专利名称：大鼠睾丸特异性基因rsb66参与细胞周期的调控的制作方法
技术领域：
本发明为一个在精子发生过程中参与细胞周期调控的基因/蛋白，涉及生物医学高技术中新基因，新蛋白质的开发与应用领域。
背景技术：
哺乳动物的精子发生过程是研究细胞周期调控和细胞分化机制的一个重要的模型。在此过程中，精原干细胞通过有丝分裂使其数量得到扩增，经减数分裂，随后再经历单倍体精子细胞的变形，发育成成熟精子。在这一分化过程中的每一特定阶段均有细胞特异性和发育阶段特异性的结构形成，而众多阶段特异性基因的转录和表达则是形成生精细胞阶段特异性结构及发挥细胞特定功能的基础。因此，研究精子发生过程中基因的转录和表达，阐明精子发生的分子机制，对人类的生殖健康、避孕疫苗的研制及男性不育的防治都有着十分重要的意义。
激光捕获显微切割(Laser Capture Microdissection，LCM)是近年来发展起来的一种能从复杂的组织中分离和聚集特定细胞或细胞群的新技术。LCM技术主要是将一张透明的聚乙烯醋酸乙烯酯(EthyleneVinyl Acetate，EVA)热塑性转移膜放置在组织切片上，利用红外激光将定位好的细胞和组织精确地粘附在膜上，然后它们被洗脱下来用于进一步的分子生物学分析。这个温和、短暂的加热过程不损伤捕获细胞中的DNA、mRNA和蛋白质。高分子膜的热塑性变化不会与生物大分子发生化学交联反应，也不会影响后续的分子生物学分析。利用上述特性，我组在国际上首先使用LCM技术分离获得了大量的大鼠初级精母细胞和圆形精子细胞，提取了这两种细胞的总RNA后，通过消减杂交技术建立了初级精母细胞消减圆形精子细胞的消减cDNA文库(RSB)。RSB66基因就是我们从RSB文库分离到的一条新基因。但至今尚无RSB66蛋白的功能研究报道。
发明目的克隆在睾丸圆形精子细胞特异表达、在精子细胞发育过程中可能起重要作用的基因RSB66，表达其编码蛋白质，了解其在转录与表达的阶段，阐明其生理生化功能，更清楚地了解精子细胞的发生机理，从而为相关疾病的基因诊断和基因治疗以及新药筛选和抗生育研究提供可能的目标基因。
内容与要求应用生物信息学原理、激光捕获显微切割技术、抑制性消减杂交技术、分子克隆、DNA序列测定技术、Northern印迹杂交、蛋白质表达与纯化技术、抗血清制备、酵母双杂交技术、细胞培养技术、细胞转染技术以及细胞免疫荧光和激光共聚焦显微技术等，克隆鉴定编码RSB66蛋白的新基因全长cDNA，通过Northern印迹杂交进行组织表达谱分析，纯化原核表达的目标蛋白质并免疫家兔制备抗血清，进而进行免疫荧光分析，综合运用酵母双杂交、共洗脱、免疫共沉淀和流式细胞仪分析细胞周期等技术初步确定RSB66基因/蛋白的功能。
该基因/蛋白质达到的技术指标为1.RSB66基因的cDNA序列全长为564bp，GenBank注册号为AY121839。此序列有一个504bp的开放阅读框，编码一个168个氨基酸的蛋白质。
2.RSB66基因的表达具有组织特异性和精子发生周期的阶段特异性。Northern印迹杂交结果显示该基因仅在大鼠睾丸组织有转录表达(见图1)。免疫荧光显示该基因特异表达于大鼠睾丸圆形精子细胞细胞浆中(见图2)。
3.以RSB66为诱饵蛋白，利用酵母双杂交技术筛选人睾丸cDNA文库，筛选到与RSB66发生相互作用的蛋白INCA1。随后，利用共洗脱和免疫共沉淀技术进一步验证了RSB66蛋白与INCA1蛋白的相互作用是特异的(见图3和图4)。
4.重组RSB66基因的真核细胞表达质粒(pEGFP-N1-RSB66)转染HeLa细胞，经G418筛选获得稳定表达EGFP-RSB66的HeLa细胞系(见图5)。
5.稳定表达EGFP-RSB66的HeLa细胞系，出现明显的G2/M延迟(见图6)。
图1.大鼠RSB66基因组织表达谱的Northem印迹分析结果上图1脾，2肝，3睾丸，4肠，5肾，6心，7脑，8骨骼肌；下图β-actin对照结果显示在8种成年鼠组织中，以组成性表达的β-actin为参照，睾丸组织有较高水平的RSB66基因表达，其余组织均为阴性。
图2.免疫荧光方法检测RSB66蛋白在精子发生周期的表达从左到右RSB66蛋白(绿色)，碘化丙啶染的细胞核(红色)，叠加图可见RSB66蛋白只在大鼠圆形精子细胞细胞浆中特异性表达。
图3.共洗脱实验验证RSB66蛋白与INCA1的体外结合M蛋白质分子量标记，1GST-INCA1实验组，2GST对照组此结果表明纯化的GST-INCA1可以与纯化的His-RSB66在体外发生相互作用。
图4.免疫共沉淀实验验证RSB66蛋白与INCA1的体内结合1EGFP-RSB66阳性对照，2EGFP-RSB66实验组，3EGFP对照组此结果表明EGFP-RSB66可以与INCA1在体内发生相互作用。
图5.稳定表达EGFP-RSB66的HeLa细胞系的荧光观察A绿色荧光通道 B可见光相差通道此结果表明稳定表达EGFP-RSB66的HeLa细胞系能观察到明显的绿色荧光。
图6.稳定表达EGFP-RSB66的HeLa细胞系，出现明显的G2/M延迟A稳定表达EGFP的对照HeLa细胞系 B稳定表达EGFP-RSB66的HeLa细胞系最上排数据显示细胞经双胸苷同步化释放所经历的时间此结果表明，与稳定表达EGFP的对照HeLa细胞系相比，稳定表达EGFP-RSB66的HeLa细胞系出现明显的G2/M延迟。
实施例1.Northern印迹分析取雄性成年大鼠一只。引颈处死后，快速切取脾、肝、睾丸、肠、肾、心、脑、骨骼肌组织，迅速液氮冷冻。然后用钝器砸碎，称取100μg组织加入有1ml Trizol试剂的微量组织匀浆器中。按照Trizol试剂说明所述提取总RNA。采用甲醛变性的1％琼脂糖凝胶电泳，每个泳道上样所提组织总RNA 25μg，电泳结束后，用DEPC处理过的水淋洗凝胶数次，50mM的NaOH处理20min以水解RNA，无RNA酶的水淋洗数次，并用20×SSC浸泡凝胶45min，用20×SSC转膜16-20h，转移结束后，于6×SSC中漂洗滤膜，晾干，80℃干烤1-2h，室温存放待杂交用。
PCR扩增并纯化杂交用的RSB66探针，对探针进行放射性标记，将杂交液68℃预热，使液体均匀。将Northern膜放入6×SSC中浸湿，然后置于杂交管中。固定有核酸的一面朝上，膜与杂交管之间勿留气泡。加入5ml杂交液，68℃预杂交30min。将标记探针100℃处理10min，然后冰浴10min。继而与预热的杂交液混匀，加到杂交管中。68℃杂交1-2h。杂交结束后，小心将膜自杂交管中取出。置于2×SSC/0.5％SDS中室温洗三次，每次15min。然后再用0.1×SSC/0.1％SDS 68℃洗膜两次，每次20min。将湿膜置于保鲜膜内，压X光胶片，-70℃曝光(图1)。
2.免疫荧光方法检测RSB66蛋白在精子发生周期的表达处死大鼠1只，取其睾丸组织剔除被膜和血管，用镊子小心分散曲细精管。以少量PBS洗涤。1M Glycine高渗溶液浸泡10min，吸去溶液。加入胶原酶(0.1％胶原酶I，0.02％大豆胰蛋白酶抑制剂)约1h(37℃)。吹打使细胞分散，300目滤网过滤。滤液离心1500rpm，5min，收集细胞沉淀。PBS重悬沉淀。1500rpm离心5min，PBS重悬沉淀。1500rpm离心5min，PBS重悬细胞至适当的浓度。
取分离的生精细胞一滴于玻片上，用枪头边涂边蹭使细胞均匀分散，彼此保持2-3个细胞的间隙，室温晾干10min。4％多聚甲醛固定10min。PBS洗涤2-3遍(5min/次)。用含0.5％TritonX-100的PBS透化10min。PBS洗涤3遍(5min/次)。封闭液(含3％BSA)封闭15min，室温放置。加入不同稀释度的RSB66抗体，4℃湿盒过夜。PBS洗涤3遍(5min/次)。加入1/100稀释的FITC标记的二抗，室温湿盒1hr。PBS洗涤3遍(5min/次)。碘化丙啶复染细胞核，室温4minPBS洗涤2遍(5min/次)。ddH2O洗涤2遍(5min/次)。封片，4℃保存。激光共聚焦显微镜观察结果(见图2)。
3.共洗脱实验验证RSB66蛋白与INCA1的体外结合在大肠杆菌中表达并亲和纯化GST-INCA1、GST和His-RSB66融合蛋白，使用BCA法对纯化蛋白进行定量。在两个平行装有50μl Glutathione Sepharose 4B的柱中，分别加入GST-HSD-45(1.3nmol)和GST(1.3nmol)，并以10倍柱体积的PBS冲洗。在两个柱中各加入2nmolHis-RSB66，孵育1h后，以50倍柱体积PBS-T(138mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4，0.05％Tween 20)冲洗。以100μl GST Elution Buffer(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/L Glutathione)洗脱。洗脱液进行SDS-PAGE，考马斯亮兰染色后观察结果(见图3)。
4.免疫共沉淀实验验证RSB66蛋白与INCA1的体内结合用Lipofectamine2000分别将pcDNA6/V5/His/FLAG-INCA1和pEGFP-N1-RSB66、pcDNA6/V5/His/FLAG-INCA1和pEGFP-N1共转染入HeLa细胞株中，转染后48hrs收集细胞。每瓶中加入1.5ml冰预的裂解液(50mM pH7.5 Tris-HCl，150mmol/L NaCl，1％NP40，0.5％钒酸钠，使用前新鲜加入2mmol/LPMSF)，放置冰上裂解1hr。其间追加一次PMSF，并且间隔10min用细胞刮搅动一次。细胞裂解物于4℃14000rpm离心20min后收集上清冻存于-70℃。1ml细胞裂解液中加入40μl 50％protein A agarose，4℃振摇3h以除去非特异吸附的蛋白质。12000rpm离心20sec收集上清。将40μl anti-INCA1抗体加入上清中，4℃振摇1hr后再追加50μl 50％protein A agarose，继续振摇1hr。随后用含有1mmol/L钒酸钠的裂解液1ml洗涤3次，最后再用不含钒酸钠的裂解液洗涤一次。样品经上样缓冲液处理，用抗EGFP的单抗作为一抗，HRP标记的羊抗小鼠IgG作为二抗进行Western Blot检测，ECL法显色(见图4)。
5.稳定表达EGFP-RSB66的HeLa细胞系的筛选采用Lipofectamine 2000将pEGFP-N1-RSB66转染HeLa细胞48h后，在培养基中加入geneticin(G418)(500ng/mL)，每3-4天换液一次，加入同样浓度的G418。2-3周后，挑选同时具有抗生素抗性和绿色荧光的细胞克隆，使之扩增为细胞系，通过荧光观察进行鉴定(见图5)。
6.稳定表达EGFP-RSB66的HeLa细胞系，出现明显的G2/M延迟将稳定表达EGFP-RSB66的HeLa细胞和稳定表达EGFP的HeLa细胞以1×105/孔的密度种植于6孔培养板中。待细胞生长至指数生长期时，向培养基中加入终浓度为2mM的脱氧胸苷。作用12h后换成正常培养基。间隔8-10h后再次加入终浓度为2mM的脱氧胸苷。作用12h后释放，使绝大部分细胞同步化于G1/S期。细胞同步化处理后，以释放的时间计为零点，间隔30min收集细胞。PBS洗两遍，1,500rpm离心5min，弃上清。以0.5ml PBS重悬细胞，迅速打入5ml 70％预冷乙醇中，吹打均匀，4℃固定过夜。1,500rpm离心5min，弃上清。1ml PBS重悬细胞，1,500rpm离心5min，弃上清。0.5ml PBS重悬细胞，加入RNaseA至终浓度50μg/ml，37℃，30min。加入PI至终浓度50μg/ml，37℃，30min。用流式细胞仪测定细胞周期。
7.全长RSB66 cDNA序列及其编码蛋白质的氨基酸序列1 ACCCTTTCTGTCCTGTGGGACCTAACAGCAACAATGAATGAGGTGAAAGAGTCCCTCCGC 601 M N E V K E S L R 961 AGCATCGAGCAGAAGTACAAACTCTTTCAGCAGCAACAGTTCACCTTCATTGCTGCTCTG12010S I E Q K Y K L F Q Q Q Q F T F I A A L 29121 GAGCACTGCCGGGAGAATGCCCACGACAAAATCCGGCCCATCTCCAGATCGAGCTGGTG 18030E H C R E N A H D K I R P I S S I E L V 49181 CAGAGCTACATGGAACATTACTGCAATAACTCCACCGACCGGCGGATTCTGCTCATGTTC24050Q S Y M E H Y C N N S T D R R I L L M F 69241 ATGGACATCTGCTCGGAGCTCAACAAACTGTGCCAGCACTTTGAGGCCTTGCACTCCGGC30070M D I C S E L N K L C Q H F E A L H S G 89301 ACCCCTGTCACCAACAGCCTTCTCGAGAAATGCAAAACCCTGGTTAGCCAGAGCAATGAC36090T P V T N S L L E K C K T L V S Q S N D 109361 TTGAGCATCCTCAGAGCAAAGTACCCGCATGATGTGGTGATCCACCTCAGCTGTGATGAG420110L S I L R A K Y P H D V V I H L S C D E 129421 GCCAGGAACCACTATGGAGGTGTGGTCAGCCTCATCCCCATAGTCCTGGACCTAATGAAA480130A R N H Y G G V V S L I P I V L D L M K 149481 GAGTGGATCGCTCATTCCGAGAAGCTGCCTCGCAAAGTGCTGCAGCATGGGACGACTTAG540150E W I A H S E K L P R K V L Q H G T T * 168541 CTTCTGTACTGTTGCTTCCTCGGG
权利要求
1.本发明涉及一个大鼠睾丸圆形精子细胞特异性表达的基因/蛋白，命名为RSB66基因/蛋白(GenBank注册号AY121839)。包括互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列，编码蛋白质的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述发明，其特征在于RSB66基因的cDNA序列全长为564bp，相应编码蛋白质有168个氨基酸。
3.根据权利要求1、2所述发明，其特征在于该基因的表达具有组织特异性和精子发生周期的阶段特异性。Northern印迹杂交结果显示该基因仅在大鼠睾丸组织有转录表达。免疫荧光显示该基因特异表达于大鼠睾丸圆形精子细胞细胞浆中。
4.根据权利要求1、2、3、所述发明，其特征在于以RSB66为诱饵蛋白，利用酵母双杂交技术筛选人睾丸cDNA文库，筛选到与RSB66发生相互作用的蛋白INCA1。随后利用共洗脱和免疫共沉淀技术进一步验证了RSB66蛋白与INCA1蛋白的相互作用是特异的。
5.根据权利要求1、2、3、4所述发明，其特征在于筛选获得稳定表达EGFP-RSB66的HeLa细胞系。
6.根据权利要求1、2、3、4、5所述发明，稳定表达EGFP-RSB66的HeLa细胞系，出现明显的G2/M延迟。
全文摘要
本发明涉及一个大鼠睾丸圆形精子细胞特异性表达的基因/蛋白，命名为RSB66基因/蛋白(GenBank注册号AY121839)。内容包括RSB66的互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列，编码蛋白质的氨基酸序列；Northern印迹分析结果表明，该基因的表达具有组织特异性；免疫荧光实验结果显示，RSB66蛋白的表达具有精子发生周期的阶段特异性；酵母双杂交实验发现RSB66蛋白能与INCA1发生相互作用，共洗脱实验和免疫共沉淀实验验证了这两种蛋白能在体外和体内系统中发生相互作用；构建表达EGFP－RSB66蛋白的真核表达质粒，转染HeLa细胞，可引起明显的G2/M延迟。RSB66基因/蛋白的功能与精子发生中的细胞周期调控密切相关，阐明其生理生化功能对了解细胞周期的精细调控规律和生殖细胞的发生机理具有重要的意义。
文档编号C12N5/10GK1869223SQ20051007106
公开日2006年11月29日 申请日期2005年5月24日 优先权日2005年5月24日
发明者胡廷徽, 梁刚, 陈叙, 杨茂君, 缪时英, 王琳芳 申请人:中国医学科学院基础医学研究所