专利名称：一种生物微胶囊化的方法
技术领域：
本发明涉及细胞固定化生物方法，尤指利用调解pH值控制的海藻酸钠(Na·Alg)-壳聚糖(CS)-明胶(Gel)微胶囊化工艺，使微胶囊固定化微生物的活性保持和缓释性能维持，具体地说是一种可提高生物微胶囊缓释性能的生物微胶囊化的方法。
背景技术：
微胶囊化技术是将酶、辅酶、蛋白质等生物大分子或微生物、动植物细胞包封在一层亲水性的半透膜内所形成的珠状、椭杆状或椭球状微胶囊，使生物大分子和细胞被阻隔在微胶囊的膜内或膜外，而氧气、营养物质以及其它的小分子物质则可以自由通过微胶囊膜进行物质传递，从而达到催化、培养或免疫隔离目的的技术。目前，生物微胶囊化技术已在细胞和酶的固定化、微生物和动植物细胞的大规模培养、药物控制释放、抗癌药物筛选、蛋白质等物质的分离等领域中获得了广泛的应用。
复凝聚法是较通用的微胶囊化技术之一，适用于对非水溶性的固体粉末或液体进行包囊，实现复凝聚的必要条件是有关的两种聚合物离子的电荷相反，且离子所带电荷数恰好相等，此外，还必须调节体系的温度和盐的含量。利用复凝聚技术制备的微胶囊囊壁呈类似“三明治”的结构，胶囊强度高，外形尺寸均一，传质性能好。但通常其缓释性能较差，胶囊的半衰期短，不适合长时间使用，极大地限制了微胶囊的应用前景。
采用海藻酸钠-壳聚糖-明胶组合配方制备微胶囊，由于两次凝聚反应过程消耗的壁材溶液电荷数量不同，导致芯材酸碱度对微胶囊壁的渗透性能产生巨大影响。
发明内容
为解决上述问题，本发明采用分别调节两阶段芯材溶液pH值的办法，成功消除了因两次复凝聚进行时间不同造成的电荷不平衡，改善了微胶囊壁的结构缺陷，提高了胶囊的缓释性能，克服了生物微胶囊大规模实际应用的障碍；本发明利用调节海藻酸钠-明胶一次复凝聚和海藻酸钠-壳聚糖二次复凝聚反应体系的pH值，完善微胶囊“三明治”囊壁结构，制备缓释性能优异的生物微胶囊。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为向海藻酸钠水溶液里加入一株微生物菌体(例如菌龄为16-20h的微球菌Micrococcus sp.)液体种子(质量比20％)，在40-45℃下，通过9#针头注射器，控制下滴速度40-60滴/分钟，滴加到预先调节pH值的明胶和氯化钙混合液中，稳定3.5-5h，形成微胶囊雏形，然后在氯化钙溶液中二次钙化10-15min，最后在预先调节pH值的壳聚糖溶液中二次复凝聚反应2-3h，利用无菌生理盐水水浸泡6-24h，增殖培养，备用。
一种生物微胶囊化的方法，可按如下步骤进行具体操作1)壁材溶液配制配置质量百分比2.0％海藻酸钠的水溶液(用自来水浸润24h)，灭菌冷却(使用前于111℃下湿热灭菌30min，冷却到45℃，备用)，向其中加入其总质量20％的微生物菌液体种子，搅拌均匀；2)一次复凝聚芯材溶液配制按质量百分比配制含2.2％明胶和1.6％氯化钙的水溶液，pH＝5.5-7.0(较好为pH＝6.0-6.5，最好为pH＝6.3)，灭菌冷却(使用前于111℃下湿热灭菌30min)，备用；3)二次钙化溶液配制按质量百分比配制0.5％氯化钙的水溶液，灭菌冷却(使用前于121℃下湿热灭菌20min)，备用；4)二次复凝聚芯材溶液配制按质量百分比配制0.5％壳聚糖的水溶液，pH＝3.0-5.0(较好为pH＝3.5-4.5，最好为pH＝4.0)，灭菌冷却(使用前于111℃下湿热灭菌30min)，备用；5)微胶囊制备在40-45℃下，将壁材溶液在无菌条件下按40-60滴/分钟的速度滴入一次复凝聚芯材溶液中，不断搅拌；胶珠成型后，稳定3.5-5h；将胶珠转移到二次钙化液中，二次钙化10-15min，然后将胶珠转移到二次复凝聚芯材溶液中，进行二级复凝聚反应2-3h；利用无菌生理盐水浸泡6-24h，置于增殖培养基中，增殖培养后制得微胶囊。
本发明具有如下优点1)通过调节两次复凝聚反应体系的pH值，平衡了复凝聚反应的正负电荷量，制备得到的微胶囊形态均一，对微球菌Micrococcus sp.的固定效果优良。
2)制得的生物微胶囊壁机械强度高，长期液体环境培养，微胶囊不发生溶解现象。
3)制得的生物微胶囊具有优异的缓释性能。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1(1)微球菌Micrococcus sp.液体种子制备用接种环在固体基础培养基上接取2环Micrococcus sp.菌苔，接入到种子培养基中，在130rpm-140rpm、28℃-30℃条件下培养16-20小时，制得液体种子；[种子培养基]重量组成1.25％葡萄糖，0.25％酵母膏，0.1％NH4NO3，0.02％MgSO4·7H2O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2；(2)壁材溶液配制(质量百分比)配置2.0％的海藻酸钠水溶液，于111℃下湿热灭菌30min，无菌条件下冷却到45℃，加入上述总质量20％的Micrococcus sp.液体种子，搅拌均匀；(3)一次复凝聚芯材溶液配制(质量百分比)配置2.5％的明胶和1.6％的氯化钙混合水溶液，调节pH＝5.5，于111℃下湿热灭菌30min；(4)二次钙化溶液配制(质量百分比)配置0.5％的氯化钙水溶液，pH自然，于121℃下湿热灭菌20min；(5)二次复凝聚芯材溶液配制(质量百分比)配置0.5％的壳聚糖水溶液，调节pH＝3.0，于111℃下湿热灭菌30min；(6)微胶囊制备将壁材溶液在无菌条件下注入注射器内，利用9#针头按照30滴/分钟的速度滴入一次复凝聚芯材溶液中，不断搅拌。胶珠成型后，稳定3.5h，将胶珠转移到二次钙化液中，稳定10min，然后将胶珠转移到二次复凝聚芯材溶液中，稳定2h，用无菌生理盐水浸泡16h，置于增殖培养基中，增殖48h，制得微胶囊；[增殖培养基]重量组成3.0％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.1％牛肉膏，0.1％NH4NO3，0.02％MgSO4·7H2O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2；增殖培养将制备的微胶囊按照4％的质量浓度加入到增殖培养基中，在28-30℃、130rpm-140rpm培养条件下培养48小时，检测缓释性能。
(7)微胶囊缓释性检测取3g微胶囊水浆，置于干净的玻璃皿内，在25℃环境温度下放置，使之自然干燥，检测其4周的重量变化；微胶囊失重率小于31.5％。
实施例2与实施例1不同之处在于配制一次复凝聚芯材溶液时，调节pH＝6.5；配制二次复凝聚芯材溶液时，调节pH＝4.5；经上述步骤制得的微胶囊4周失重率小于25.1％。
实施例3与实施例1不同之处在于配制一次复凝聚芯材溶液时，调节pH＝6.3；配制二次复凝聚芯材溶液时，调节pH＝4.0；经上述步骤制得的微胶囊4周失重率小于19.4％。
权利要求
1.一种生物微胶囊化的方法，其特征在于可按如下步骤操作，1)壁材溶液配制配置质量百分比2.0％海藻酸钠的水溶液，灭菌冷却，向其中加入其总质量20％的微生物菌液体种子，搅拌均匀；2)一次复凝聚芯材溶液配制按质量百分比配制含2.2％明胶和1.6％氯化钙的水溶液，pH＝5.5-7.0，灭菌冷却，备用；3)二次钙化溶液配制按质量百分比配制0.5％氯化钙的水溶液，灭菌冷却，备用；4)二次复凝聚芯材溶液配制按质量百分比配制0.5％壳聚糖的水溶液，pH＝3.0-5.0，灭菌冷却，备用；5)微胶囊制备在40-45℃下，将壁材溶液在无菌条件下按40-60滴/分钟的速度滴入一次复凝聚芯材溶液中，不断搅拌；胶珠成型后，稳定3.5-5h；将胶珠转移到二次钙化液中，二次钙化10-15min，然后将胶珠转移到二次复凝聚芯材溶液中，进行二级复凝聚反应2-3h；利用无菌生理盐水浸泡6-24h，置于增殖培养基中，增殖培养后制得微胶囊。
2.按照权利要求1所述生物微胶囊化的方法，其特征在于一次复凝聚芯材溶液的pH＝6.0-6.5；二次复凝聚芯材溶液的pH＝3.5-4.5。
3.按照权利要求1所述生物微胶囊化的方法，其特征在于一次复凝聚芯材溶液的pH＝6.3；二次复凝聚芯材溶液的pH＝4.0。
全文摘要
本发明涉及细胞固定化生物方法，具体地说是一种可提高生物微胶囊缓释性能的生物微胶囊化的方法，向海藻酸钠水溶液里加入一株微生物菌体液体种子，在40－45℃下，通过9#针头注射器，控制下滴速度40－60滴/分钟，滴加到预先调节pH值的明胶和氯化钙混合液中，稳定3.5－5h，形成微胶囊雏形，然后在氯化钙溶液中二次钙化10－15min，最后在预先调节pH值的壳聚糖溶液中二次复凝聚反应2－3h，利用无菌生理盐水水浸泡6－24h，增殖培养，备用。本发明优点为制备得到的微胶囊形态均一，固定效果优良；制得的生物微胶囊壁机械强度高，长期液体环境培养，微胶囊不发生溶解现象，具有优异的缓释性能。
文档编号C12N11/04GK1854293SQ20051004632
公开日2006年11月1日 申请日期2005年4月27日 优先权日2005年4月27日
发明者李海波, 李培军, 鞠京丽, 张海荣, 许华夏 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所