专利名称：水和土壤中的马铃薯青枯病菌检测方法
技术领域：
本发明提供一种水和土壤中微量马铃薯青枯病菌检测方法，属于微生物技术领域。
背景技术：
马铃薯青枯病由Ralstonia solanacearum(E.F.Smith)Yabuuchi et al引起的细菌性病害，是南方马铃薯产区的主要细菌性病害。每年因此造成的产量损失大约在10％-15％，发病严重的地块产量损失达80％乃至失收，给马铃薯生产带来严重威胁。由于马铃薯青枯病为细菌性病害，植株感病是系统性侵染，而且青枯病可经水、土壤和种薯传播蔓延。在马铃薯无病种薯繁育中，水和土壤中微量细菌可能会成为健康种薯的侵染源，继而使这些带菌种薯成为历年发病和远距离传播的主要侵染源。解决这一危害的有效途径就是在马铃薯无菌种薯生产中，避免在有病菌的土壤中种植马铃薯和避免浇灌带菌水，保证种薯健康。常用的马铃薯青枯病菌鉴定检测方法如革兰氏染色法和血清学方法。革兰氏染色法需要加上对菌体形态特征进行观察，对生理生化反应特性进行测定，才能最终判定，这种检测方法需要对病原菌进行分离和纯化，试验的结果因培养温度、培养时间长短、培养基成分和确定阴性阳性的标准不同而变化，稳定性差，且费时费力，不便于生产上的应用。血清学方法尽管灵敏度有所提高，但仍然存在缺点，在与其它相近病菌的交叉反应或制备的抗血清不能和所有的待检测的某一种病菌的所有菌株杂交。随着分子生物学技术在许多领域的发展和应用，尤其是利用各种生物所特有的基因组碱基序列，而发展起来的特异性聚合酶链反应(PCR)技术的应用，大大提高了细菌检测的准确性和灵敏度，但是这种技术要足够的DNA模板浓度，实际上在某些条件下足够数量的DNA很难获得，如水体和土壤中目标菌体有时极为微量，很难获得足够的目标生物DNA用于PCR扩增。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供了一种高效、准确、灵敏的水和土壤中微量马铃薯青枯病菌的检测技术。
通过如下技术方案实现。
(1)机械离心富集A、收集水样本500-1000ml，在13000-15000rpm下离心8-10min，弃上部液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下称机械离心富集液)；B、收集土壤100-200克，碾细，过80-100目网筛，加水800-1200ml，浸渍10-16小时，搅动，取水相，在5000-6000rpm下离心5-8min，弃上清液相，加100-200ml灭菌水，冲洗沉淀物，手动振荡1-2min，在5000-6000rpm下离心1-2min，弃沉淀，取水相，在13000-15000rpm下离心8-10min，弃上清液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下称机械离心富集液)。
(2)半选择性培养基TZC培养富集取灭菌的TZC培养基(葡萄糖2.5g、蛋白胨10g、酸水解酪素1.0g、蒸馏水1000ml，使用时加0.005％氯化三苯四氮唑(TZC))80-100ml，在无菌条件下加入机械离心富集液，于28-30℃，200-250rpm下振荡培养2-3天；培养液变红色进行第(3)检测，如培养液为其他颜色，则样本中不带有马铃薯青枯病菌。
(3)健康马铃薯块接种检测培养液变红色，取300-500μl菌液接种马铃薯切块，在直径9cm的培养皿中，保湿培养于28-30℃。第4—第5天直接检查马铃薯块发病情况，如马铃薯块组织变软腐烂，其上有乳白色细菌粘液，即所检样本携带有马铃薯青枯病菌(图1)；如未发病，则在5000-8000rpm下离心培养液5min，弃上清和收集细菌。
(4)聚合酶链反应(PCR)DNA分子水平上的富集A、细菌裂解液制备取约0.5g收集到的细菌，置于1.5ml离心管中，加入400μl 1％的TritonX-100，用Parafilm封口，剧烈振荡，使固体重新悬浮，在沸水上煮沸5min，然后，置于冰上5min，4℃存放待用或直接用于PCR扩增。
B、PCR扩增以马铃薯青枯病菌Hrp基因部分区段设计特异性的引物P1(5’-GAAGAGGAACGACGGAAGC-3’)和P2(5’-CGAACAGCCCACAGACAAGA-3’)，采用下列体系和反应程序，在PCR仪上进行扩增。
25ul PCR反应体系包括10X PCR buffer 2.5μl2.5mM dNTP 2.0μl引物P1 0.2μl引物P2 0.2μlDNA模板 1.0μlTaq酶 0.1μlddH2O 19.0μl
反应程序T＝95℃ 5min C、PCR产物检测取PCR扩增产物5-10μl在1％琼脂糖凝胶中，于80-100V/cm下电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察结果，可以看到1993bp(图2)的扩增片段。即所检测的样本中含有马铃薯青枯病细菌。
本发明的有益效果是，克服了常用的马铃薯青枯病菌鉴定检测方法如革兰氏染色法和血清学方法不足。革兰氏染色法需要加上对菌体形态特征进行观察，对生理生化反应特性进行测定，才能最终判定，这种检测方法需要对病原菌进行分离和纯化，试验的结果因培养温度、培养时间长短、培养基成分和确定阴性阳性的标准不同而变化，稳定性差，且费时费力，不便于生产上的应用。血清学方法尽管灵敏度有所提高，但仍然存在缺点，在与其它相近病菌的交叉反应或制备的抗血清不能和所有的待检测的某一种病菌的所有菌株杂交。随着分子生物学技术的发展和应用，尤其是特异性聚合酶链反应(PCR)技术的应用，大大提高了细菌检测的准确性和灵敏度，但是这种技术要足够的DNA模板浓度，本发明通过三级富集法克服了现有技术的不足，在未能获得足够DNA模板浓度，如水体和土壤中目标菌体有时极为微量，很难获得足够的目标生物DNA时，仍用于PCR扩增，大大提高了检测的准确度和灵敏度。
图1是经本发明处理后，二级富集培养液接种马铃薯块发生青枯病症状。
图2是经本发明处理后，马铃薯青枯病菌DNA分子水平上PCR扩增的结果(1-马铃薯软腐病菌，2-马铃薯环腐病菌，3-不带有马铃薯青枯病菌土壤第二级富集后混合菌，4-第二级富集后，培养液颜色淡红色，培养液中带有马铃薯青枯病菌的混合菌，5-马铃薯青枯病菌标准菌株，6-井水水样第二级富集后不含马铃薯青枯病菌的混合菌，7-1kb梯度分子标记)。
具体实施例方式
实施例一1、取水样取一个饮用水的水库水500ml，在15000rpm下离心10min，弃上部液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下称机械离心富集液)。
2、半选择性培养基TZC培养富集取灭菌的TZC培养基(葡萄糖2.5g、蛋白胨10g、酸水解酪素1.0g、蒸馏水1000ml，使用时加入0.005％氯化三苯四氮唑(TZC))80ml，在无菌条件下加入机械离心富集液，于28-30℃，250rpm下振荡培养3天，培养液变红色。
3、健康马铃薯块接种检测取500μl培养液接种马铃薯切块，在直径9cm的培养皿中，保湿培养于28-30℃。第5天检查马铃薯块发病情况，结果马铃薯块组织变软腐烂，其上有乳白色细菌粘液，即所检水样本携带有马铃薯青枯病菌；与此同时，在8000rpm下离心培养液5min，弃上清和收集细菌。
4、聚合酶链反应(PCR)DNA分子水平上的富集A、细菌裂解液制备取约0.5g收集到的细菌，置于1.5ml离心管中，加入400μl 1％的TritonX-100，用Parafilm封口，剧烈振荡，使固体重新悬浮，在沸水上煮沸5min，然后，置于冰上5min，取裂解液1.0μl直接用于PCR扩增。
B、PCR扩增以马铃薯青枯病菌Hrp基因部分区段设计特异性的引物P1(5’-GAAGAGGAACGACGGAAGC-3’)和P2(5’-CGAACAGCCCACAGACAAGA-3’)，采用下列体系和反应程序，在PCR仪上进行扩增25ul PCR反应体系包括10X PCR buffer 2.5μl2.5mM dNTP 2.0μl引物P1 0.2μl引物P2 0.2μlDNA模板 1.0μlTaq酶 0.1μlddH2O 19.0μl反应程序T＝95℃ 5min C、PCR产物检测取PCR扩增产物10μl在1％琼脂糖凝胶中，于100V/cm下电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察结果，可以看到1993bp的扩增片段。即所检测的样本中含有马铃薯青枯病细菌。
实施例二
1、取水样水样来源于实例一中的同一水库，但自一马铃薯种薯企业的入水口处经紫外线处理过，取水1000ml，在15000rpm下离心10min，弃上部液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下称机械离心富集液)。
2、半选择性培养基TZC培养富集在实例一同样条件下振荡培养4天，培养液变成品红色。
3、健康马铃薯块接种检测取500μl培养液接种马铃薯切块，在直径9cm的培养皿中，保湿培养于28-30℃。第5天检查马铃薯块发病情况，结果马铃薯块未出现典型青枯病症状。在8000rpm下离心培养液5min，弃上清和收集细菌。
4、聚合酶链反应(PCR)DNA分子水平上的富集和富集产物的检测所用方法同实例一，结果仍然检测到了一条1993bp的扩增片段。表明经紫外线处理后，入水口中的水含的青枯病菌量非常低，经本发明的三级富集仍能有效地检测到马铃薯青枯病菌。
实施例三1、取土样自一发生马铃薯青枯病的地块耕作层5cm深土壤100g和200g及一荒坡上表层5cm深土壤100g和200g，碾细，过80目网筛，加水1200ml，浸渍16小时，搅动，取水相，在6000rpm下离心8min，弃上清液相，加200ml灭菌水，冲洗沉淀物，手动振荡2min，在5000rpm下离心2min，弃沉淀，取水相，在15000rpm下离心8min，弃上清液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下称机械离心富集液)。
2、半选择性培养基TZC培养富集同实例一培养条件，发生马铃薯青枯病地块的耕作层5cm深土壤100g和200g及一荒坡上表层5cm深土壤100g和200g，培养3天后的培养液颜色分别为发生马铃薯青枯病地块的耕作层的两个样本全变红色，荒坡地表层土5cm深土壤的两个样本未变红色，而呈半混浊状。
3、健康马铃薯块接种检测同实例一的第5天检查马铃薯块发病情况，结果来自发生马铃薯青枯病地块的耕作层5cm深土壤100g和200g的两个样本接种菌液使马铃薯块组织变软腐烂，其上有乳白色细菌粘液，即所检水样本携带有马铃薯青枯病菌；而来自荒坡上表层5cm深土壤100g和200g的两个样本未见发病。与此同时，在8000rpm下离心培养液5min，弃上清和收集细菌。
4、聚合酶链反应(PCR)DNA分子水平上的富集和富集产物的检测所用方法同实例一，结果在来自发生马铃薯青枯病地块的耕作层5cm深土壤100g和200g的两个样本检测到了一条1993bp的扩增片段，而在来自荒坡上表层5cm深土壤100g和200g的两个样本中未见到这一1993bp的扩增片段。表明采用土壤中马铃薯青枯病菌三级富集检测法，发生马铃薯青枯病地块的耕作层土壤中两个土样均检测到马铃薯青枯病菌，荒坡上表层5cm土壤中两个土样均不带青枯病菌。
权利要求
1.一种水和土壤中的马铃薯青枯病菌检测方法，其步骤如下(1)机械离心富集A、收集水样本500-1000ml，在13000-15000rpm下离心8-10min，弃上部液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下称机械离心富集液)；B、收集土壤100-200克，碾细，过80-100目网筛，加水800-1200ml，浸渍10-16小时，搅动，取水相，在5000-6000rpm下离心5-8min，弃上清液相，加100-200ml灭菌水，冲洗沉淀物，手动振荡1-2min，在5000-6000rpm下离心1-2min，弃沉淀，取水相，在13000-15000rpm下离心8-10min，弃上清液相，保留下部沉淀物和少量液相1-5ml(下称机械离心富集液)；(2)半选择性培养基TZC培养富集取灭菌的TZC培养基80-100ml，在无菌条件下加入机械离心富集液，于28-30℃，200-250rpm下振荡培养2-3天；培养液变红色进行第(3)检测，如培养液为其他颜色，则样本中不带有马铃薯青枯病菌；(3)健康马铃薯块接种检测培养液变红色，取300-500μl菌液接种马铃薯切块，在直径9cm的培养皿中，保湿培养于28-30℃，第4至第5天直接检查马铃薯块发病情况，如马铃薯块组织变软腐烂，其上有乳白色细菌粘液，即所检样本携带有马铃薯青枯病菌；如未发病，则在5000-8000rpm下离心培养液，弃上清和收集细菌；(4)聚合酶链反应(PCR)DNA分子水平上的富集A、细菌裂解液制备取约0.5g收集到的细菌，置于1.5ml离心管中，加入400μl1％的TritonX-100，用Parafilm封口，剧烈振荡，使固体重新悬浮，在沸水上煮沸5min，然后，置于冰上5min，4℃存放待用或直接用于PCR扩增。B、PCR扩增以马铃薯青枯病菌Hrp基因部分区段设计特异性的引物P1(5’-GAAGAGGAACGACGGAAGC-3’)和P2(5’-CGAACAGCCCACAGACAAGA-3’)，采用下列体系和反应程序，在PCR仪上进行扩增25ul PCR反应体系包括10X PCR buffer 2.5μl2.5mM dNTP 2.0μl引物P1 0.2μl引物P2 0.2μlDNA模板 1.0μlTaq酶 0.1μlddH2O 19.0ul反应程序T＝95℃ 5min C、PCR产物检测取PCR扩增产物5-10μl在1％琼脂糖凝胶中，于80-100V/cm下电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察结果，可以看到1993bp的扩增片段，即所检测的样本中含有马铃薯青枯病细菌。
2.根据权利要求1所述的水和土壤中马铃薯青枯病菌检测方法，其特征是，所述半选择性TZC培养基由葡萄糖2.5g、蛋白胨10g、酸水解酪素1.0g、蒸馏水1000ml构成，使用时加入氯化三苯四氮唑(TZC)至终浓度为0.005％。
全文摘要
本发明为一种水和土壤中的马铃薯青枯病菌检测方法。它采用机械离心富集，TZC半选择性培养基培养富集和DNA分子水平上的PCR扩增富集等三级富集方法，检测水和土壤中的马铃薯青枯病菌。它灵敏、准确，在马铃薯无病种薯繁育和大田生产上有广泛应用前景。
文档编号C12Q1/02GK1793867SQ20051004873
公开日2006年6月28日 申请日期2005年12月22日 优先权日2005年12月22日
发明者何月秋, 赵明富, 姬广海, 周惠萍 申请人:云南农业大学