专利名称：16SrⅡ组植原体PCR检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种植原体PCR检测试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。
背景技术：
植原体(phytoplasma)(原称类菌原体Mycoplasma-like Organism，简称MLO)是一类无细胞壁，存在于植物筛管细胞内的原核生物。植原体自1967年被日本学者土居养二首次发现后，迄今为止，世界上报道的植物植原体病害多达300余种。由于植原体严格寄生于寄主植物韧皮部，不能进行人工培养，因而对其遗传本质、生化特性、营养要求等都无从得知，同时对其检测及鉴定技术的发展也受到阻碍。早期对植原体的鉴定主要是通过生物学特性，如症状特征、与昆虫介体的相互关系等进行的。这些方法费时费力，结果往往也不是很可靠。80年代，随着血清学、分子探针以及PCR技术的发展应用，为植原体的检测提供了一种相对简单、灵敏、可靠的方法。通过对植原体进化过程中相对保守基因(16SrRNA基因或核糖体蛋白基因)的序列分析或扩增产物的RFLP分析，可对植原体进行鉴定和分类，同时也建立了植原体的分类体系。
根据植原体16SrRNA基因及核糖体蛋白基因的RFLP分析，已将植原体分为14个确定组，即16SrI，16SrII……16SrXIV。其中16SrII组以花生丛枝病为代表，主要包括花生丛枝、甘薯丛枝、酸橙丛枝、蚕豆变叶、甘薯小叶及仙人掌丛枝等。
根据植原体16SrRNA基因序列，目前已设计出很多针对植原体组的特异引物，其中包括16SrI组、16SrIII组、16SrV组、16SrVI组、16SrVII组、16SrX组等，这些组的特异引物是根据组成各个组的植原体成员的16SrRNA基因保守区域设计的，显然特异引物就不能对16SrII组的植原体进行直接鉴定。
发明内容
本发明的目的克服了现有技术的不足，提供了一种快速、准确、灵敏、特异性高、操作方便的专门用于16SrII组植原体的检测试剂盒和使用方法。
本发明的技术方案为一种16SrII组植原体的PCR检测试剂盒，包括以下成分(1)植原体16SrRNA基因通用引物序列R16mF25’-CATGCAAGTCGAACGGA-3’R16mR15’-CTTAACCCCAATCATCGAC-3’(2)16SrII组植原体的特异引物序列
R16(II)F15’-AGTGGCGAACCATTTGTT-3’；R16(II)R15’-CTCGAATAAACGAGTTAGG-3’(3)试剂盒反应体系含有10×PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶。
试剂盒反应体系各试剂终浓度为1×PCR反应缓冲液，2.0mM MgCl2，0.2mMdNTPs，0.6μM R16mF2/R1引物(或R16(II)F1/R1)及4-5个单位的Taq DNA聚合酶。
16SrII组植原体的PCR检测方法(1)PCR反应在上述检测试剂盒中加入0.1-1μg感病植株总DNA后，再加入超纯水使反应总体积为50μl。然后进行PCR反应，反应参数为为95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火2min，72℃延伸3min，10个反应循环后加入引物R16(II)F1/R1并于95℃变性30sec，40℃退火2min，72℃延伸3min，10个循环后72℃保温10min，4℃冰箱中保存。
(2)电泳检测取5μl反应产物在0.7-1.0％的琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上拍照观察含有16SrII组植原体的样品电泳检测结果可观察到1500bp和990bp的二条特异扩增条带，而非16SrII组植原体的样品电泳检测结果只能观察到1500bp的扩增条带。
本发明提供的16SrII组植原体PCR检测试剂盒及其检测方法，与现有技术相比，具有以下优点和积极效果(1)具有较高的检测灵敏度。在第一次PCR反应中，使用植原体16SrRNA基因通用引物经10次循环可扩增出植原体特异大片段，这些产物为第二次扩增提供了足够的模板，这样便大大提高了检测的灵敏度。在加入了16SrII组的特异引物后，经10次反应循环便可通过电泳检测是否有16SrII组的特异扩增产物。
(2)具有较高的扩增特异性。通常在PCR反应过程中，退火温度高，扩增产物的特异性便会提高。在本试剂盒的使用方法中，使用植原体通用引物(R16mF2/R1)的第一次扩增反应中，为了提高植原体特异大片段的特异性，采用了较高的退火温度(60℃)；而在第二次扩增反应中，则采用了较低的退火温度(40℃)，但仍只扩增出了和引物设计相符的990bp的扩增小片段，这足以说明该反应试剂盒具有较高的特异性。
(3)能快速检测植原体病害样品，同时又可对属于16SrII组的植原体进行分类鉴定。本试剂盒根据6种16SrII组和其它16Sr组植原体株系的16SrDNA序列比较结果，设计了一对针对16SrII组植原体PCR检测的特异引物，经过二次PCR反应，即可同时检测并鉴定16SrII组植原体。
图1 16SrII组植原体特异引物循环PCR扩增条带MDNA分子量标准；1CK；2-3分别为泡桐丛枝和桑树黄萎，均为非16SrII组植原体样品；4-5分别为花生丛枝和仙人掌丛枝，为16SrII组植原体样品。
具体实施例方式
1、植原体16SrRNA基因通用引物序列的合成及配制参照Lee等人所报道的植原体16SrRNA基因通用引物对R16mF2/R16mR1序列合成引物，扩增长度约为1500bp。引物溶解于适量灭菌水中至终浓度为10μM。
2、16SrII组植原体PCR引物的设计、合成与配制根据6种16SrII组和其它16Sr组植原体株系的16SrDNA序列比较结果(图1)，设计并合成与仙人掌丛枝病植原体CWB株系16SrDNA第416-433区段碱基序列同源的上游引物R16(II)F1及与第1387-1405区段碱基序列互补的下游引物R16(II)R1，扩增长度为990bp。引物溶解于适量灭菌水中至终浓度为10μM。
416 433 1387 1405↓ ↓ ↓↓CWBAGTGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGFBPAGTGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGWBDL AGTGGTGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTA.TCGAGPnWB AATGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGSUNHP AATGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGSPWB AATGGCGAACCATTTGTT………………CCTAACTCGTTTATTCGAGWX AGT.G.GAAAAACTCCCT………………CCTAACTTCGCAAGA..AGLY AGT.G.GAAAAACTATCT………………CCTAACTGCGTAAGC..AGPPWB AGT.G.GAAAAACTATCT………………CCTAACTTCGTTAGA..AGEY1AGTGG.GAAAAACTATAT………………CTTAACTTCGCAAGA..AGCP AGT.G.GAAAAACTATAT………………CTTAACTTCGCAAGA..AGAshY AGT.G.GAAAAACTATCT………………CTTAACTTCGCAAGA..CGLfWB AGT.G.GAAAAACTATCT………………CTTAATTTCGTAAGA..AASAYGAT.G.GAAAAATCATTC………………CCTAACTTCGCAAG..AAGSTOL GGT.G.GAAAAACCATTA………………CCTAACTTGAGCAATCAAGAT GAT.G.GAAAAATCATTC………………CCTAACTTGCAA....AAG3、PCR试剂盒的组装PCR反应各试剂按试剂盒反应体系配制。
4、16SrII组植原体PCR检测试剂盒的检测方法(1)PCR反应在上述PCR检测试剂盒中加入0.1-1μg感病植株总DNA后，再加入超纯水使反应总体积为50μl。然后进行PCR反应，反应参数为为95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火2min，72℃延伸3min，10个反应循环后加入引物R16(II)F1/R1并于95℃变性30sec，40℃退火2min，72℃延伸3min，进行10个循环后于72℃保温10min。
(2)电泳检测取5μl反应产物与1μl 6倍电泳上样缓冲液混匀，在0.7-1.0％的琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上拍照观察。
实验结果如下以泡桐丛枝病、桑树黄萎病等2个非16SrII组植原体的总DNA为对照，按照试剂盒的使用方法检测该试剂盒的特异性，结果表明以泡桐丛枝病、桑树黄萎病等2个非16SrII组植原体的总DNA为模板的PCR，只扩增出约1.5kb的特异带，而以花生丛枝及仙人掌丛枝等2个16SrII组植原体的总DNA为模板的PCR却扩增出约1.5kb和约小于1.0kb的两条混合条带，其中约小于1.0k条带与引物设计相符。说明该试剂盒有较高的特异性。
权利要求
1.一种16SrII组植原体的PCR检测试剂盒及其检测方法，其特征是试剂盒包括以下成分(1)植原体16S rRNA基因通用引物序列R16mF25’-CATGCAAGTCGAACGGA-3’R16mR15’-CTTAACCCCAATCATCGAC-3’(2)16SrII组植原体的特异引物序列R16(II)F15’-AGTGGCGAACCATTTGTT-3’；R16(II)R15’-CTCGAATAAACGAGTTAGG-3’(3)试剂盒反应体系含有10×PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶。
2.根据权利要求1所述的16SrII组植原体的PCR检测试剂盒及其检测方法，其特征在于所述的试剂盒反应体系各试剂终浓度为1×PCR反应缓冲液，2.0mM MgCl2，0.2mM dNTPs，0.6μM R16mF2/R1(或R16(II)F1/R1)引物及4-5个单位的Taq DNA聚合酶。
3.根据权利要求1所述的16SrII组植原体的PCR检测试剂盒及其方法，其检测步骤为(1)PCR反应在上述检测试剂盒中加入0.1-1μg感病植株总DNA后，再加入超纯水使反应总体积为50μl，进行PCR反应，反应参数为为95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火2min，72℃延伸3min，10个反应循环后加入引物R16(II)F1/R1并于95℃变性30sec，40℃退火2min，72℃延伸3min，10个循环后72℃保温10min，4℃冰箱中保存；(2)电泳检测取5μl反应产物在0.7-1.0％的琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上拍照观察含有16SrII组植原体的样品电泳检测结果可观察到1500bp和990bp的二条特异扩增条带，而非16SrII组植原体的样品电泳检测结果只能观察到1500bp的扩增条带。
全文摘要
本发明涉及一种植原体PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于16SrII组植原体的检测。试剂盒包括PCR常用反应试剂，主要有PCR反应缓冲液、MgCl
文档编号C12Q1/68GK1824798SQ200510048729
公开日2006年8月30日 申请日期2005年12月22日 优先权日2005年12月22日
发明者蔡红, 陈海如, 孔宝华, 范静华, 李凡, 和志娇, 刘涛, 杨根华 申请人:云南农业大学