专利名称：半滑舌鳎性别特异分子标记及遗传性别鉴定方法
技术领域：
本发明属于水产生物技术领域中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术，是一种能在鱼类单性育种中应用的鱼类性别特异分子标记及遗传性别鉴定方法。
背景技术：
我国有着丰富的鱼类资源，其中许多鱼类在生长速率上存在着性别差异，例如，罗非鱼雌性比雄性生长快约40％以上，鲤鱼、牙鲆及半滑舌鳎等鱼类，雌性个体比雄性个体生长快30％-100％，因此，开展这些鱼类性别相关基因及性别特异分子标记的研究既有重要的科学意义，又有重大的应用潜力和推广前景。
半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)是我国特有的一种名贵经济海水鱼类，属于近海温水性底层鱼类，我国沿海均有分布，以黄海、渤海为多。半滑舌鳎由于其味道鲜美，肉质细嫩，营养丰富，深受广大消费者欢迎，其市场价值极高，养殖前景非常广阔。尽管近2年来，半滑舌鳎人工育苗技术获得突破，年产半滑舌鳎苗种近百万尾，不过，研究表明半滑舌鳎雌性个体和雄性个体在生长速率上存在巨大差别，其雌性个体比雄性个体大2-3倍(黄海水产研究所，孟田湘等，1988)。由于雄性个体生长过慢，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的形成，由于难以鉴定半滑舌鳎的遗传性别，严重影响了半滑舌鳎雌核发育和性别控制研究的进行。
有关鱼类性别相关分子标记的研究，目前只是在少数几种鱼类上进行过。采用的主要方法包括RAPD、SSR和AFLP等。加拿大西温哥华实验室的Devlin(1994)找到了大鳞大马哈鱼Y染色体特异的DNA片段；匈牙利农业生物技术中心的Kovacs等(2000)用RAPD扫描非洲鲶鱼雌雄基因池，找到两个雄性性别相关的RAPD标记，一个(CgaY1)大约2.6kb，另一个(CgaY2)458bp，这是首次从鲶鱼中找到性别特异的DNA标记。美国新罕布什尔大学的Lee等(2004)用分离集团分析法寻找罗非鱼表型性别相连锁的DNA标记，找到10个与罗非鱼表型性别连锁的微卫星标记。这些标记可以直接用于不同Y染色体等位基因功能的研究和具有一个或者几个Y染色体拷贝的亲鱼的鉴定。英国Stirling大学的Ezaz等(2004)用AFLP技术扫描尼罗罗非鱼基因组，找到三个Y染色体连锁(OniY425、OniY382、OniY227)和一个X染色体连锁(OniX420)的AFLP标记，其中OniX420和OniY425证明为等位基因，然而这些标记却不能鉴别没有亲缘关系的个体的性别，达不到鉴定罗非鱼遗传性别的水平。由于不同鱼类之间存在着很大差异，一种鱼类的性别特异分子标记不能在另一种鱼类上应用，因此必须建立各种鱼类自己的性别特异分子标记。有关半滑舌鳎性别特异分子标记及遗传性别检测技术，目前国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了筛选出半滑舌鳎性别特异分子标记，建立遗传性别鉴定的分子生物学方法，为半滑舌鳎性别控制和全雌育种研究提供分子标记和技术方法。
本发明其技术内容如下一、半滑舌鳎性别特异分子标记，包括1、半滑舌鳎血液DNA的提取；2、基因组DNA的AFLP分析；3、性别特异分子标记的筛选；二、半滑舌鳎遗传性别鉴定方法。
一、半滑舌鳎性别特异分子标记，包括1、半滑舌鳎血液DNA的提取；2、基因组DNA的AFLP分析；3、性别特异分子标记的筛选1、半滑舌鳎血液DNA的提取抽取半滑舌鳎鱼血液，在冰上静置后离心去除上层血浆，加4-6倍体积蒸馏水溶解血细胞沉淀，摇匀，静置，再离心，去上清；加4-6倍体积STE缓冲液，清洗沉淀，用含蛋白酶-K的STE缓冲液，消化过夜，直至沉淀物溶解为止；添加等体积饱和酚，抽提一次；用与上述STE缓冲液体积相同的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液抽提一次，然后用与上述STE缓冲液体积相同的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次；最后用2-3倍体积的无水乙醇沉淀DNA。于-20℃放置20-30分钟后于12000rpm离心，去上清，收集DNA沉淀，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，用TE溶解，将DNA保存在-20℃备用。
所述的基因组DNA的浓度应不低于20ng/μl，基因组DNA的纯度要求OD260/OD280值为1.76-1.80。
2、基因组DNA的AFLP分析
基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤第一步对DNA模板进行酶切，第二步是将特异接头连接到酶切片段上，第三步是进行预扩增，第四步是进行选择性扩增，第五步是电泳分析。
所述的对DNA模板进行酶切，其方法是先用EcoRI/MseI酶混合物(1.25U/μl)消化80-110ng模板DNA 4-6小时，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，将充分酶切的DNA溶液置于70℃孵育15分钟灭活限制性内切酶。
所述的特异接头连接到酶切片段上，其方法是向上面的酶切反应混合液中加入12.0μl接头混合物和0.5μl T4 DNA连接酶，20℃孵育12-20小时。
所述的预扩增，其方法是将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板；PCR引物是3’末端带有一个选择性碱基(A或者C)的引物混合物，进行PCR预扩增。
所述的选择性扩增其方法是将预扩增产物稀释30-50倍，作为选择性扩增的模板。用荧光标记的MseI引物和EcoRI引物进行选择性PCR扩增，这两种引物3’末端带有三个选择性碱基。向PCR扩增产物中加入适量的上样液，于94℃变性3分钟后立即置于冰上待用。总共用了64个引物组合进行选择性扩增，获得的PCR产物经94℃变性后用6.5％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。
所述的电泳分析，其方法是将变性好的扩增产物用5.5-6.5％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳条件电压1500V，功率40W，电流40mA，温度45℃，时间3.5小时。然后对电泳后产生的DNA条带进行观察，照相和分析。
3、性别特异分子标记的筛选总共用64个引物组合对15个半滑舌鳎雌性个体和13个半滑舌鳎雄性个体的基因组DNA进行了AFLP-PCR扩增，通过SAGA软件分析筛选出4个引物组合产生了7条雌性特异的DNA片段，这些片段在雄性个体基因组DNA中不存在其中引物组合M1-E1扩增出三条雌性特异的DNA片段，长度分别为378--382bp、570-575bp和780-783bp；引物组合M2-E2扩增出一条460-464bp的雌性特异DNA片段；引物组合M3-E3扩增出两条雌性特异的DNA片段，长度分别为132-136bp和614-618bp；引物组合M4-E4，扩增出一条300-305bp的雌性特异DNA片段。将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的片段作为雌性特异DNA标记，即可用于遗传性别鉴定。
二、遗传性别鉴定方法抽取待测半滑舌鳎鱼的血液，提取基因组DNA，用产生雌性特异DNA片段的AFLP引物进行AFLP分析，如果产生了这些特异片段，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有这些片段的个体则被认为是遗传上的雄性个体。
本发明与已有技术对比其特点是本发明采用分子标记技术，以半滑舌鳎为材料首次筛选到性别特异DNA分子标记，首次建立了我国养殖鱼类遗传性别鉴定的分子生物学技术。该技术具有准确、灵敏、可靠等优点，为鱼类性别控制和单性育种开辟了新的技术途径，适宜在所有养殖鱼类上推广应用，对养殖鱼类单性育种具有重要意义和应用价值。
具体实施例方式采用现代分子生物学技术，筛选出性别特异的分子标记，建立半滑舌鳎遗传性别鉴定的分子技术，这对于培育半滑舌鳎全雌苗种，进行全雌苗种养殖，提高半滑舌鳎的养殖产量，提高养殖的经济效益，真正将半滑舌鳎开发为一个被广大养殖户接受的优良养殖品种，推动半滑舌鳎养殖产业的发展及海水鱼类养殖品种的更新换代，具有重要的现实意义和巨大的经济效益。
下面通过半滑舌鳎雌性特异AFLP分子标记的筛选及遗传性别鉴定方法的建立，对本发明的技术内容进行详细说明一、半滑舌鳎性别特异分子标记，包括1、半滑舌鳎血液DNA的提取，2、基因组DNA的AFLP分析，3、性别特异分子标记的筛选。
1、半滑舌鳎血液DNA的提取抽取半滑舌鳎鱼血液200-400μl，取100-150μl血液于3500rpm离心15分钟，去除上层血浆后，加5倍体积蒸馏水(灭菌)溶解血细胞沉淀，摇匀，静置5-10分钟，再以3500rpm离心15分钟，去上清；加5倍体积STE(0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0))，清洗沉淀2次；每次在12000rpm离心7-8分钟；去上清后加0.5ml STE，10％SDS 25-30μl，蛋白酶-K至终浓度100μg/ml，37℃消化过夜，直至沉淀物溶解为止；添加等体积饱和酚，倒转摇匀10分钟，12000rpm离心5分钟，吸上层清夜入另一1.5ml离心管；加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，倒转混匀10分钟后于12000rpm离心5分钟，吸上层清夜入另一1.5ml离心管，向上清液中加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，倒转混匀10分钟，于12000rpm离心5分钟，取上清入另一管；加1/12体积3M醋酸钠，混匀后再加3倍体积的4℃无水乙醇，轻柔振摇；可观察到白色絮状物出现(DNA)，于-20℃放置20-30分钟后于12000rpm低温(4℃)离心10分钟，去上清，收集DNA沉淀，加1ml70％乙醇洗涤，12000rpm低温(4℃)离心10分钟，去上清，重复1次；自然干燥后，用pH8.0TE溶解，保存在-20℃备用。基因组DNA的浓度应不低于20ng/μl，基因组DNA的纯度要求OD260/OD280值为1.8左右。
2、基因组DNA的AFLP分析主要分为如下5步(1)、酶切用1.0μl EcoRI/MseI酶混合物(1.25U/μl)消化80-110ng模板DNA 4-6小时，再用1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，然后将充分酶切的DNA溶液于70℃孵育15分钟灭活限制性内切酶。
(2)、连接向上面的酶切反应混合液中加入12.0μl接头混合物和0.5μl T4DNA连接酶，20℃孵育12-20小时，保证接头充分连接。
(3)、预扩增将连接产物稀释10倍，作为预扩增的模板；预扩增引物是3’末端带有一个选择性碱基(A或者C)的引物混合物。PCR反应条件为92-94℃，30秒；54-56℃，1分钟；70-72℃，1分钟。20个循环后，4℃待用。
(4)、选择性扩增将预扩增产物稀释30-50倍，作为选择性扩增的模板。用含酶切位点MseI的引物和含酶切位点EcoRI的引物进行扩增，这两种引物3’末端带有三个选择性碱基。PCR反应分为三步第一步进行1个循环92-94℃，30秒；63-65℃，30秒；70-72℃，1分钟；第二步进行12个循环92-94℃，30秒；65-54℃，30秒；70-72℃，1分钟；第三步进行23个循环--92-94℃，30秒；54-56℃，30秒；70-72℃，1分钟。扩增产物加入适量的上样液，94℃变性3分钟，立即置于冰上。
(5)、电泳分析
将变性好的扩增产物用5.5-6.5％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳条件电压1500V，功率40W，电流40mA，温度45℃，时间3.5小时。总共用了64个引物组合对15个半滑舌鳎雌性个体和13个半滑舌鳎雄性个体的基因组DNA进行了AFLP分析，用SAGA软件分析电泳图谱后，筛选出产生特异片段的引物组合4个，这4个引物组合共产生了7条雌性特异的DNA片段。
3、性别特异分子标记的筛选总共用64个引物组合对15个半滑舌鳎雌性个体和13个半滑舌鳎雄性个体的基因组DNA进行了AFLP-PCR扩增，通过SAGA软件分析筛选出4个引物组合产生了7条雌性特异的DNA片段，这些片段在雄性个体基因组DNA中不存在其中引物组合M1-E1扩增出三条雌性特异的DNA片段，长度分别为378--382bp、570-575bp和780-783bp；引物组合M2-E2扩增出一条460-464bp的雌性特异DNA片段；引物组合M3-E3扩增出两条雌性特异的DNA片段，长度分别为132-136bp和614-618bp；引物组合M4-E4扩增出一条300-305bp的雌性特异DNA片段。将只在雌性个体中出现、而在雄性个体中不出现的片段作为雌性特异DNA标记，即可用于遗传性别鉴定。
二、遗传性别鉴定方法应用上面建立的半滑舌鳎鱼血液DNA提取技术抽取血液，分离出半滑舌鳎鱼基因组DNA，这种方法不用杀鱼，为非损伤性技术，适于推广应用；然后再用上面筛选出来的能产生半滑舌鳎雌性特异DNA片段的AFLP引物对基因组DNA进行AFLP分析，电泳证实DNA条带的有无，如果某条鱼的基因组DNA中产生了性别特异的DNA片段，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有这些片段的个体则可认为是遗传上的雄性个体。通过这种方法就可以鉴定半滑舌鳎的遗传性别，为半滑舌鳎性别控制和全雌育种研究提供技术手段。这种方法准确、可靠，在半滑舌鳎性别控制和单性育种中具有重要应用价值。
权利要求
1.一种半滑舌鳎性别特异分子标记，其特征在于它的技术内容包括如下三个方面1)、半滑舌鳎血液DNA的提取；2)、基因组DNA的AFLP分析；3)、性别特异分子标记的筛选；1)、半滑舌鳎血液DNA的提取抽取半滑舌鳎鱼血液，在冰上静置后离心去除上层血浆，加4-6倍体积蒸馏水溶解血细胞沉淀，摇匀，静置，再离心，去上清；加4-6倍体积STE缓冲液，清洗沉淀，用含蛋白酶-K的STE缓冲液，消化过夜，直至沉淀物溶解为止；添加等体积饱和酚，抽提一次；用酚、氯仿、异戊醇混合液抽提一次，然后用氯仿、异戊醇混合液抽提一次；最后用2-3倍体积的无水乙醇沉淀DNA；于-20℃放置20-30分钟后于12000rpm离心，去上清，收集DNA沉淀，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，用TE溶解，将DNA保存在-20℃备用；所述的基因组DNA的浓度应不低于20ng/μl，基因组DNA的纯度要求OD260/OD280值为1.76-1.80；2)、基因组DNA的AFLP分析基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤第一步对DNA模板进行酶切，第二步是将特异接头连接到酶切片段上，第三步是进行预扩增，第四步是进行选择性扩增，第五步是电泳分析；所述的对DNA模板进行酶切，其方法是先用1.25U/μl EcoRI/MseI酶混合物消化80-110ng模板DNA 4-6小时，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，将充分酶切的DNA溶液置于70℃孵育15分钟灭活限制性内切酶；所述的特异接头连接到酶切片段上，其方法是向上面的酶切反应混合液中加入12.0μl接头混合物和0.5μl T4 DNA连接酶，20℃孵育12-20小时；所述的预扩增，其方法是将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板；PCR引物是3’末端带有一个A或者C的选择性碱基的引物混合物，进行PCR预扩增；所述的选择性扩增其方法是将预扩增产物稀释30-50倍，作为选择性扩增的模板；用荧光标记的MseI引物和EcoRI引物进行选择性PCR扩增，这两种引物3’末端带有三个选择性碱基；向PCR扩增产物中加入适量的上样液，于94℃变性3分钟后立即置于冰上待用；总共用了64个引物组合进行选择性扩增，获得的PCR产物经94℃变性后用6.5％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；所述的电泳分析，其方法是将变性好的扩增产物用5.5-6.5％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；电泳条件电压1500V，功率40W，电流40mA，温度45℃，时间3.5小时；然后对电泳后产生的DNA条带进行观察，照相和分析；3)、性别特异分子标记的筛选总共用64个引物组合对15个半滑舌鳎雌性个体和13个半滑舌鳎雄性个体的基因组DNA进行了AFLP-PCR扩增，通过SAGA软件分析筛选出4个引物组合产生了7条雌性特异的DNA片段，这些片段在雄性个体基因组DNA中不存在其中引物组合M1-E1扩增出三条雌性特异的DNA片段，长度分别为378--382bp、570-575bp和780-783bp；引物组合M2-E2扩增出一条460-464bp的雌性特异DNA片段；引物组合M3-E3扩增出两条雌性特异的DNA片段，长度分别为132-136bp和614-618bp；引物组合M4-E4，扩增出一条300-305bp的雌性特异DNA片段；将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的片段作为雌性特异DNA标记，即可用于遗传性别鉴定。
2.一种半滑舌鳎遗传性别鉴定方法，其特征在于它的方法是抽取待测半滑舌鳎鱼的血液，提取基因组DNA，用产生雌性特异DNA片段的AFLP引物进行AFLP分析，如果产生了这些特异片段，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有这些片段的个体则被认为是遗传上的雄性个体。
全文摘要
一种半滑舌鳎性别特异分子标记及遗传性别检测方法，它的方法是血液DNA的提取，基因组DNA的AFLP分析、性别特异AFLP分子标记的筛选以及半滑舌鳎遗传性别鉴定方法的建立。本发明确定了从半滑舌鳎血液中提取基因组DNA的条件和方法，建立了半滑舌鳎AFLP分析技术，从64个引物组合中筛选到4个引物组合能够产生雌性特异DNA片段，筛选出半滑舌鳎雌性特异的AFLP分子标记7个，创建了半滑舌鳎遗传性别鉴定的分子标记技术。本发明首次筛选到半滑舌鳎雌性特异AFLP分子标记，建立了半滑舌鳎遗传性别鉴定的分子标记技术。本发明方法具有先进、高效、准确、可靠的特点，在半滑舌鳎单性苗种生产中具有重要应用价值，同时在其它鱼类遗传性别鉴定和性别控制研究中也具有广阔应用前景。
文档编号C12Q1/68GK1814793SQ20051004555
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月15日 优先权日2005年12月15日
发明者陈松林, 李静, 邓思平, 田永胜, 沙珍霞 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所