专利名称：利用生物技术选育黄籽油菜新品系的方法
利用生物技术选育黄籽油菜新品系的方法技术领域
本发明属于农业技术领域，涉及种间杂交创制甘蓝型黄籽油菜的研究，具体涉及到地方品种芥菜型黄籽油菜黄籽性状的遗传，分子标记和利用分子标记选育黄籽油菜新品系的方法。
背景技术：
黄籽油菜与黑籽油菜相比，具有含油量高，蛋白质含量高，种皮薄、纤维含量低，油清澈透明、品质良好等性状优点。自上世纪60年代刘后利教授在国内首先发现黄籽油菜的含油量高于非黄籽油菜以后，油菜黄籽基因的研究和利用一直是油菜研究领域的热点。诸多研究证明黄籽油菜较其同背景的黑籽油菜，能同时提高油菜含油量和蛋白质含量、改善菜油和饼粕品质，因此黄籽油菜育种被认为是最高效的油菜育种途径之一。然而，黄籽育种开展几十年来，育成的黄籽率100%的品种几乎没有，世界范围内可供利用的黄籽种质十分有限。我国甘蓝型油菜的黄籽基因基本来自白菜型黄籽油菜，然而在白菜型油菜中表现稳定遗传的黄籽基因一经转育到甘蓝型油菜中，其黄籽性状便不能稳定遗传，国内外科学家对这种不稳定性进行了多年的研究，其内部机理至今尚不太清楚。
芥菜型油菜相似于甘蓝型油菜，是一个异源四倍体复合种，在种皮色素合成上可能存在相似的机理。陕北黄芥是我国特有的黄籽地方种质，研究表明其黄籽基因仅受一对主效基因控制，黄籽性状遗传简单且能够稳定遗传，同时，陕北黄芥具有耐旱，耐瘠薄，耐热，耐寒性强，适应性强等特点，在我国西部干旱地区和高原地区广泛种植，是研究黄籽遗传机理，创制甘蓝型黄籽油菜种质以及黄籽油菜育种的良好材料。可以将陕北黄芥的黄籽基因导入到甘蓝型油菜中育成甘蓝型黄籽油菜新品系，拓宽甘蓝型黄籽油菜种质基础，有助于甘蓝型黄籽油菜的育种。然而，传统的表现型选择的育种方法，受到环境条件影响，存在许多缺点，选择的效率低、年限较长，加之甘蓝型黄籽油菜种皮色泽遗传极不稳定，且受环境和外界因素影响较大。分子标记的使用可以解决这个问题，因为分子标记的基因型是可以识别的，能进行直接选择，因此可以借助分子标记对黄籽性状的基因型进行直接而又快速地选择，具有快速、经济，效率高、准确性强等优点。分子标记辅助选择包括对目标基因的前景选择或称正向选择和对遗传背景的选择也称负向选择，背景选择可加快遗传背景恢复速度，缩短育种年限和减轻连锁累赘的作用。育种过程中将分子标记技术与回交育种相结合，可以快速地将与分子标记连锁的基因转移到另一个材料中。
在芥菜型油菜中，Negi等在2000年发现3个AFLP标记与褐籽性状紧密连锁，其中一个标记被转化成SCAR标记；Sabharwal等于2004年找到了 15个与粒色基因连锁的 AFLP标记，11个AFLP标记被图谱到两个连锁群上，标记密度分别为6. 0和3. 6cM。2005年 Lakshmi等鉴定出3个SSR标记与粒色基因连锁，并将这三个标记定位到两个连锁群上。这些工作为分子标记辅助选择选育黄籽油菜品种奠定了基础。但是利用这些标记辅助选择 (MAS)甘蓝型黄籽油菜还未见报道。
综上所述，现有技术中存在以下缺点
1、甘蓝型油菜中，黄籽种质遗传基础较窄，黄籽性状的遗传不稳定，难以加以利用。
2、传统的回交转育方法选择效率低，所花时间长且很难对甘蓝型油菜的黄籽性状进行有效的改良。
3、所建立的黄籽性状的遗传连锁图谱较为粗糙，很难在黄籽基因克隆以及黄籽育种中使用。发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用生物技术选育甘蓝型黄籽油菜新品系的方法，将黄籽性状稳定的芥菜型油菜-陕北黄芥的黄籽性状导入到甘蓝型油菜中，创制甘蓝型黄籽油菜新种质，有望形成稳定遗传的甘蓝型黄籽油菜新品系；建立芥菜型油菜黄籽性状的高密度的遗传连锁图谱，获取紧密连锁的显性及共显性标记，在回交转育过程中对黄籽性状进行前景选择，同时利用AFLP标记对改良后代进行背景选择，加快黄籽性状的选育过程。
本发明利用陕北黄芥(纯黄籽)与关中芥菜(褐籽)杂交，其&代自交获得一个 F2群体，每一个F2代单株自交，根据自交单株上的籽粒颜色判断F2植株的表型。利用AFLP 与SSR技术与集团分析法(BSA)法相结合筛选出与黄籽性状紧密连锁的分子标记，并将这些标记转化成更稳定、易操作的SCAR标记。结果表明有21个AFLP标记、2个SSR标记与褐籽基因紧密连锁，其中SSR标记CB10022为共显性标记。褐籽基因两侧最近的分子标记是 EA02MC08 (0. 3cM)与 P03MC08 (0. 5cM)，标记 EA06MC11、EA08MC13、Pl 1MG01、P15MG15、 P16MC02、P09MC12被转化为SCAR标记，EA08MC13转化为为共显性标记。
以陕北黄芥为黄籽基因供体，以由西北农林科技大学油菜种质资源研究室提供的甘蓝型油菜品系Xul02(黑籽)为受体，利用杂交-多次回交-自交的方法，将陕北黄芥的黄籽基因导入到Xul02中，选育双低甘蓝型黄籽油菜新品系。具体方案如下
在分离群体BC1Fp BC2F1, BC3F1、BC4F1、BC5F1中利用共显性标记CB10022对每一单株进行选择，选择恥基因型单株，结合田间农艺性状考察，淘汰非目标单株。同时利用AFLP 引物对目标单株进行背景选择，每一分离群体中对目标单株进行品质分析，选择双低的后代，最后选留3株与轮回亲本Xul02相似性最高的单株进行回交。在BC5F2中利用SSR标记 CB10373以及SCAR标记(由EA06MC11转化而来)进行前景选择，选择ΙΛ基因型单株，以后每代自交获得稳定的甘蓝型黄籽品系。
本发明的有益效果
本发明建立了芥菜型油菜黄籽性状的高密度的遗传连锁图谱，获取紧密连锁的显性及共显性标记，在回交转育过程中对黄籽性状进行前景选择，同时利用AFLP标记对改良后代进行背景选择，大大缩短了甘蓝型油菜黄籽品系选育的时间，减少了工作量，提供了一条选育甘蓝型油菜黄籽品系有效途径。
图1是陕北黄芥黄籽基因的遗传连锁图谱；
图2是黄籽性状回交导入到Xul02中的分子标记辅助选择选育方案；
图3是SSR标记CB10022扩增效果图4是SCAR标记(EA06MC11转化)扩增效果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式
对本发明的方法作进一步详细地说明。
参照图1、图2，本发明利用陕北黄芥(纯黄籽)与关中芥菜(褐籽)杂交，其？1 代自交获得一个F2群体，每一个F2代单株自交，根据自交单株上的籽粒颜色判断F2植株的表型。利用AFLP、SSR技术与集团分析法(BSA)法相结合筛选出与褐籽基因紧密连锁的分子标记，并将这些标记转化成更稳定、易操作的SCAR标记。结果表明有21个AFLP标记、2 个SSR标记与褐籽基因紧密连锁，其中SSR标记CB10022为共显性标记。黄籽位点两侧最近的分子标记是 EA02MC08(0. 3cM)与 P03MC08 (0. 5cM)，标记 EA06MC11、EA8MC13、Pl 1MG01、 P15MG15、P16MC02、P09MC12被转化为SCAR标记，EA08MC13转化为共显性标记。
以陕北黄芥为黄籽基因供体，以优良的甘蓝型油菜品系Xul02(黑籽)为受体，利用杂交-多次回交-自交的方法，将陕北黄芥的黄籽基因导入到Xul02中，选育黄籽双低优良甘蓝型油菜品系。
在分离群体BC1F1 (165个单株)中利用共显性标记CB10022对每一单株进行选择， 选择恥基因型单株，结合田间农艺性状考察，留下了 72个目标单株，同时利用20对多态性较好的AFLP引物对目标单株进行背景选择，共扩增出了 167条多态性带，通过相似性分析， 选留3株与轮回亲本Xul02相似性最高的单株再进行回交。在BC2Fp BC3Fp BC4Fp BC5F1中利用相同的方法，获得3株目标单株，再自交获得了 BC5F2群体(152个单株)，利用SSR标记CB10373以及SCAR标记(由EA06MC11转化而来)进行前景选择，选择了 3株bb基因型单株，以后每代自交获得稳定的甘蓝型黄籽品系。
权利要求
1.一种利用生物技术选育黄籽油菜新品系的方法，其具体步骤为1)陕北黄芥(纯黄籽)与关中芥菜(褐籽)杂交，其F1代自交获得一个F2群体，每一个F2代单株自交，根据自交单株上的籽粒颜色判断F2植株的表型；2)利用AFLP、SSR技术与集团分析法(BSA)法相结合筛选出与黄籽位点紧密连锁的分子标记，并将这些标记转化成SCAR标记，结果表明有21个AFLP标记、2个SSR标记与褐籽基因紧密连锁，其中SSR标记CB10022为共显性标记，黄籽位点两侧最近的分子标记是 EA02MC08 (0. 3cM)与 P03MC08 (0. 5cM)，标记 EA06MC11、EA8MC13、Pl 1MG01、P15MG15、 P16MC02、P09MC12被转化为SCAR标记，EA08MC13转化为共显性标记；3)以陕北黄芥为黄籽基因供体，以甘蓝型油菜品系Xul02(黑籽)为受体，利用杂交-多次回交-自交的方法，将陕北黄芥的黄籽基因导入到Xul02中，选育得到甘蓝型黄籽油菜品系。
2.根据权利要求1所述的利用生物技术选育黄籽油菜新品系的方法，其特征在于，在分离群体BC1F^ BC2F1, BC3F1, BC4F^ BC5F1中利用共显性标记CB10022对每一单株进行选择， 选择恥基因型单株，结合田间农艺性状考察，淘汰非目标单株，同时利用AFLP弓丨物对目标单株进行背景选择，每一分离群体中对目标单株进行品质分析，选择双低的后代，最后选留 3株与轮回亲本Xul02相似性最高的单株进行回交，在BC5F2中利用SSR标记CB10373以及 SCAR标记进行前景选择，选择ΙΛ基因型单株，以后每代自交获得甘蓝型黄籽品系。
3.根据权利要求2所述的利用生物技术选育黄籽油菜新品系的方法，其特征在于， SCAR标记由EA06MC11转化而来。
全文摘要
本发明提供一种利用生物技术选育甘蓝型黄籽油菜新品系的方法，在分离群体BC1F1、BC2F1、BC3F1、BC4F1、BC5F1中利用共显性标记CB10022对每一单株进行选择，选择Bb基因型单株，结合田间考察，淘汰非目标单株。同时利用AFLP引物对目标单株进行背景选择，每一分离群体中对目标单株进行品质分析，选择双低的后代，最后选留3株与轮回亲本Xu102相似性最高的单株进行回交。在BC5F2中利用SSR标记CB10373以及SCAR标记进行前景选择，选择bb基因型单株，以后每代自交获得稳定的甘蓝型黄籽品系。本发明所述方法大大缩短了甘蓝型油菜黄籽品系选育的时间，减少了工作量。
文档编号C12Q1/68GK102499056SQ20111032701
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者张学贤, 徐爱遐, 班元元, 黄镇 申请人:西北农林科技大学