专利名称：以精子为载体转基因大菱鲆的电脉冲方法
技术领域：
本发明涉及海洋生物大菱鲆，具体地说是转MYOSTATIN基因大菱鲆的制作方法。
背景技术：
品种培育是人为对野生物种和现有品种进行改良。多年来生产实践表明，优质、高产和抗逆新品种的培育在水产养殖中发挥了极为重要的作用。随着遗传学和分子生物学的不断发展，从20世纪60年代开始，诱变育种、倍性育种、体细胞杂交、细胞核移植和染色体工程相继诞生，在农作物和水生生物育种方面作出了很大贡献。20世纪70年代出现的以基因工程为原理的转基因技术是育种技术的一场革命，人们可以利用分子生物学手段，改造和重建细胞的基因组，打破了种问遗传信息交流的屏障，从而能够定向地改变生物体的遗传性状。
早在Sparafora等(《Sperm cells as vectors for introducing foreign DNAinto eggs》Lavitrano M，Camaloni A，Fazio V M，et al.Genetic trans formationof mice Cell，1989，57717-723)发展精子介导DNA转移技术之前，Brackett等(《Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and itstransfer to ova through fertilization》.Brackett B，Boranska W，Sawicki W et al.Proc Natl Acad Sci USA，1971，68353-357)就证明去掉精清的兔精子能够与DNA结合，并在受精过程中将SV40的DNA转移到卵中，生产出转基因胚胎。之后，许多实验室的研究结果证实精子结合DNA的能力在各种动物中普遍存在。Sparafora等(1989)(《Sperm cells as vectors for introducing foreignDNA into eggs》Lavitrano M，Camaloni A，Fazio V M，et al.Genetic transformation ofmice Cell，1989，57717-723)首次报道用精子载体法生产出转基因小鼠。将小鼠精子与环状或线性化的pSV2CAT质粒在等渗的缓冲液中孵育15min，之后用于小鼠卵子的体外受精，受精卵在2细胞时移入受体鼠的输卵管。在受体鼠产生的250只小鼠中有30％的个体为转基因阳性，转基因不仅可以遗传给后代，而且后代尾组织和肌肉组织CAT基因的表达水平相当可观。此后，对精子载体法进行了适当的改进，已生产出许多转基因的胚胎和转基因动物，包括低等水生动物和高等哺乳动物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以精子为载体转基因大菱鲆的电脉冲方法，是将构建好的外源质粒利用电脉冲方法，以精子为在体导入大菱鲆受精卵中，获得了转基因大菱鲆。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下以精子为载体转基因大菱鲆的电脉冲方法，电脉冲参数为脉冲电压100-500V/cm，脉冲宽度20-40ms，最适脉冲次数2-8次；外源DNA浓度为0-50mg/L。
具体操作过程为，1)构建外源质粒；2)将外源质粒和精子混合，进行电脉冲操作；3)人工授精将精子和适量的等份卵混合均匀，静置孵化。
所述外源质粒的外源基因来自鱼类。
本发明的优点为本发明研究了以精子为载体电脉冲方法将外源基因转入大菱鲆受精卵中，得到了转基因大菱鲆；以精子为载体，只需处理少量的精子即可获得大量的转基因鱼；其方法简单易行，便于操作。
具体实施例方式
向动物体转外源基因的目的，是使转基因动物的所有细胞(包括体细胞和性细胞)都带有被转的外源基因。因此，只有在动物胚胎发育的早期将外源基因导入，才能实现这个目标。为了转基因鱼在水产养殖中得到应用，从生物安全性角度考虑，用来转移的基因元件组成成分应来自鱼类。
实施例11.外源质粒的构建将任何基因的cDNA片断正向克隆入表达载体中，即可进行电脉冲实验。例如用常规方法建立基因MYOSTATIN的表达体系(方法见文献《Analysis of myostatin gene structure，expression and function inzebrafish》，Cheng Xu，Gang Wu，Yonathan Zohar and Shao-Jun Du，TheJournal of Experimental Biology 206，4067-4079)，以下为简略步骤1)根据斑马鱼cDNA序列设计一对PCR引物，并分别在5’和3’引物上加入一个BamHI和aXhoI酶切位点。进行PCR。其引物如下5’-primer5’-GGATCCAACATGCATTTTACACAGGTTTT-3’，3’-primer5’-CTCGAGGGTTCATGAGCAGCCACAGCGG-3’PCR程序如下PCR反应参数为94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸3分钟；循环30次，72℃延伸10分钟；2)将PCR所得片断胶回收(回收试剂盒，见专利《牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒》)，克隆入BSSK载体(SalI酶切后回收)，然后进行蓝白斑筛选；3)将带有目的克隆的质粒用EcoRI(takara)酶切，与表达载体MSTN连接，转化，挑取单菌落进行质粒小量提取；4)将带有正向目的克隆的菌落划线纯化；5)挑取纯化后的单菌落，进行质粒的大量提取，用NotI(takara)酶切，将酶切产物纯化后即可用于电脉冲实验。
大菱鲆人工育苗技术见《大菱鲆养殖技术》(雷霁霖编著，上海科学技术出版社，2003年37-43页)2.精子的获取和人工授精为提前大菱鲜产卵以延长其生长季节，采用人工诱导和强化培育的方法。
精子采用人工挤压方法用吸管吸出至干净烧杯中，加入25倍体积的精子稀释液R(NaCl 0.65g，KCl 0.041g，无水CaCl20.012g，Na2PO40.002g，NaHCO30.02g，葡萄糖0.2g，溶于100ml蒸馏水中，用一次性细胞滤器过滤)，置于冰上。将外源DNA和精子混合，按照下述实验设计实施电脉冲(由常规电脉冲仪进行)，然后进行人工授精。待鱼卵发育至出膜时，将材料固定处理，计算外源DNA的导入率及孵化率。
人工授精电脉冲后立即将5毫升处理后的混合液(含0.2毫升精子)和10毫升卵混合，加入5毫升海水，轻轻搅拌混匀，静置5分钟后转入15℃海水孵化；其中，外源dna的用量根据所提取的质粒的浓度和相应的外源dna的浓度确定。
材料处理方法将材料(即人工授精后发育至出膜的鱼)用无菌水洗一次，加入无水乙醇，取回后立刻按照常规方法进行单个卵的DNA的提取，然后进行PCR检测；PCR反应参数为94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s；循环35次，72℃延伸10min。
检测引物为myostatin5pc primer5-CTGCAGCCCGGATCCAACATGCAT-3myostatin E2.1R primer5-CTGCCAAGACGTGACTCCTGCGTTCA-3导入率根据pcr结果，统计含有目的片断的泳道数，用该泳道数除以总的pcr泳道数。比如，总共处理材料100条，那么总的pcr泳道数即100，其中有25条泳道含有目的片断，那么其导入率即25％；孵化率孵化成功的卵数与总卵数的比值；其中，外源DNA的导入率与电脉冲参数的选择有很大的关系，故进行了电脉冲参数的一系列试验，其具体情况见方案中的(3.电脉冲参数的获得)，其中的试验顺序是按照方案中的(①脉冲电压单因子实验在脉冲次数为3，外源DNA浓度为50mg/L，脉冲宽度为20ms的条件下，脉冲电压分别为100，200，300，400V/cm时对电脉冲导入率和孵化率的影响。在此最佳的结果下进行②脉冲宽度单因子实验在外源DNA浓度为50mg/L，脉冲电压为300V/cm的条件下，脉冲宽度20，30，40ms和脉冲次数为3，5，7的正交试验。在此最佳的结果下进行③外源DNA浓度单因子实验在脉冲次数为5，脉冲宽度为30ms，脉冲电压为300V/cm的条件下，外源DNA浓度为5，10，20mg/L时对电脉冲导入率和孵化率的影响。)的先后顺序进行的。
3.电脉冲参数的获得电脉冲参数的获得是通过一系列的单因子试验获得。单因子试验如下单因子实验在脉冲间隔时间为1s的情况下，分别对脉冲电压，脉冲次数，脉冲宽度和外源DNA的浓度进行单因子实验，每个重复三次，每个单因子实验所用的精子均取自同一条雄鱼和雌鱼，且都有一个对照组。
单因子设计①脉冲电压单因子实验在脉冲次数为3，外源DNA浓度为50mg/L，脉冲宽度为20ms的条件下，脉冲电压分别为100，200，300，400V/cm时对电脉冲导入率和孵化率的影响。其结果见表1表1脉冲电压对导入率和孵化率的影响
最适脉冲电压为100-500V/cm②脉冲宽度单因子实验在外源DNA浓度为50mg/L，脉冲电压为300V/cm的条件下，脉冲宽度20，30，40ms和脉冲次数为3，5，7的正交试验其试验结果见表2和表3表2外源DNA导入率(％)实验结果
表3受精卵孵化率(％)试验结果
最适脉冲宽度为20-40ms，最适脉冲次数为2-8次；③外源DNA浓度单因子实验在脉冲次数为5，脉冲宽度为30ms，脉冲电压为300V/cm的条件下，外源DNA浓度为5，10，20mg/L时对电脉冲导入率和孵化率的影响。其结果见表4。
表4外源DNA浓度对电脉冲导入率和孵化率的影响结果
最适外源DNA浓度为0-50mg/L所以，该质粒的电脉冲参数的合适数值为最适脉冲电压为100-500V/cm，最适脉冲宽度为20-40ms，最适脉冲次数为2-8次，最适外源DNA浓度为大于0-50mg/L。
权利要求
1.以精子为载体转基因大菱鲆的电脉冲方法，其特征在于电脉冲参数为脉冲电压100-500V/cm，脉冲宽度20-40ms，最适脉冲次数2-8次；外源DNA浓度为0-50mg/L。
2.按照权利要求1所述的以精子为载体转基因大菱鲆的电脉冲方法，其特征在于具体操作过程为，1)构建外源质粒；2)将外源质粒和精子混合，进行电脉冲操作；3)人工授精将精子和适量的等份卵混合均匀，静置孵化。
3.按照权利要求1所述的以精子为载体转基因大菱鲆的电脉冲方法，其特征在于所述外源质粒的外源基因来自鱼类。
全文摘要
本发明涉及海洋生物大菱鲆，具体地说是以精子为载体转基因大菱鲆的电脉冲方法，电脉冲参数为脉冲电压100－500V/cm，脉冲宽度20－40ms，最适脉冲次数2－8次；外源DNA浓度为0－50mg/L。本发明的优点为以精子为载体，只需处理少量的精子即可获得大量的转基因鱼；其方法简单易行，便于操作。
文档编号C12N15/85GK1865439SQ20051004645
公开日2006年11月22日 申请日期2005年5月18日 优先权日2005年5月18日
发明者刘庆华, 刘婷, 谭训刚, 张培军, 徐永立 申请人:中国科学院海洋研究所