专利名称：一种促进微生物酶法合成谷胱甘肽的方法
技术领域：
一种促进微生物酶法合成谷胱甘肽的方法，通过向反应体系中直接添加通透剂，降低细胞外膜的通透性屏障，促进微生物细胞酶法合成谷胱甘肽，提高谷胱甘肽产量，涉及利用微生物细胞酶法合成高价值有用化合物技术领域。
背景技术：
利用微生物整细胞生物催化合成高价值有用化合物因其具有大规模工业化应用的潜力，越来越受到人们的广泛关注。如基因工程菌酶法合成谷胱甘肽。通过克隆编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的基因gsh I和gsh II，并构建一株具有高谷胱甘肽合成活性的重组大肠杆菌，然后利用其中的谷胱甘肽合成酶系酶法合成谷胱甘肽。与使用分离的纯酶相比，在整细胞生物催化中，由于微生物细胞外壳的保护，胞内的酶源通常更为稳定，但是由于微生物细胞外膜的通透性屏障，使得整细胞生物催化的效率明显要低于纯酶体系，因而如何在保证胞内有关酶活性的基础上，尽可能地提高细胞膜的通透性就显得尤为关键。
当前提高通透性的处理方法主要包括物理和化学的处理方法。这些方法主要为通透性预处理，处理程序主要为通透性处理-离心-洗涤等操作，处理过程较为繁琐，另外，在进行通透性预处理时，经常会出现细胞膜的过分损伤和细胞的裂解等现象，导致离心操作时微生物胞内物质的丢失，降低了微生物细胞生物催化的效率。通过向反应体系中直接添加低浓度的通透剂将有可能避免上述问题的出现，并最终促进高价值有用化合物的生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种降低细胞外膜通透性屏障促进微生物酶法合成高价值有用化合物的方法。
本发明的技术方案采用在微生物法合成谷胱甘肽的反应体系中直接添加低浓度的有机溶剂或表面活性剂作为通透剂，通透剂在谷胱甘肽合成基础反应液中的体积百分终浓度达到0.25％～2％，以降低细胞外膜的通透性屏障，提高谷胱甘肽的产量。
菌株重组大肠杆菌E.coli WSH-KE1(该菌种已在“Process Biochemistry”第33卷第7期，P709-714，1998年公开)。
培养基平板培养基蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，氨苄青霉素100mg/L，pH7.0。
种子培养基蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖30g/L，氨苄青霉素100mg/L，pH7.0。
发酵培养基葡萄糖10g/L，KH2PO413.3g/L，(NH4)2HPO48g/L，MgSO4·7H2O1.2g/L，柠檬酸1.7g/L，EDTA 8.4mg/L，CoCl2·6H2O 2.5mg/L，MnCl2·4H2O 15.0mg/L，CuCl2·2H2O 1.5mg/L，H3BO33.0mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.5mg/L，Zn(CH3COO)2·2H2O 13.0mg/L，柠檬酸铁100.0mg/L，盐酸硫胺素4.5mg/L，氨苄青霉素100mg/L，pH7.0。
培养方法种子培养从平板培养基上挑取单菌落接种至装有10mL种子培养基的100mL三角瓶中培养，37℃，200rpm培养10-14h。
发酵培养将培养好的种子培养液按10％(v/v)的接种量，接种至装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中进行发酵培养，发酵温度37℃，摇床转速200rpm，发酵20h。
菌体酶法合成谷胱甘肽的反应过程发酵液经4800rpm，10min离心后，用蒸馏水洗涤2次，得到的湿菌体在-70℃下保存。将保存菌体解冻后，加入谷胱甘肽合成基础反应液，反应体系中菌体浓度为200mg湿菌体/ml，直接加入低浓度的有机溶剂或表面活性剂，37℃，150rpm反应2h，沸水浴中加热5min终止反应，离心收集上清，测定上清中谷胱甘肽含量。谷胱甘肽合成基础反应液L-Glu 40～60mmol.L-1，L-Cys 20～40mmol.L-1，Gly 20～40mmol.L-1，MgCl2·6H2O 25～30mmol.L-1，三磷酸腺苷20～30mmol.L-1，pH7.0磷酸钾缓冲液100～200mmol.L-1，pH7.0。
在微生物酶法合成高价值有用化合物反应体系中直接添加低浓度的有机溶剂或表面活性剂作为通透剂，以降低细胞外膜通透性屏障，提高高价值有用化合物的产量，例如在微生物酶法合成三磷酸腺苷的反应体系中，使用直接添加低浓度有机溶剂或表面活性剂作为通透剂，以降低细胞外膜通透性屏障，提高三磷酸腺苷的产量。
谷胱甘肽测定5，5’-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)法。在2mL比色皿中顺序加入100μL6mmol.L-1DTNB，700μL 0.3mmol.L-1NADPH和200μL适当浓度的样品，室温下加入100μL 50u.mL-1谷胱甘肽还原酶启动反应，测定412nm处反应体系的起始OD值以及1.5min后的OD值，根据OD值的变化速率与谷胱甘肽浓度关系计算出样品中的谷胱甘肽含量。
本发明的有益效果传统的通透性预处理方法通常包括将整细胞用通透剂进行处理-离心-洗涤等程序，本发明简化了微生物细胞通透性处理的程序，而只是向反应体系中直接添加低浓度的有机溶剂或表面活性剂，不再进行离心、洗涤等程序，避免了通透剂对细胞膜的损伤或细胞的裂解而造成离心时胞内物质丢失的可能，以降低细胞外膜的通透性屏障，最终谷胱甘肽产量达到4.8g/L。
具体实施例方式
实施例1对重组大肠杆菌E.coli WSH-KE1未作通透性处理，即在酶法合成谷胱甘肽基础反应液中，不加入低浓度的通透剂，利用其菌体酶法合成谷胱甘肽，其余条件如说明书所述，最终谷胱甘肽产量为1.4g/L。
实施例2对重组大肠杆菌E.coli WSH-KE1采用不同浓度甲苯、二甲苯或聚氧乙烯硬脂酸酰胺进行传统的预处理-离心-洗涤程序，利用其菌体酶法合成谷胱甘肽，其余条件如说明书所述，其最优的谷胱甘肽产量仅为2.5g/L。
实施例3在重组大肠杆菌E.coli WSH-KE1酶法合成谷胱甘肽的反应体系中，直接添加0.25％～2％(v/v)不同终浓度二甲苯，其余条件如说明书所述，在二甲苯终浓度达到1％(v/v)时，其最优的谷胱甘肽产量为3.5g/L。
实施例4在重组大肠杆菌E.coli WSH-KE1酶法合成谷胱甘肽的反应体系中，直接添加0.25％～2％(v/v)不同终浓度聚氧乙烯硬脂酸酰胺，其余条件如说明书所述，在聚氧乙烯硬脂酸酰胺终浓度达到1％(v/v)时，其最优的谷胱甘肽产量为3.6g/L。
实施例5在重组大肠杆菌E.coli WSH-KE1酶法合成谷胱甘肽的反应体系中，直接添加0.25％～2％(v/v)不同终浓度甲苯，其余条件如说明书所述，在甲苯终浓度达到0.5％(v/v)时，其最优的谷胱甘肽产量达到4.8g/L。
权利要求
1.一种促进微生物酶法合成谷胱甘肽的方法，其特征是在微生物酶法合成谷胱甘肽的反应体系中直接添加低浓度的有机溶剂或表面活性剂作为通透剂，通透剂在谷胱甘肽合成基础反应液中的体积百分终浓度达到0.25％～2.0％，以降低细胞外膜通透性屏障，提高谷胱甘肽的产量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是向微生物酶法合成谷胱甘肽的反应体系中直接添加的通透剂，包括直接添加有机溶剂甲苯或二甲苯；或直接添加表面活性剂聚氧乙烯硬脂酸酰胺。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是向微生物酶法合成谷胱甘肽的反应体系中直接添加的通透剂甲苯，在谷胱甘肽合成基础反应液中的体积百分终浓度达到0.5％为最佳；直接添加的通透剂二甲苯，在谷胱甘肽合成基础反应液中的体积百分终浓度达到1％为最佳；或直接添加的通透剂聚氧乙烯硬脂酸酰胺，在谷胱甘肽合成基础反应液中的体积百分终浓度达到1％为最佳。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述微生物酶法合成谷胱甘肽所用的微生物为重组大肠杆菌E.coli WSH-KE1，该菌种已在“ProcessBiochemistry”第33卷第7期，P709-714，1998年公开。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述微生物酶法合成谷胱甘肽所用的谷胱甘肽合成基础反应液为L-Glu 40～60mmol.L-1，L-Cys 20～40mmol.L-1，Gly 20～40mmol.L-1，MgCl2·6H2O 25～30mmol.L-1，三磷酸腺苷20～30mmol.L-1，pH7.0磷酸钾缓冲液100～200mmol.L-1，pH7.0。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述微生物酶法合成谷胱甘肽的条件为发酵液经4800rpm，10min离心后，用蒸馏水洗涤2次，得到的湿菌体在-70℃下保存，将保存菌体解冻后，加入谷胱甘肽合成基础反应液，反应体系中菌体浓度为200mg湿菌体/ml，直接加入低浓度的有机溶剂或表面活性剂，37℃，150rpm反应2h，沸水浴中加热5min终止反应，离心收集上清，测定上清中谷胱甘肽含量。
7.一种促进微生物酶法合成高价值有用化合物的方法，其特征是在微生物酶法合成高价值有用化合物反应体系中直接添加低浓度的有机溶剂或表面活性剂作为通透剂，以降低细胞外膜通透性屏障，提高高价值有用化合物的产量。
全文摘要
一种促进微生物酶法合成谷胱甘肽的方法，涉及利用微生物细胞酶法合成高价值有用化合物技术领域。以重组大肠杆菌酶法合成谷胱甘肽为例，本发明以培养的重组大肠杆菌E.coli WSH－KE1细胞作为酶源，通过向反应体系中直接添加低浓度的有机溶剂或表面活性剂，以降低细胞外膜的通透性屏障，在三磷酸腺苷(ATP)存在下催化L－Glu，L－Cys和Gly合成谷胱甘肽，反应2小时谷胱甘肽合成量可达4.8g/L。本发明简化了微生物细胞通透性处理的程序，避免了通透剂对细胞膜的损伤或细胞的裂解而造成离心时胞内物质丢失的可能，最终提高了谷胱甘肽产量。
文档编号C12P21/02GK1814780SQ200510122930
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月5日 优先权日2005年12月5日
发明者堵国成, 廖鲜艳, 陈坚, 朱至 申请人:江南大学