专利名称：一种重组人α干扰素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种干扰素的制备方法，特别是涉及一种应用柱上复性的方法制备重组人α干扰素的方法。
背景技术：
干扰素是由细胞分泌的小分子多肽，具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。是当今应用前景较为广阔的生物治疗药物之一，是迄今为止最早应用基因工程技术进行大规模商业化生产，并经长期临床应用验证的第一个细胞因子。按照干扰素的生化特性及在机体免疫方面所发挥的不同作用，被分为α、β、γ等三类。目前市场上应用最多的干扰素是重组人α干扰素。
通过细菌表达制备干扰素α的方法是已知的。常规方法基于蛋白质在大肠杆菌(E.Coli)中表达后以包涵体的形式或直接存在于细胞质中。对于以包涵体形式存在的干扰素，由于蛋白分子不能正确折叠而没有生物活性，必须从细胞内分离出包涵体，采用高浓度变性剂溶解包涵体，然后除去变性剂或降低变性剂的浓度，使包涵体蛋白得以复性，再进行离子交换层析、亲和层析、反相高效液相层析、分子排阻层析等步骤纯化才能获得可用于临床的制品。其中包涵体蛋白的复性和纯化是整个过程中的核心。
目前重组蛋白生产中普遍存在的问题是(1)复性效率低。传统的复性方法包括稀释法和透析法。稀释复性法对样品几十倍，甚至上百倍的稀释会使样品的体积急剧增大，给后续的分离纯化带来很大的困难，而且复性过程中需要较大的复性容器。透析法耗时较长，而且要多次更换透析溶液。这两种方法的共同缺点是蛋白质在复性过程中会发生聚集而产生大量沉淀，复性效率低，通常蛋白质的活性回收率只有5～20％，而且复性后的蛋白质溶液中含有大量的杂蛋白，需要进行进一步的分离纯化。(2)生产成本高，设备投资大。由于复性和分离纯化分别单独进行，而且分离纯化步骤多，每一步都需要有与之配套的设备，致使设备投资大，生产成本高。随着生产规模的增加，这种弊端会愈来愈严重。
上世纪九十年代初，我国首先有报道将高效疏水相互作用色谱(HPHIC)用于变性蛋白的复性，很好的解决了上述问题，现已成功用于重组人干扰素γ、重组人粒细胞集落刺激因子、重组牛朊病毒等重组蛋白的纯化工艺中。此后，排阻色谱法、离子交换色谱法和亲合色谱法也有用于蛋白质的复性和同时纯化中。但应用金属螯合色谱法对重组人α干扰素同时进行复性和纯化的方法尚未见报道。金属螯合色谱法应用金属离子Cu2+、Zn2+或Ni2+等可以与蛋白质分子中的色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成配价键的原理，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附。
与传统的稀释法及透析法比较，用金属螯合色谱法进行干扰素复性的优点是①在进样后可很快除去变性剂；②由于金属离子对变性蛋白质的吸附，可明显地减少、甚至完全消除复性过程中蛋白质聚集体和沉淀的产生，从而提高蛋白质复性的质量，显著降低聚体和单体杂质含量；③在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白分离以达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；④便于回收变性剂，以降低废水处理成本。简言之，金属螯合色谱法复性可以提高重组人干扰素α的纯度、降低杂质含量，将蛋白复性和纯化集成在一步操作完成，缩短了操作步骤和生产时间，减少了设备投资，使生产成本大大降低。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备干扰素的方法。本发明进一步提供一种应用柱上复性的方法制备重组人α干扰素的方法。
具体步骤包括1)细菌细胞的发酵，2)包涵体的提取和纯化，3)金属螯合色谱法复性和纯化包涵体，4)反相高效液相层析，5)离子交换层析，6)凝胶排阻层析。
本发明要求保护的方法用于制备重组人干扰素α2a，但对重组人干扰素α2b和重组人干扰素α1b等其它α型重组人干扰素也同样有效。
本发明不限于使用大肠杆菌，也包括使用能够表达包涵体形式的异源蛋白的任何原核微生物。
本发明的另一目的是依靠本方法可获得重组人α干扰素，其含有的细菌污染物不高于0.0005％，且其它聚体或单体形式的杂质不高于1.0％。
发明详述表达重组人α干扰素的大肠杆菌基因工程菌株按照常规方法获得。简要描述如下将人α干扰素基因片段连接入商业化原核表达质粒中，这些质粒包括但不限于pTrc、pBAD、pTac、pET、pT7、pL等；将重组质粒转染入宿主菌，这些宿主菌包括但不限于DH5α、JM109、JM103、HB101等。
步骤1发酵本发明方法中进行发酵的菌株在使用之前以冷冻干燥物形式保存以维持其表达能力。使用时，用适当缓冲溶液溶解后接种于固体培养基上，扩大至所需要量后开始发酵。
发酵条件包括合适的培养基、温度、pH值、溶解氧等。发酵培养基是商业化且可以有效使用的已知培养基。优选的是含有蛋白胨、酵母提取物、甘油、磷酸缓冲盐等的混合培养基。培养基中添加一种或几种抗生素。优选的是50-200μg/ml的氨苄青霉素。发酵温度是适宜原核微生物生长的30-42℃。本发明中优选的是37℃。发酵期间pH应保持在中性(6.4-7.4)。发酵过程中罐压为常压，溶解氧保持在20-60％，优选的是50％。由于在搅拌下进行发酵，优选使用消泡剂。
发酵过程中，随着微生物生长，培养物的光密度增加。根据光密度可以监测发酵进展程度。通常选择测量光密度的波长为600nm。本发明的方法中，将微生物培养至对数期时开始诱导表达。通常微生物在这一时期600nm的光密度可达到1以上，本发明中优选的是光密度达到15以上时开始诱导。根据所选用的质粒，诱导的方法包括加入诱导剂或改变培养温度。诱导时间2-10小时，本发明中优选的是加入诱导剂异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导3-6小时。
诱导结束后，离心培养物，取细胞进行下列步骤。
步骤2提取和纯化包涵体表达的重组人α干扰素以不溶解的包涵体的形式存在于细胞质中。因此，本发明提供了细胞裂解、包涵体回收和洗涤。
洗涤细胞并悬浮于适当的缓冲液中，优选含有0.001mol/L乙二胺四乙酸及其钠盐(EDTA)和二硫苏糖醇(DTT)的中性或弱碱性(pH6.5-9.0)缓冲液。用冻/融、弗氏压碎器、超声处理或其它类似已知技术裂解细胞。向裂解后的细胞悬浮液中加入上述缓冲液。低温(2-10℃)高速(10000-15000rpm)离心10-40分钟，弃掉上清液，沉淀用上述缓冲液悬浮。重复离心和悬浮步骤。获得的包涵体用含有DTT的变性剂溶解。本发明中优选的是含有0.001mol/L DTT的8mol/L尿素(pH6.5-9.0)。
步骤3包涵体的复性和纯化溶解的包涵体装入金属螯合层析柱。可以使用任何商业化的金属螯合层析介质，只要其容量、填料和流速的特征类似于Copper Chelate Sepharose层析柱、Zinc Chelate Sepharose层析柱等。本发明优选的是Copper Chelate Sepharose层析柱。应用含有DTT的变性剂洗涤并平衡该色谱柱，复性是通过降低变性剂的浓度并在适当浓度的氧化剂存在下实现的。本发明中优选的是用5-20倍柱体积的线性梯度由8mol/L尿素-0.001mol/L DTT过渡到0.05mol/L尿素-0.005mol/L谷胱苷肽，最后用0.15mol/L NaCl(pH2.5)洗脱蛋白。通过测定280nm的吸光度来自动监测各物质的洗脱。
步骤4反相高效液相层析收集富含活性形式的重组人α干扰素的来自前面步骤的组分装入反相高效液相层析(RP-HPLC)柱上。可以使用任何商业化反相高效液相层析介质，只要其容量、填料和流速的特征与本发明所述方法条件相容。本发明中优选的是C18。应用有机溶剂梯度洗脱可以实现单体或聚体杂质及其它细菌污染物与目的蛋白的有效分离。本发明优选的是用5-20倍柱体积的线性梯度由0过渡到80％乙腈。
步骤5离子交换层析收集富含活性形式的重组人α干扰素的来自前面步骤的组分装入离子交换层析柱上。可以使用任何商业化离子交换层析介质，只要其容量、填料和流速的特征与本发明所述方法条件相容。本发明中优选的是Q-Sepharose或DEAE-Sepharose。应用无机盐等度洗脱可以除去部分杂质并将目的蛋白浓缩。本发明优选的是用0.1-0.3mol/L NaCl洗脱目的蛋白。
步骤6凝胶排阻层析收集富含活性形式的重组人α干扰素的来自前面步骤的组分装入凝胶排阻层析柱上。可以使用任何商业化凝胶排阻层析介质，只要其容量、填料和流速的特征与本发明所述方法条件相容。本发明中优选的是Sephacyl S-200。应用凝胶排阻的特性可以除去单体或聚体杂质并去除残余的有机溶剂或无机盐。本发明优选的是用0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗脱目的蛋白。
按照上述方法获得的重组人α干扰素中大肠杆菌污染物不高于0.0005％，纯度可达到99％以上，比活性可达到2×108国际单位/mg蛋白。
具体实施例方式
下面依靠实施例描述本发明，然而，实施例仅仅举例说明，没有限制的目的。
实施例1发酵下列步骤涉及发酵和诱导重组人α2a干扰素的方法。
材料培养基由下列组成(每1L)蛋白胨 12g酵母提取物 24g甘油 4mlKH2PO42.31g
K2HPO412.54g50％MgSO4.7H2O 4ml纯化水加适量至1L。
大肠杆菌菌株是DH5αpETIFN。
接种取一管冷冻干燥的DH5αpETIFN悬浮于1ml上述培养基中。悬液涂布LB平板，37℃培养35-50小时后接种于含50μg/ml氨苄青霉素的上述培养基中，置摇床100-300转/分、37℃培养5-10小时，再扩大至接种发酵罐的需要量。
在下列条件下实施发酵培养基上述培养基+50μg/ml氨苄青霉素+10μl/L消泡剂温度37℃溶解氧50％pH6.4-7.4诱导在下列条件下实施诱导OD600大于15诱导剂1mM IPTG诱导时间3-6小时诱导期间pH值、温度和溶解氧与发酵期间相同。
诱导结束后3000g离心20min收集菌体。
实施例2提取和纯化包涵体材料
裂解液0.05mol/L Tris.HCl-0.001mol/L EDTA-0.001mol/L DTT(pH7.5)变性溶液0.05mol/L Tris.HCl-8mol/L尿素-0.001mol/L DTT(pH7.5)超声处理裂解细胞。向裂解后的细胞悬浮液中加入裂解液。低温(2-10℃)高速(14000rpm)离心30分钟，弃掉上清液，沉淀用裂解液悬浮。重复离心和悬浮步骤3次。获得的包涵体用变性溶液溶解。
实施例3包涵体的复性和纯化材料和参数波长280nm层析介质Copper Chelate Sepharose上柱样品溶解的包涵体，体积不超过柱体积的10倍流速1cm/min缓冲液A0.05mol/L Tris.HCl-8mol/L尿素-0.001mol/L DTT(pH7.5)缓冲液B0.05mol/L Tris.HCl-0.05mol/L尿素-0.005mol/L谷胱苷肽(pH7.5)缓冲液C0.15mol/L NaCl(pH2.5)溶解的包涵体装入金属螯合层析柱。用缓冲液A洗涤并平衡该色谱柱。接着用15倍柱体积的线性梯度由缓冲液A过渡到缓冲液B，最后用缓冲液C洗脱蛋白。通过测定280nm的吸光度来收集洗脱峰。
实施例4反相高效液相层析材料和参数波长280nm层析介质C18，30μm上柱样品前面步骤(实施例3)含活性形式的重组人α干扰素的洗脱峰流速1.5cm/min缓冲液A0.1％三氟乙酸-水缓冲液B0.1％三氟乙酸-乙腈收集来自前面步骤的洗脱峰装入反相高效液相层析(RP-HPLC)柱上。用15倍柱体积的线性梯度由100％缓冲液A过渡到80％缓冲液B。通过测定280nm的吸光度来收集洗脱峰。
实施例5离子交换层析材料和参数波长280nm层析介质Q Sepharose上柱样品前面步骤(实施例4)含活性形式的重组人α干扰素的洗脱峰流速1cm/min缓冲液A0.02mol/L Tris.HCl(pH7.0)缓冲液B0.02mol/L Tris.HCl-0.15mol/L NaCl(pH7.0)收集来自前面步骤的洗脱峰装入离子交换层析柱上。用缓冲液A洗涤并平衡色谱柱，用缓冲液B洗脱目的蛋白。通过测定280nm的吸光度来收集洗脱峰。
实施例6凝胶排阻层析材料和参数波长280nm层析介质Sephcryl S-200上柱样品前面步骤(实施例5)含活性形式的重组人α干扰素的洗脱峰流速0.5cm/min缓冲液0.01mol/L PB(pH7.0)收集来自前面步骤的洗脱峰装入凝胶排阻层析柱上。用缓冲液洗涤并平衡色谱柱后洗脱目的蛋白。通过测定280nm的吸光度来收集洗脱峰。
实施例7污染物、纯度和比活性测定残余大肠杆菌蛋白测定
用抗大肠杆菌菌体蛋白抗体包被酶标板，封闭后加入样品和菌体蛋白标准品，37℃孵育2小时，洗板后加入HRP酶联抗大肠杆菌菌体蛋白抗体，37℃孵育1小时，洗板后加入底物，37℃孵育40分钟，加入硫酸终止液终止反应，将酶标板放入酶标仪中，选择492nm波长进行检测，以标准品浓度A为X值，OD492nm为Y值，输入回归方程y＝a+bx中，计算得上述制备的重组人干扰素α2a样品中菌体蛋白残留量为0.0003％。
纯度测定制备SDS-PAGE电泳胶，分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为4.5％。样品和样品缓冲液按3∶1的比例混匀后100℃水浴3-5分钟，向加样孔中加入样品10μg。以恒流10mA开始电泳，当溴酚蓝染料前沿进入分离胶后将电流调至20mA，直至溴酚蓝染料到达分离胶底部。电泳胶进行考马斯亮蓝染色。用扫描仪进行扫描处理，上述制备的重组人干扰素α2a纯度为99.6％。
比活性测定将生长24～48h的Wish细胞配成细胞浓度为2.5-3.5×105个/ml的细胞悬液，加到96孔细胞培养板上，每孔100μl。在含5％CO2的37℃孵箱中培养4-6h后，每孔加入4倍系列稀释的干扰素样品100μ1，样品稀释用含7％牛血清的RPMI1640培养液，37℃，5％CO2条件下培养18-24h。弃上清，用含3％小牛血清的RPMI1640培养液稀释的VSV病毒(100TCID50)攻击，然后于含5％CO2的37℃孵箱中培养20-24h。弃去培养板中的上清液，每孔加入50μl的结晶紫染色液，室温放置30分钟，用流水小心冲去染色液，并用滤纸吸干残留水分。每孔加入100μl脱色液脱色，测定每孔A570和A630值。用量反应平行线法计算样品活性。按Lowry法测定样品的蛋白浓度，计算样品的比活性。上述制备的重组人干扰素α2a的比活性2.3×108IU/mg蛋白。
权利要求
1.一种制备重组人α干扰素的方法，包括下列步骤1)对含有编码人干扰素α的核苷酸序列的大肠杆菌进行发酵，2)提取包涵体，3)应用亲和层析柱进行复性和纯化，4)反相高效液相层析，5)离子交换层析，6)凝胶排阻层析，其特征在于步骤(3)中包涵体的复性在亲和层析柱上完成并同时实现包涵体纯化。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的重组人α干扰素是重组人干扰素α2a。
3.根据权利要求1的方法，其中所述的亲和层析柱是金属螯合柱。
4.根据权利要求1和3的方法，其中所述的金属螯合柱是铜离子螯合柱。
5.根据权利要求1、3、4的方法，其中所述的在铜离子螯合柱上进行复性的条件是降低变性剂的浓度并添加适当的氧化剂。
6.根据权利要求1、3、4、5的方法，其中所述的变性剂是尿素，还可以是盐酸胍、十二烷基硫酸钠，其中的氧化剂是谷胱苷肽。
7.根据权利要求1的方法，其中所述的离子交换层析介质是Q-Sepharose，还可以是DEAE-Sepharose、Source 15 Q、Source 30 Q。
8.根据权利要求1的方法，其中所述的反相高效液相层析介质是C18，还可以是C4、C8、Source 15 RPC、Source 30 RPC。
9.根据权利要求1的方法，其中所述的凝胶排阻层析介质是SephacrylS-200，还可以是Sephacryl S-100、Sephacryl S-300、Superose 12、Superose 6、Sephadex G-150、Sephadex G-200、Superdex 200。
全文摘要
本发明公开了一种干扰素的制备方法。该方法包括对含有编码人干扰素α的核苷酸序列的大肠杆菌进行发酵后提取包涵体，应用亲和层析柱对包涵体进行复性和纯化，之后进行离子交换层析、反相高效液相层析和凝胶排阻层析获得高纯度的重组人α干扰素。
文档编号C12P21/02GK1876811SQ200510046590
公开日2006年12月13日 申请日期2005年6月6日 优先权日2005年6月6日
发明者陆军, 赵会林, 娄竞 申请人:沈阳三生制药股份有限公司