专利名称：烟草扭脉病毒检测方法
技术领域：
本发明涉及一种快速、灵敏、特异检测烟草扭脉病毒(TVDV)的方法，属植物保护领域。
背景技术：
烟草丛顶病是近年来在全世界一些烟区频繁爆发的一种毁灭性烟草病害。烟草丛顶病由烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒复合侵染引起。烟草丛顶病症状表现为叶片出现淡褐色坏死斑，随后的新生叶片逐渐变小变圆并褪绿或黄化，植株矮缩。虽然烟草扭脉病毒单独侵染烟株无明显症状，但烟草扭脉病毒可以帮助烟草丛顶病毒进行蚜传，加重烟草丛顶病毒的危害。
指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术和分子生物学技术是常用的检测病毒的方法。因为对烟草扭脉病毒的生物学特性了解很少，未有烟草扭脉病毒的指示植物报道，无法用指示植物对烟草扭脉病毒进行检测。烟草扭脉病毒为球形粒体，主要分布在植株的韧皮部，且含量很少，很难在电镜下观察到。虽然烟草扭脉病毒可编码外壳蛋白，但还没有关于烟草扭脉病毒血清制备的报道，所以目前还不能利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测。现在应用最为广泛的检测烟草丛顶病的方法是，利用总核酸提取检测与烟草丛顶病相关的小分子RNA，但该方法不能检测烟草扭脉病毒。因此要依赖传统方法检测烟草扭脉病毒比较困难。
发明内容
本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种快速、灵敏、特异地检测烟草扭脉病毒的方法。
本发明的具体步骤是1、引物设计根据已报道的烟草扭脉病毒的核苷酸序列(序列号为AJ575129)设计了扩增烟草扭脉病毒外壳蛋白的特异性引物TVCPF/TVCPR，扩增的目的核酸带大小为620bp，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′2、总RNA提取(1)称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂(购自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；(2)在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；(3)12,000rpm离心10min；(4)上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；(5)12,000rpm离心10min；(6)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；(7)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；3、RT-PCR扩增(1)反转录合成cDNA取提取的总RNA模板2μL，加入引物TVCPR 1μL，9.5μLRNAase-free H2O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMVBUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；(2)PCR扩增取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)1μL，25mM MgCl23μL，引物TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA产物2μL，Tag DNA polymerase(5u/μL)0.5μL，dd H2O 36.5μL；轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、54-60℃退火1min、72℃延伸2min，共30-38次循环，最后72℃延伸10min；4、电泳检测取5μL PCR产物经0.8％-1.5％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；在感染烟草扭脉病毒的烟株中扩增到620bp的核酸带。
其中所述的退火温度54-60℃，也可以是57-59℃；所述的循环数30-38次，也可以是31-33次；所述的琼脂糖凝胶浓度0.8％-1.5％，也可以是1.1％-1.4％。
本发明的有益效果根据烟草扭脉病毒核苷酸序列设计的特异性引物TVCPF/TVCPR，提取植株组织的总RNA后，采用RT-PCR的方法，检测烟草扭脉病毒。克服了不能用指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术和总核酸提取法检测烟草扭脉病毒缺点，能够方便、特异、灵敏的检测烟草扭脉病毒。
说明书附图
图1是感染烟草扭脉病毒的电泳检测图。
具体实施例方式实例一以已知的感染烟草扭脉病毒的烟株为检测材料，并以健康材料为阴性对照。
1、引物设计根据已报道的烟草扭脉病毒的核苷酸序列(序列号为AJ575129)设计了扩增烟草扭脉病毒外壳蛋白的特异性引物TVCPF/TVCPR，扩增的目的核酸带大小为620bp，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′2、总RNA提取(1)称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂(购自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；(2)在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；(3)12,000rpm离心10min；(4)上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；(5)12,000rpm离心10min；(6)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；(7)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；3、RT-PCR扩增(1)反转录合成cDNA取提取的总RNA模板2μL，加入引物TVCPR 1μL，9.5μLRNAase-free H2O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMVBUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；(2)PCR扩增取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)1μL，25mM MgCl23μL，引物TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA产物2μL，Tag DNA polymerase(5u/μL)0.5μL，dd H2O 36.5μL；轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、54℃退火1min、72℃延伸2min，共30次循环，最后72℃延伸10min；4、电泳检测取5μL PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；在感染烟草扭脉病毒的烟株中扩增到620bp的核酸带，而健康烟株中无扩增核酸带。
实例二以已知的感染烟草扭脉病毒的烟株为检测材料，并以健康材料为阴性对照。
1、引物设计根据已报道的烟草扭脉病毒的核苷酸序列(序列号为AJ575129)设计了扩增烟草扭脉病毒外壳蛋白的特异性引物TVCPF/TVCPR，扩增的目的核酸带大小为620bp，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′2、总RNA提取(1)称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂(购自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；(2)在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；(3)12,000rpm离心10min；(4)上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；(5)12,000rpm离心10min；(6)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；(7)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；3、RT-PCR扩增(1)反转录合成cDNA取提取的总RNA模板2μL，加入引物TVCPR 1μL，9.5μLRNAase-free H2O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMVBUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；(2)PCR扩增取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)1μL，25mM MgCl23μL，引物TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA产物2μL，Tag DNA polymerase(5u/μL)0.5μL，dd H2O 36.5μL；轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、60℃退火1min、72℃延伸2min，共38次循环，最后72℃延伸10min；4、电泳检测取5μL PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；在感染烟草扭脉病毒的烟株中扩增到620bp的核酸带，而健康烟株中无扩增核酸带。
实例三以已知的感染烟草扭脉病毒的烟株为检测材料，并以健康材料为阴性对照。
1、引物设计根据已报道的烟草扭脉病毒的核苷酸序列(序列号为AJ575129)设计了扩增烟草扭脉病毒外壳蛋白的特异性引物TVCPF/TVCPR，扩增的目的核酸带大小为620bp，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′2、总RNA提取(1)称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂(购自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；(2)在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；(3)12,000rpm离心10min；(4)上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；(5)12,000rpm离心10min；(6)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；(7)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；
3、RT-PCR扩增(1)反转录合成cDNA取提取的总RNA模板2μL，加入引物TVCPR 1μL，9.5μLRNAase-free H2O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMVBUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；(2)PCR扩增取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)1μL，25mM MgCl23μL，引物TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA产物2μL，Tag DNA polymerase(5u/μL)0.5μL，dd H2O 36.5μL；轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、57℃退火1min、72℃延伸2min，共36次循环，最后72℃延伸10min；4、电泳检测取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；在感染烟草扭脉病毒的烟株中扩增到620bp的核酸带，而健康烟株中无扩增核酸带。
权利要求
1.一种烟草扭脉病毒检测方法，它包括以下步骤(1)引物设计根据已报道的烟草扭脉病毒的核苷酸序列(序列号为AJ575129)设计了扩增烟草扭脉病毒外壳蛋白的特异性引物TVCPF/TVCPR，扩增的目的核酸带大小为620bp，引物序列如下TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG -3′TVCPR 5′-CTATITGGGGTFGTGCAATFGC -3′(2)总RNA提取①称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；②在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；③12,000rpm离心10min；④上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；⑤12,000rpm离心10min；⑥弃上清，沉淀用1mL70％乙醇洗涤，干燥10min；⑦沉淀用40μLDEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；(3)RT-PCR扩增①反转录合成cDNA取提取的总RNA模板2μL，加入引物TVCPR 1μL，9.5μL RNAase-free H2O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入以下试剂
轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；②PCR扩增在PCR管中加入以下试剂
轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、54-60℃退火1min、72℃延伸2min，共30-38次循环，最后72℃延伸10min；(4)电泳检测取5μL PCR产物经0.8％-1.5％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；在感染烟草扭脉病毒的烟株中扩增到620bp的条带。
2.根据权利要求1所述的烟草扭脉病毒检测方法，其特征在于PCR扩增中的退火温度为57-59℃。
3.根据权利要求1所述的烟草扭脉病毒检测方法，其特征在于PCR扩增中的循环数为31-33次。
4.根据权利要求1所述的烟草扭脉病毒检测方法，其特征在于电泳检测时所用的琼脂糖凝胶浓度为1.1％-1.4％。
全文摘要
本发明提供一种烟草扭脉病毒检测方法，属植物保护领域。根据烟草扭脉病毒核苷酸序列设计的特异性引物TVCPF/TVCPR，提取植株组织的总RNA后，采用RT－PCR的方法，检测烟草扭脉病毒。该发明能有效克服指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术和总核酸提取法的缺点，方便、特异、灵敏的检测烟草扭脉病毒。
文档编号C12Q1/68GK1827779SQ20051004873
公开日2006年9月6日 申请日期2005年12月22日 优先权日2005年12月22日
发明者李凡, 王钰丽, 陈海如, 孙健, 蔡红, 吴建宇, 秦西云, 孔宝华, 兰平秀, 杨金广 申请人:云南农业大学