专利名称：高产β-半乳糖苷酶的酵母菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及高产β-半乳糖苷酶的酵母菌株及其应用，特别是一株经过离子束注入诱变选育获得的能够高产β -半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)菌株及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术：
低聚半乳糖(Galactooligosaccharides, G0S)是一种具有天然属性的功能性低聚糖，其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1-7个半乳糖基。在自然界中，动物的乳汁中存在微量的G0S，而人母乳中含量较多，婴儿体内的双歧杆菌菌群的建立很大程度上依赖母乳中的GOS成分。低聚半乳糖具有双歧杆菌增殖效果好、生产原料来源广、耐酸耐热性能好等优点。目前，生产低聚半乳糖的厂家主要在日本，国内低聚半乳糖尚未形成规模生产，大部分处在研究阶段。β -半乳糖苷酶(又称乳糖酶)是制备低聚半乳糖的关键酶制剂，它能在特定的条件下水解β -D-半乳糖苷键，将乳糖水解成a -D-葡萄糖和β -D-半乳糖，β -半乳糖苷酶同时也具有半乳糖苷转移作用，能把半乳糖连接到半乳糖和葡萄糖上，生成低聚半乳糖。β -半乳糖苷酶一般都是从微生物中得到，根据不同来源可分为胞内水解酶和胞外水解酶，其中黑曲霉、米曲霉和米根霉等所产生的β_半乳糖苷酶均为胞外水解酶，脆壁克鲁维酵母和大部分细菌所产生的半乳糖苷酶均为胞内水解酶。自然界分离出的菌种生产能力低，故而β_半乳糖苷酶的产量往往不能满足工业上的需要。因此，人工诱变方法常用于菌种选育，以获得高产目标代谢物的优良菌株，紫外诱变、化学诱变以及两者复合诱变是常用的诱变源。离子束注入与传统诱变源相比，除了具有能量沉积效应外，还有动量传递、质量沉积及电荷的中和与交换效应，能够在低剂量注入、细胞损伤较轻的情况下，诱发生物细胞的生理、生化性能和碱基改变，引起染色体结构变异。王岁楼等(食品科学，2009，Vol. 30，No. 05,135-140)用低能N+注入黏红酵母高压突变株，使其β -胡萝卜素产量由出发菌株的9.64mg/L提高到17. 36mg/L，增加了 80.08%。王菊芳等(原子核物理评论，第26卷，第3期)利用C离子束对高产酒精酵母菌株进行了辐照诱变，得到5株产酒精能力提高的突变酵母菌，T4突变株的产酒精能力比原始出发菌株提高了 18. 6%。胞内酶的分离提取技术属于生物工程下游技术，一般包括细胞破碎、酶与细胞碎片分离、酶纯化、酶浓缩等步骤。专利文件CN1916170A(申请号200610010516. X)介绍了一种中性乳糖酶的提取方法，包括酶法预破壁处理、冻融破壁、高压匀浆破壁三道工序，但是该方法工艺设备要求高、生产成本高，很难满足工业化生产的要求。本发明中的β_半乳糖苷酶为胞内酶，β -半乳糖苷酶高效、低成本分离提取技术是实现低聚半乳糖产业化的必要条件。β -半乳糖苷酶对乳糖的水解、转苷反应存在产物抑制现象，导致乳糖水解率低、低聚半乳糖含量不符合要求等问题，后续常需要增加膜分离、色谱分离或进一步发酵等工序来提高低聚半乳糖含量，这些工序降低了产品收率，使生产成本大幅度增加。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株高产β_半乳糖苷酶的酵母菌株及其应用。发明概述本发明通过离子束注入方法诱变选育一株高产β -半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22,产酶量达到出发菌株的5倍,经3吨发酵罐培养后酶活仍能保持较高水平；开发出胞内半乳糖苷酶的高压均质、膜过滤分离提取技术；并通过一步酶转化乳糖溶液获得低聚半乳糖组分大于60%的产品。本发明突破了低聚半乳糖生产中关键环节的瓶颈问题，大幅度降低了生产成本，具有良好的工业化价值。发明详述 —株高产β -半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22，该菌株2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No. 5293。上述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22在制备β -半乳糖苷酶中的应用。所述应用，步骤如下(I)取脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22接种至斜面培养基，在温度28-30°C培养14-38小时，然后用生理盐水将菌种从斜面培养基洗下，得菌液；(2)将步骤⑴制得的菌液接种至种子培养基，在温度28-30 °C、压力O. 05-0. 15MPa、溶解氧饱和度2% -40%的条件下，培养时间10_38h，得种子液；(3)将步骤(2)制得的种子液接种至发酵培养基，在28_30°C、压力O. 03-0. 15MPa，溶氧量1% -40%的条件下，培养时间10-40h，得发酵液；(4)将步骤(3)制得的发酵液分离菌体后，破碎菌体，然后用截留分子量为50，000-300，OOODa的卷式超滤膜过滤，取滤液即为β -半乳糖苷酶酶液。所述步骤(I)中的斜面培养基组分如下酵母膏l-15g/L，蛋白胨l-30g/L，葡萄糖10_40g/L，磷酸氢二钠O. 5_2g/L，琼脂20g/L, pH 5. 0-7. O。所述步骤(2)中的种子培养基组分如下酵母膏l-15g/L,蛋白胨 l-30g/L,葡萄糖 10_40g/L,磷酸氢二钠 O. 5_2g/L, pH
5.0_7· O ο所述步骤(3)中的发酵培养基组分如下酵母膏l_15g/L，蛋白胨 l_30g/L，乳糖 10_40g/L，pH 5. 0-7. O。所述步骤(4)中的分离菌体，发酵液在离心力2000g_8000g的条件下离心，取沉淀，O. 01-0. 5M磷酸盐缓冲液悬浮，即得β -半乳糖苷酶酶液。所述步骤(4)中的破碎菌体是指在均质压力30MPa_100MPa的条件下，经均质机破碎获得；或者，在冰水浴、400-750W的条件下，超声波处理。上述超声波处理，步骤为超声波处理3_4s、停止超声波处理10-12s，重复该处理步骤15-25次。间歇时间大于处理时间，有利于保护酶的活性。上述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22在制备低聚半乳糖中的应用。所述应用，步骤如下(I)将上述步骤制得的β -半乳糖苷酶酶液加入至浓度为200_550g/L乳糖溶液中，β -半乳糖苷酶的加入量为每克乳糖添加5-40U，pH 5. 0-7. 5，得混合液；(2)将步骤⑴制得的混合液在30_50°C的条件下，反应20_45h，得低聚半乳糖粗液；(3)将步骤⑵制得的低聚半乳糖粗液经灭酶活、脱色过滤、离交、浓缩，得低聚半乳糖。最终制得的低聚半乳糖中，固形物含量大于75wt%、低聚半乳糖组分高于 60wt%。本发明的有益效果 I、本发明所述高产β_半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)菌株BLB-22经离子束注入诱变获得，菌株生产性状稳定，经过20代传代转接，酶活仍保持筛选后水平；克服了现有菌株半乳糖苷酶产量低、低聚半乳糖制备成本高的缺陷，具有良好的工业化价值。2、本发明采用高压均质、膜过滤组合方法分离提取胞内β -半乳糖苷酶，酶活损失少，工艺简单，酶的分离提取成本大大降低。3、本发明采用一步酶转化工艺制备低聚半乳糖含量大于60wt%的产品，省去膜分离、色谱分离或进一步发酵等工序，提高了产品收率，极大降低了生产成本。
图I是实施例I制得的低聚半乳糖成品HPLC色谱具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例中所述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22于2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No. 5293。实施例I野生型脆壁克鲁维酵母菌株的获得从北京某奶牛厂奶牛鲜乳中筛选得到脆壁克鲁维酵母菌株，操作方法如下(I)取5mL鲜乳样品，加入以乳糖为唯一碳源的50mL富集选择培养基中，28_30°C富集培养48h ;用灭菌生理盐水以10倍的稀释梯度对样品进行稀释。选取10_3、10_5、10_7三个稀释梯度，分别吸取O. 2mL样品稀释液均匀涂布于富集选择平板培养基上，28°C培养72h，得酵母菌落；上述富集选择培养基，组分为乳糖15g/L，土豆汁200g/L，pH 6. 5-7. 0，上述富集选择平板培养基，组分为乳糖15g/L，土豆汁200g/L，琼脂20g/L，pH
6.5-7. O ；(2)挑取步骤(I)制得的酵母菌落，通过平板划线进行分离纯化，重复三次，得到纯化菌株；
(3)将步骤(2)制得的纯化菌株分别接种于产酶发酵培养基中，28_30°C摇床培养20h,摇床转速150rpm,得菌液；所述产酶发酵培养基为乳糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，磷酸氢二钠2g/L, pH 6. 5-7. O ；(4)取50mL步骤(3)制得的菌液以5，OOOrpm离心5分钟，收集细胞，并用5mL生
理盐水悬浮，得细胞悬液；(5)将步骤(4)制得的细胞悬液50 μ L与lmg/mL邻硝基苯酚_ β -D半乳糖苷(O-nitrophenyl- β -D-galactopyranoside, 0NPG)溶液按菌细胞悬液ONPG 溶液=I : 20的比例混合(v/v)，35°C反应15分钟，得反应液；(6)向步骤(5)制得的反应液中加O. 15mol/L Na2CO3溶液2mL终止反应，以10，OOOrpm离心5分钟,收集上清液； (7)如果上清液呈黄色，说明原无色的ONPG被β -半乳糖苷酶水解成了黄色的邻硝基苯酚，即证明该菌细胞含有β -半乳糖苷酶，即为产β -半乳糖苷酶菌株；并将该产β -半乳糖苷酶菌株接种至斜面培养基，28°C培养48h，置4°C冰箱保藏，得野生型脆壁克鲁维酵母菌株；所述斜面培养基为葡萄糖40g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，磷酸氢二钠2g/L，琼脂 20g/L，pH 6. 5-7.0。脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22的筛选取上述经斜面培养的野生型脆壁克鲁维酵母菌株，用无菌水制成IO5细胞悬液，将0. 5ml细胞悬液分装于无菌平皿内，无菌风吹干，在微生物专用小室内进行低能离子束注入处理，离子束参数为注入离子为N+，能量为50Kev，剂量为300X 1013ions/cm2，将经过离子束处理的菌液用无菌水稀释100倍后，取0. ImL涂平板(组分酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L，磷酸氢二钠2g/L，琼脂20g/L，pH 6. 5)，30°C培养36h。从中挑取单菌落转接于装有50mL液体发酵培养基的500mL摇瓶中，于30°C，200rpm旋转摇床培养20h，离心收集菌体，用0. IM磷酸盐缓冲液稀释菌体细胞至IO9倍，该细胞悬液用超声波破碎，超声条件在冰水浴、500W的条件下，超声波处理3s、停止超声波处理12s，然后重复该处理步骤15个循环；离心，测定上清液中β_半乳糖苷酶酶活(经试验数据比对，高压均质和超声波对酵母细胞均有较好的破碎效果，两种方法获得的酶活无显著差异，摇瓶筛选阶段采用超声波破碎提取半乳糖苷酶可缩短试验时间，提高筛选效率)。经过4批次的诱变筛选，正突变率10.7% -20. 3%，酶活单位比出发菌株提高2. 5-4. O倍，结果如表I所示。表I诱变前后菌株产酶量变化
批次出发菌株酶活正突变率诱变后最高酶活
127U/mL16.5%81U/mL
218U/mL20.3%45 U/mL
322 U/mL13.8%115 U/mL
432 U/mL10.7%104U/mL
酶活测定方法取2ml ONPG(邻硝基苯β -D-半乳吡喃糖苷)，固体4°C避光保存，用pH7. O的缓冲液配成lmg/mL ;于35°C预热IOmin,加O. 5ml酶液准确反应15min,加
O.15MNa2C03溶液2. 5ml终止反应，放置2_3min，420nm测吸光度。结果如图I所示。酶活计算公式Y = 3. 25ΑΧΝ(Α :吸光度，Y :酶活，单位U/mL，N :酶液稀释倍数)。将诱变后获得的酶活为115U/mL的菌株在斜面培养基中进行20代转接培养，经测定酶活仍高达110U/mL，经3吨发酵罐培养后酶活仍能保持较高水平。该菌株2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCCNo. 5293。实施例2
上述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22在制备β -半乳糖苷酶中的应用，步骤如下(I)将保藏号为CGMCC No. 5293的脆壁克鲁维酵母菌株BLB-22进行斜面培养，斜面细胞用生理盐水洗下接入三角瓶中，得菌液；(2)在无菌状态下将步骤(I)制得的菌液接入发酵罐中的种子培养基，种子培养基组分为酵母膏10g/L,蛋白胨20g/L,葡萄糖40g/L,磷酸氢二钠2g/L,pH 6.5。种子罐为30L外循环气升式发酵罐，培养温度30°C，罐压O. IMPa，通气量lm3/h，溶解氧饱和度20%，培养时间30h,得一级种子液；将上述一级种子液用无菌空气压入二级发酵罐中的种子培养基中，二级种子罐为300L外循环气升式发酵罐，培养温度30°C，罐压O. IMPa，通气量8mVh，培养时间30h，得种子液；(3)将步骤(2)制得的种子液用无菌空气压入发酵培养罐中的发酵培养基，发酵培养基组分为酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH 6. 5。发酵罐为3吨外循环气升式发酵罐，培养温度30°C，罐压O. IMPa,通气量80m3/h，溶解氧饱和度20 %，培养时间30h，得发酵液；(4)将步骤(3)制得的发酵液泵入碟式离心机，离心力5000g，离心后获得的菌体用其重量5倍的O. IM磷酸盐缓冲液稀释，得到细胞悬液，细胞悬液经均质机破碎，使胞内半乳糖苷酶游离出来，均质压力维持在55MPa-60MPa。均质后料液用截留分子量为300, OOODa的卷式超滤膜过滤，除去酵母细胞碎片，得到β _半乳糖苷酶酶液。酶活经测定达到110U/mL，测定方法同实施例I。实施例3上述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株在制备低聚半乳糖中的应用，步骤如下(I)配制浓度为400g/L的乳糖溶液，加入实施例2制得的β -半乳糖苷酶酶液，β -半乳糖苷酶的加入量为每克乳糖添加10U，调pH 6. 0，得混合液；(2)将步骤(I)制得的混合液在35_45°C的条件下，反应28h，HPLC测定低聚半乳糖组分达到63wt%后，得低聚半乳糖粗液；(3)将步骤(2)制得的低聚半乳糖粗液盐酸调节料液pH至6. 0，添加粉末活性炭，70°C维持30min，达到灭酶、脱色效果，料液经板框过滤机压滤除去不溶物。料液分别用强酸性阳离子-弱碱性阴离子-强酸性阳离子交换树脂脱盐，控制出料电导彡100 μ s/cm,出柱pH2. 8-3. 8。离交后料液经双效蒸发器浓缩固形物至75wt%，经测定成品中低聚半乳糖含量为61. 7wt%，结果见表2，各项指标符合卫生部公告(2008年第20号)对低聚半乳糖的要求。表2低聚半乳糖成品中主要组分及其含量
组分保留时间(mill)峰面积含量(％)
单糖4.10778285.44523.9
乳糖4.69040677.33612.5
转移二糖4.89874703.61722.8 三糖5.53259157.10918.1
四糖5.93214012.4774.3
五糖6.13230223.1769.3
六糖6.93228631.3317.2
低聚半乳糖含量(wt%)61.权利要求
1.高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22,该菌株2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No. 5293。
2.权利要求I所述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)菌株BLB-22在制备β-半乳糖苷酶中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下 (1)取脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)菌株BLB-22接种至斜面培养基,在温度28-30°C培养14-38小时，然后用生理盐水将菌种从斜面培养基洗下，得菌液； (2)将步骤(I)制得的菌液接种至种子培养基，在温度28-30°C、压カO.05-0. 15MPa、溶解氧饱和度2% -40%的条件下，培养时间10-38h，得种子液； (3)将步骤⑵制得的种子液接种至发酵培养基，在28-30°C、压カO.03-0. 15MPa，溶氧量1% -40%的条件下，培养时间10-40h，得发酵液； (4)将步骤(3)制得的发酵液分离菌体后，破碎菌体，然后用截留分子量为50，000-300，OOODa的卷式超滤膜过滤，取滤液即为β -半乳糖苷酶酶液。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(I)中的斜面培养基组分如下 酵母膏l-15g/L，蛋白胨l-30g/L，葡萄糖10-40g/L，磷酸氢ニ钠O. 5_2g/L，琼脂20g/L，pH 5. 0-7. O。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中的种子培养基组分如下 酵母膏l-15g/L，蛋白胨l_30g/L，葡萄糖10-40g/L，磷酸氢ニ钠O. 5_2g/L，pH5.0_7· O ο
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中的发酵培养基组分如下 酵母膏 l_15g/L，蛋白胨 l_30g/L，乳糖 10-40g/L，pH 5. 0-7. O。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中的分离菌体，发酵液在离心力2000g-8000g的条件下离心，取沉淀，O. 01-0. 5M磷酸盐缓冲液悬浮，即得。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中的破碎菌体是指在均质压力30MPa-100MPa的条件下，经均质机破碎获得；或者，在冰水浴、400-750W的条件下，超声波处理；优选的，上述超声波处理，步骤为超声波处理3-4s、停止超声波处理10-12S，重复该处理步骤15-25次。
9.权利要求I所述脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)菌株BLB-22在制备低聚半乳糖中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤如下 (1)将权利要求3制得的β-半乳糖苷酶酶液加入至浓度为200-550g/L乳糖溶液中，β -半乳糖苷酶的加入量为每克乳糖添加5-40U，pH 5. 0-7. 5，得混合液； (2)将步骤(I)制得的混合液在30-50°C的条件下，反应20-45h，得低聚半乳糖粗液； (3)将步骤(2)制得的低聚半乳糖粗液经灭酶活、脱色过滤、离交、浓缩，得低聚半乳糖。
全文摘要
本发明涉及一株高产β-半乳糖苷酶的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)菌株BLB-22及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。该菌株2011年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.5293。其产酶量达到出发菌株的5倍，经3吨发酵罐培养后酶活仍能保持较高水平；本发明还提供胞内β-半乳糖苷酶的高压均质、膜过滤分离提取技术；并通过一步酶转化乳糖溶液获得低聚半乳糖组分大于60wt％的产品。本发明突破了低聚半乳糖生产中关键环节的瓶颈问题，大幅度降低了生产成本，具有良好的工业化价值。
文档编号C12R1/645GK102851220SQ20111032700
公开日2013年1月2日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者刘宗利, 王乃强, 刘海玉, 栾庆民, 郭恒新, 李方华 申请人:保龄宝生物股份有限公司