专利名称：一种用于检测副溶血性弧菌的分子马达生物传感器试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明是关于食品微生物快速检测技术的一种。
背景技术：
传统的副溶血性弧菌检测方法要求对每个检验项目进行非选择性增菌、选择性增菌、分离、筛选和鉴定等步骤，一般需要4天才能出具检测报告，严重影响货物的品质和货架寿命。一些新的技术如PCR技术、免疫学检测技术、生物芯片技术等检测方法仍依赖于传统的检测步骤，即需要进行增菌，耗时耗力，完成一次检测通常需要几天的时间。这样不仅增加了实验室的工作量，而且也不利于食品工业中生产流程的监测、终产品的质量控制以及政府部门对食品安全的管理和控制。
发明内容
以受控分子马达技术为核心，集成核酸探针识别、荧光探针标记与检测等技术，建立了一个全新概念的快速检测技术体系。利用ATP酶作为载体对目标物进行检测具有灵敏度高、特异性强、快速的特点。分子马达连接上特异的核酸探针，可以实现对特定食品微生物的快速、特异性、高通量的检测。本发明可将检测时间缩短至2天，且检测灵敏度能达到102CFU/ml，满足现有的食品微生物检测范围。
附 图1为分子马达生物传感器模式图(其中a、b、C、α、β、δ、Υ、ε均为ATP合酶亚基)，I为ε亚基抗体，2为链霉亲和素(Strptavidin)，3为N-biotin，4为toxR探针，5为副溶血性弧菌单链DNA。附图2为chix) toxR对不同种菌株的检测结果，纵坐标表示荧光值，横坐标表示检测的样本，其中I为水，2为副溶血性弧菌，3为沙门氏菌，4为单增李斯特氏菌，5为霍乱弧菌，6为大肠杆菌。附图3为chro toxR对30株副溶血性弧菌样本的检测结果，纵坐标表示荧光值，横坐标表示检测的样本,I 30为食品检测样本编号。
具体实施例方式根据沙门氏菌toxR基因设计特异性核酸探针5’_gtcttctgacgcaatcgttg,其中探针的5’用生物素进行标记。将该探针通过生物素抗体连接在分子马达上面，利用分子马达生物传感器即可对待测样本的DNA进行检测，当样品为副溶血性弧菌DNA时，检测体系的荧光值会发生明显的变化，通过这一变化即可判断样本为阳性。为此，我们设计了一个试剂盒，可以方便、快速对食品中的副溶血性弧菌进行检测。试剂盒组成:
权利要求
1.本发明要求保护的内容有:特异性核酸探针与FtlF1-ATP合酶连接的方式:在FtlF1-ATP合酶的ε亚基上依次连接ε亚基抗体、生物素、链霉亲和素、生物素标记的toxR探针。
2.试剂盒检测体系的反应条件:37°C恒温摇床中温育30min。
3.合成buffer、启动buffer、PBS的配方。合成buffer:甘油20%,氯化镁5mM, Tricine50mM,憐酸氢二钾 5mM ;启动 buffer:ADP (1.6mM):上述合成 buffer =1: 3 (v/v) ；PBS:137mM氯化钠，2.7 mM氯化钾，IOmM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钾。
全文摘要
一种用于检测副溶血性弧菌的分子马达生物传感器试剂盒属于食品微生物快速检测领域，主要解决传统检测方法时间过长(约4天)。本发明的核心技术是利用载色体Chromatophore上的F0F1-ATPase分子马达生物传感器，F0F1-ATP合酶由于能快速地旋转，通过旋转它建立了催化位点与质子转运之间的偶联。首先在ATP合酶的ε亚基上连接toxR探针，将待测样品和阴性对照分别与生物传感器结合后，比较其催化ATP合成30分钟后的ATP产生量，ATP合成的多寡可以通过环境中H+的量进行测量，而H+的多寡通过H-DHPE所体现的荧光强度大小来获得。本试剂盒可对待测样本中的副溶血性弧菌进行快速、灵敏、高通量的检测。
文档编号C12Q1/68GK103074413SQ20111032691
公开日2013年5月1日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者张捷, 张惠媛, 张昕, 汪琦, 顾德周, 陈广全 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局