专利名称：硒蛋白SelK对相互作用蛋白HCLP1和抑癌基因LZIP的功能调节的制作方法
技术领域：
本发明为利用酵母双杂交及免疫共沉淀、细胞免疫荧光等技术发现并证实了SelK蛋白可以与HCLP1蛋白相互作用，并且这种相互作用促进了HCLP1的核质转位，通过双荧光素酶转录活性实验揭示了SelK蛋白与HCLP1蛋白的相互作用协同抑制了抑癌基因LZIP的转录激活作用，为硒元素对人类生命健康所起的重要作用和癌症治疗提供线索。
本发明涉及生物医学高技术中新方法、新基因、新蛋白的开发与应用领域。
背景技术：
硒(Se)是1817年发现的性质似硫的元素，在20世纪50年代以后人们逐渐认识到硒是哺乳动物必需的一种微量营养元素，它在生物医学上的意义引起了越来越多的重视。然而，硒元素本身的化学性质或生物通常接触的少数几种硒的无机化合物不能合理地解释由硒所引起的生物学效应。1973年发现的第一批硒蛋白——梭状芽孢杆菌的甲酸脱氢酶和甘氨酸还原酶系统中的蛋白A以及哺乳动物谷胱甘肽过氧化物酶为我们理解硒缺乏引起的综合症提供了线索。随后，各种硒蛋白相继在不同生物中发现，它们的生物学功能和在分子病理中的作用也不断得到阐明。随着已知的硒蛋白数目不断增加，我们将对硒在病毒感染、心血管疾病、癌症预防及其他类型的疾病中所起的作用有着更深入的认识。
硒元素能以两种基本形式存在于天然蛋白中，第一种是硒作为一种可解离的辅因子通过翻译后修饰存在于蛋白中，硒的这种蛋白相关的形式比较稀有，仅在几种细菌含钼酶中发现；另外，硒能以稀有的氨基酸——硒代半胱氨酸的形式通过共翻译整合入蛋白中，这种一级结构上含有硒代半胱氨酸的蛋白即硒蛋白(selenoprotein)。硒蛋白广泛存在于生物界，如细菌、古细菌和哺乳动物中均已鉴定多种硒蛋白。硒蛋白在哺乳动物中更常见，自从发现第一例哺乳动物硒蛋白以来，哺乳动物硒蛋白的数目迅速增长，到目前为止，人的硒蛋白总数已增加到25个。
了解最多的哺乳动物硒蛋白家族是谷胱甘肽过氧化物酶家族，硫氧还蛋白还原酶家族，和脱碘酶家族。哺乳动物谷胱甘肽过氧化物酶家族有四个成员cGPx，GPx-GI，pGPx，PHGPX。它的基本功能是保护细胞免受氧化攻击。哺乳动物硫氧还蛋白还原酶分子量为约55-65kD，而且催化许多完全不同的反应，它不仅还原氧化型硫氧还蛋白的二硫键，而且还原一些其他蛋白的二硫键和各种各样被氧化的低分子量化合物。硫氧还蛋白还原酶作为ROS的重要还原机制之一，在细胞内的信号级联中发挥重要作用，而且硫氧还系统调节着还原敏感型转录因子如p53，NFκB的转录活性。在脊椎动物中鉴定三种碘化甲状腺素脱碘酶，I型(D1)，II型(D2)和III型(D3)均是硒蛋白。它们催化甲状腺素(T4，四碘甲腺原氨酸)和碘甲腺原氨酸的脱碘，决定甲状腺激素的合成和降解。其他大部分硒蛋白，包括硒蛋白SelK功能未知，还有待深入研究。目前硒蛋白在生物中扮演的重要作用已成为生物医学研究的焦点之一。
我们对于SelK的关注是在研究另外一个基因功能的过程中开始的。这个基因称为HCLP1，它编码一个具有406个氨基酸的蛋白，是一种广泛表达的细胞核蛋白。这个蛋白由六个45～71个氨基酸的重复基序，即KELCH重复组成，属于KELCH蛋白超家族。
KELCH基序是一种古老的元件，首先在果蝇kelch蛋白中发现，广泛存在于进化过程的蛋白质中。KELCH基序一般重复4到7次形成kelch重复结构域，半乳糖氧化酶晶体结构的研究揭示KELCH结构域在空间上形成一个β螺旋桨结构。现今已在人基因组中鉴定71种含有KELCH重复结构域的蛋白。根据KELCHβ螺旋桨的位置和蛋白中其他结构域的存在将KELCH重复蛋白分为五类，其中BTB/KELCH蛋白构成KELCH重复结构域蛋白的72％，而HCLP1整个蛋白分子就形成一个六叶螺旋桨结构。KELCH超家族蛋白分布很广泛，既有位于细胞内的，也有位于细胞膜的，还有位于细胞间质的。KELCH超家族蛋白在生物体中发挥的功能也十分多样。
HCLP1是一个全新的β螺旋桨蛋白，关于它在生物体内的功能报道还比较少。我们以HCLP1为“诱饵”蛋白，采用酵母双杂交技术筛选人HeLa细胞cDNA文库，获得了一个克隆，其cDNA序列编码的蛋白为SelK。我们的实验即是以这两者相互作用的发现为线索，探索两者在转录调节中的分子机理，以及两者在细胞方面的功能。我们的实验可能为硒元素对人类生命健康所起的重要作用提供线索。
发明内容
我们发现HCLP1和SelK的相互作用，通过这种相互作用增强了HCLP1的核质转位，从而进一步抑制抑癌基因LZIP的转录激活作用。
硒元素在生物界扮演重要作用，然而硒生物学功能的分子机制还有待进一步阐明。我们的结果初步揭示了SelK在细胞内的生物学功能，为硒元素对人类生命健康所起的重要作用提供线索。
1.我们以HCLP1为诱饵蛋白，利用酵母双杂交技术筛选HeLa细胞cDNA文库，筛查到与HCLP1发生相互作用的蛋白SelK。随后，我们利用蛋白质免疫共沉淀技术进一步验证了HCLP1与SelK的相互作用是特异的。
2.细胞免疫荧光实验表明，HCLP1蛋白与SelK之间的相互作用改变了HCLP1的亚细胞定位——促进了HCLP1从细胞核转位至细胞质，而SelK蛋白自身的亚细胞定位不发生变化。
3.荧光素酶报告基因检测结果表明，HCLP1蛋白与SelK之间的相互作用协同抑制了抑癌基因LZIP介导的转录激活作用。
因此，SelK通过与HCLP1的相互作用，增强HCLP1的核质转位，而且HCLP1蛋白与SelK之间的相互作用协同抑制了抑癌基因LZIP介导的转录激活作用。
以上所述及的实验内容和结果也即本发明的技术指标。
图1HCLP1和SelK体内结合实验(Co-immunoprecipitation)1.SelK单独转染HEK293ET细胞；2.SelK和HCLP1共转染HEK293ET细胞；3.SelK单独转染HeLa细胞；4.SelK和HCLP1共转染HeLa细胞图2HCLP1和SelK在HeLa细胞中的定位a.pEGFP-SelK单独转染HeLa细胞；b.pEGFP-HCLP1单独转染HeLa细胞图3HCLP1蛋白与SelK之间的相互作用促进HCLP1的细胞质定位pEGFP-SelK和pcDNA3.1/V5-HCLP1分别共转染COS7和HeLa细胞，a和d为SelK在COS7和HeLa细胞中的定位；b和e为HCLP1在COS7细胞中的定位；c和f为SelK和HCLP1在COS7和HeLa细胞中的细胞质共定位。
图4HCLP1蛋白与SelK的相互作用协同抑制了LZIP介导的转录激活作用1.用质粒pM-LZIP及pGal4Luc、pRL-TK共转染COS7细胞；2.用质粒pM-LZIP、pcDNA3.1/V5-HCLP1及pGal4Luc、pRL-TK共转COS7细胞；3-6.用质粒pM-LZIP、pcDNA3.1/V5-HCLP1及pGal4Luc、pRL-TK和不同剂量的pEGFP-SelK共转染COS7细胞。
实施例1.试验所需引物
1.酵母双杂交筛选HCLP1的相互作用蛋白我们用AS-HCLP1F和AS-HCLP1R这对引物对人HCLP1的cDNA重组质粒用pfu酶进行PCR扩增，将PCR产物进行BamHI和Pst I双酶切，同时将pAS2-1质粒进行双酶切，将载体和片断重组连接，随后转化DH5α。从转化的菌落中挑选单菌落，提取重组质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定以及测序验证。结果表明人HCLP1基因的读码框被正确的插入到载体之中。该重组载体在本研究中称为pAS2-1-HCLP1。我们将pAS2-1-HCLP1转入酵母后分别铺于SD/Trp-和含有不同浓度3-AT的SD/Trp-His-培养基上，观察其生长情况。结果表明，含有pAS2-HCLP1的酵母Y190转化子不能在SD/Trp-His-+20mM 3-AT培养基生长，LacZ检测呈阴性。说明pAS2-1-HCLP1转入Y190后没有自激活现象，可以进行下一步的文库筛选。
我们采用顺序转染法，将clontech公司的人HeLa细胞cDNA文库转入含有pAS2-1-HCLP1质粒的Y190酵母中，转化子全部铺于SD/Trp-Leu-His-+5mM 3-AT培养基上进行His+克隆的筛选。30℃倒置培养一周后，选择培养皿上直径＞2mm的阳性克隆点种于划格的新鲜SD/Trp-Leu-His-+5mM 3-AT平皿上继续培养，经72小时培养后进行β-半乳糖苷酶活性检测。结果His+克隆中呈现蓝色的菌落，即His+LacZ+克隆为阳性克隆。
将筛选到的酵母克隆中的质粒分别与pAS2-1-HCLP1和pAS2-1空载体共转染酵母SFY526菌株，以确定筛选到的蛋白是否能够产生自激活现象以及是否能够与HCLP1蛋白在更为严谨的条件下相互作用。
通过双转验证实验和对His+LacZ+酵母克隆进行测序，并对测序结果进行NCBI数据库的信息查询，发现一个阳性克隆编码的蛋白为SelK。
2.Co-immunoprecipitation试验为了扩增人SelK基因的编码区，我们用GFP-SelK F和GFP-SelK R这一对引物对SelK的编码区进行PCR扩增，在这一对引物中上游引物使用了SelK基因读码框和其下游的20个碱基，5’端引入了Myc标签、BamH I酶切位点和保护碱基。下游引物使用了该基因自身的终止密码子，并引入XbaI酶切位点及保护碱基。
将上述引物所扩增的PCR产物用BamH I和XbaI双酶进行末端切割后，和用同样的酶处理的pEGFP-C1载体进行连接，之后转化DH5α，并对克隆进行PCR鉴定和酶切鉴定，所获的阳性克隆进一步做了测序验证。同时，我们设计引物V5-HCLP1 F和V5-HCLP1 R，回收产物后与BamH I和Xho I双酶切的pCDNA3.1V5/HisB载体进行连接，连接产物转化DH5α以获取重组载体，经过酶切鉴定和DNA测序验证，表明HCLP1基因的读码框已经正确插入载体中，命名该重组的质粒为pcDNA3.1/V5-HCLP1。
我们用pEGFP-SelK单转细胞以及pEGFP-SelK和pcDNA3.1/V5-HCLP1双转细胞后，收集了大约1×107个细胞的裂解物，按照分子克隆原版第三版的标准步骤进行了Co-immunoprecipitation实验，结果如图1，说明HCLP1与SelK的相互作用是特异的。
附Co-immunoprecipitation实验步骤试剂细胞裂解液20mmol/L HEPES(pH7.5) 150mmol/L NaCl1％NP40 1mmol/L EDTA100mmo/L NaF 10mmol/L焦磷酸钠20mmol/L β-甘油磷酸钠1mmol/L钒酸钠*1mmol/L DTT* 2mmol/L PMSF*10μg/ml Aprotinin**使用时新鲜加入实验步骤1).细胞的转染转染前两天将75cm2培养瓶中处于对数生长期的细胞以1∶3传入75cm2培养瓶中继续培养。待细胞长至70～80％时，用磷酸钙法转染质粒。质粒用量为880μl(40ng/μl)。转染后48hrs收集细胞。
2).细胞的裂解每瓶中加入1.5ml冰预的裂解液，放置冰上裂解1hr。
其间追加一次PMSF，并且间隔10min用细胞刮搅动一次。细胞裂解物于4℃14000rpm离心20min后收集上清冻存于-70℃。
3).免疫共沉淀1ml细胞裂解液中加入40μl 50％protein A agarose，4℃振摇3hrs以除去非特异吸附的蛋白质。12000rpm离心20sec收集上清。将2μl anti-V5的鼠单抗加入上清中，4℃振摇1hr后再追加50μl 50％proteinA agarose，继续振摇1hr。随后用含有1mmol/L钒酸钠的裂解液1ml洗涤3次，最后再用不含钒酸钠的裂解液洗涤一次。样品经上样缓冲液处理，用鼠抗Myc的单抗作为一抗，HRP标记的羊抗小鼠IgG作为二抗进行Western Blot检测，ECL法显色。
3.细胞免疫荧光定位我们首先如上所述将人SelK的编码区序列构建到pEGFP-C1中。GFP是绿色荧光蛋白，人SelK基因的编码区构建到载体中后，即可以人SelK-GFP融合蛋白的方式获得表达。同时，我们设计引物GFP-HCLP1F和GFP-HCLP1R，回收产物后与Pst I和BamH I双酶切的pEGFP-N1载体进行连接，连接产物转化DH5α以获取重组载体，经过酶切鉴定和DNA测序验证，表明HCLP1基因的读码框已经正确插入载体中，命名该重组的质粒为pEGFP-HCLP1用Lipofectamine2000介导的方法，我们将pEGFP-SelK和pEGFP-HCLP1分别转染HeLa细胞。由于GFP与SelK或HCLP1融合表达，所以，在一定的波长的激光激发下，可以显示SelK和HCLP1在细胞中的定位。结果表明，人SelK蛋白定位在细胞质(图2a)，HCLP1蛋白定位在细胞核(图2b)。
我们将pEGFP-SelK和pcDNA3.1/V5-HCLP1共转HeLa细胞。细胞经固定后，用anti-V5(Invitrogen)作为一抗，以罗丹明红标记的兔抗小鼠抗体作为二抗，这样，就可以在共转染的细胞中，通过不同波长的激光激发，看到两个蛋白在同一个细胞中的定位情况。在荧光共聚焦显微镜下，人GFP-SelK为绿色，全部定位于细胞质(图3a和3d)，而HCLP1在细胞核中无红色分布，全部定位在细胞质中(图3b和3e)，并且两者的定位相重叠(图3c和3f)。这说明，HCLP1通过与SelK的相互作用促进了HCLP1的核质转位，增强了HCLP1的细胞质定位。
附细胞免疫荧光试剂浓酸∶浓硝酸∶浓盐酸＝2∶1(V/V)4％多聚甲醛固定液60ml水中加入4g多聚甲醛，60～80℃水浴中滴加1mol/L的NaOH至溶解透明。待溶液冷却至15℃时用HCl将pH调至7.0。最后用PBS补充至100ml。
透化液0.5％Triton/PBS封闭液3％BSA/PBS封片剂以预先配制的2％DABCO/PBS(Triethy lenediamine)制备90％的甘油实验步骤1).盖玻片的处理将盖玻片分次置入浓酸中浸泡2小时，用去离子水洗净后室温干燥。将经酸处理过的盖玻片投入十倍稀释的多聚赖氨酸溶液中，室温放置5min后取出于60℃干燥1hr或室温过夜。用前将盖玻片浸泡于75％乙醇中至少30min。
2).质粒转染按用Lipofectamine2000介导的方法进行。
3).细胞免疫荧光染色(1)细胞固定转染后48hrs用PBS清洗细胞两次，取出盖玻片，用滤纸将残留液体吸干，以4％多聚甲醛固定液室温固定10～15min。
(2)PBS漂洗，3×5min。
(3)细胞透化室温下，0.5％Triton/PBS透化处理10min。
(4)PBS漂洗，3×5min。
(5)细胞封闭以3％BSA/PBS封闭，37℃，30min或4℃过夜。
(6)一抗孵育在Parafilm膜上加入50μl以PBS按一定的稀释度稀释的一抗(如果进行双免疫荧光分析则同时加入两种一抗)，将盖玻片有细胞的一面朝下伏于一抗上，密封于湿盒中，37℃，30min。
(7)PBS漂洗，3×5min。
(8)二抗孵育在Parafilm膜上加入50μl以PBS按1∶50稀释的荧光素标记的二抗(如果进行双免疫荧光分析则同时加入两种二抗)，37℃，30min。
(9)PBS漂洗，3×5min。
(10)去离子水漂洗去盐，2×5min。
(11)封片取10μl封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，四周用指甲油封住。立刻用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察并照相。
4.人HCLP1与SelK的相互作用对LZIP介导的转录激活作用的影响我们用M-LZIP F和M-LZIP R这对引物对人LZIP的cDNA重组质粒用pfu酶进行PCR扩增，将PCR产物进行EcoRI和XhoI双酶切，同时将pM质粒进行EcoRI和SalI双酶切，将载体和片断重组连接，随后转化DH5α。从转化的菌落中挑选单菌落，提取重组质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定以及测序验证。结果表明人LZIP基因的读码框被正确的插入到载体之中。该重组载体在本研究中称为pM-LZIP。
文献表明，人LZIP基因是一种抑癌基因，HCLP1可抑制LZIP的转录激活作用，而HCLP1与SelK的相互作用可导致HCLP1的核质转位，HCLP1的转位是否会对LZIP的转录激活作用有影响不得而知。因此，本研究利用荧光素酶报告基因系统，探讨人HCLP1与SelK的相互作用对抑癌基因LZIP介导的转录激活作用的影响。
我们将pM-LZIP与pGAL4Luc、pcDNA3.1/V5-HCLP1和不同剂量的pEGFP-SelK共转染COS7细胞，通过检测荧光素酶报告基因的活性来判断HCLP1与SelK的相互作用对LZIP介导的转录激活作用的影响。另外，同时转染的pRL-TK载体能够编码另一种荧光素酶，此酶的活性用作试验的内参照。
结果如图4所示，HCLP1蛋白能够显著抑制LZIP的转录激活作用，而随着SelK剂量的增大，HCLP1和SelK协同抑制了LZIP的转录激活作用。
附荧光素酶报告基因分析的实验步骤和方法样品制备1)将细胞以1×105接种于12孔板，90％汇合时用LIPOFECTAMINE2000进行转染。
2)24-48收集细胞。PBS洗三遍，吸净残余液体，每孔加入150裂解液，室温放置15-20分钟，每隔几分钟晃动一次，使裂解液完全覆盖细胞。
3)收集细胞裂解液，4℃12，000rpm离心2min，收集上清，-70保存备用。
报告基因活性测定使用Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System.基本原理实验所用报告基因载体为pGL3，编码firefly荧光素酶。为了衡量每个孔的转染效率，实验时共转pRL-TK作为内对照，该质粒编码Renilla荧光素酶。这两种酶的底物和反应缓冲液不同，可以用同一样品在同一个试管中测定。firefly荧光素酶反应体系为LAR II，Renilla荧光素酶反应体系为Stop & Glo Reagent，均由试剂盒提供。
1)预热荧光计，设定参数，每次延迟2秒后开始测定，测定时间为十秒。
2)将100μl LAR II加入荧光管，接着加入20μl细胞裂解液，用枪头混匀2-3次，放入荧光计开始读数。
3)记录firefly荧光素酶读数，重复一次。
4)在同一个管中加入100μl Stop & Glo Reagent，混匀，重新放入荧光计开始测定，重复一次。
权利要求
1.本发明涉及硒蛋白SelK与HCLP1之间的相互作用的发现以及二者之间的相互作用对抑癌基因LZIP转录激活作用的影响。
2.根据权利要求1所述之2个蛋白SelK与HCLP1之间的相互作用，其特征在于，SelK通过与HCLP1的相互作用促进HCLP1从细胞核转位至细胞浆，增强了HCLP1的细胞浆定位。
3.根据权利要求1、2所述及之SelK与HCLP1之间的相互作用，其特征在于，通过Luciferase报告系统分析，SelK和HCLP1能抑制抑癌基因LZIP的转录激活作用，SelK与HCLP1的相互作用能协同抑制LZIP的转录激活作用。
4.根据权利要求1、2、3所述之2个蛋白SelK与HCLP1，其特征在于SelK通过与HCLP1的相互作用，增强了HCLP1的核质转位，协同抑制抑癌基因LZIP的转录激活作用，为肿瘤治疗提供靶向。
全文摘要
本发明涉及硒蛋白SelK对相互作用蛋白HCLP1的功能调节。以HCLP1为“诱饵”蛋白，采用酵母双杂交技术筛选人HeLa细胞cDNA文库，获得与之相互作用的一个蛋白SelK。免疫共沉淀实验证明SelK能特异地与HCLP1相互作用。细胞免疫荧光定位分析表明SelK通过与HCLP1的相互作用，促进了HCLP1从细胞核转位至细胞质，SelK与HCLP1的相互作用协同抑制了抑癌基因LZIP的转录激活作用。结果揭示了硒蛋白SelK对相互作用蛋白HCLP1和抑癌基因LZIP所起的调节作用，为硒元素对人类生命健康所起的重要作用和癌症治疗提供线索。
文档编号C12N15/09GK1840691SQ20051005933
公开日2006年10月4日 申请日期2005年3月29日 优先权日2005年3月29日
发明者陆彩玲, 周海军, 彭小忠, 强伯勤, 袁建刚 申请人:中国医学科学院基础医学研究所