁20ml/L，L-苹果酸3g/L，MnSO4·4H2O 0.005％，酒精度11％(v/v)，蒸馏水配制，pH值调至3.2。
4.根据权利要求3所述的一种葡萄酒降酸酵母及其培养方法，其特征在于酒酒球菌SD-2a和葡萄酒酵母原生质体制备过程为对于酒酒球菌SD-2a，采用处于对数生长中期的菌体细胞，以SMM为渗透压稳定液，溶菌酶酶解浓度为1mg/mL，于37℃水浴酶解30min，制备原生质体；对于葡萄酒酵母1450，采用处于对数生长中期的菌体细胞，经0.3％β-巯基乙醇-0.1％EDTANa2于37℃预处理10～15min，再以PBS为渗透压稳定液，蜗牛酶浓度为2％，于37℃水浴酶解40min，制备原生质体。
5.根据权利要求3所述的一种葡萄酒降酸酵母及其培养方法，其特征在于原生质体融合及融合子初筛过程为采用PEG-400030％(w/v)、融合温度30℃、融合时间30min、酵母细胞数/乳酸菌细胞数1/100、Cacl2浓度50mmol/L的融合条件，以经过PEG处理的酵母细胞为对照，以100ug/mL放线菌酮+20ug/mL氨苄青霉素作为融合子筛选的选择压力，在连续培养9天后，共获得了117株菌落形态类似葡萄酒酵母1450的融合子。
全文摘要
本发明涉及一种葡萄酒降酸酵母及其培养方法，其通过酿酒特性优良的葡萄酒酵母与优良酒酒球菌SD－2a间的原生质体融合，构建出了在酒精发酵的同时能够进行MLF的降酸酵母。本发明是以葡萄酒酵母1450及酒酒球菌SD－2a为亲株，应用原生质体融合技术构建的，葡萄酒降酸酵母细胞形态、大小、菌落特征均与葡萄酒酵母1450相似。
文档编号C12N1/16GK1721524SQ20051004193
公开日2006年1月18日 申请日期2005年4月11日 优先权日2005年4月11日
发明者李华, 刘树文, 王 华, 何忠宝 申请人:西北农林科技大学