专利名称：生物聚合物用微阵列基板、杂交设备和杂交方法
技术领域：
本发明涉及生物聚合物(例如DNA和RNA)用微阵列基板、使用该基板的杂交设备以及使用所述设备提高杂交速度的杂交方法。
背景技术：
通常，在基因诊断、病原体的确定和单核苷酸多态性的检测等应用中，为了检测出作为检测目标的核酸(靶核酸)，广泛使用探针核酸和靶核酸之间的杂交技术。近来，实际应用的是其具有大量被固定在基板上的探针核酸的DNA芯片和DNA微阵列，并且使用杂交技术来检测靶核酸。
在生物聚合物微阵列(例如DNA芯片或DNA微阵列)的制造过程中，必须将大量探针DNA作为样点分别排列并固定在基板上。DNA固定方法的例子包括这样的方法使硫醇与单链DNA结合，并且将硫醇化的单链DNA固定在(例如)金属基板上。
使作为检测目标的靶DNA作用在固定的探针DNA上，以检测它们之间是否杂交。可以通过例如使用荧光法来检测是否杂交，该方法包括测量与探针DNA杂交的荧光标记靶DNA样点发出的荧光。
样点型DNA微阵列是通过以下步骤制成的将含有探针DNA的液滴置于基板上，然后使其干燥(参见非专利文献1)。因此，这种DNA微阵列的优点是生产成本低，然而其缺点是不能保证被固定到基板上的DNA是均匀的。即，其缺点是DNA检测样点的尺寸和形状不同。
另外，在样点型DNA微阵列的情况中，由于在DNA检测样点周围的附着有固相化剂，所以靶DNA被非特异性地吸附在基板上，从而使噪声增大，并且引起S/N比例降低的问题(参见非专利文献1)。
在测量荧光时，要实施用来确定荧光部分的所谓网格化(Gridding)操作。网格化是指这样的操作输入样点的数量、阵列上样点纵向之间和横向之间的间距以及样点的直径，并且用圆形圈住样点(参见非专利文献1)。然而，如果压印形状和样点的位置不稳定，则在测量荧光时网格化操作花费的时间长，并且使精确分析变得困难。
此外，在网格化操作过程中，如果样点的位置被移动，则样点就不能被正确地圈住。因此，执行网格化操作的软件安装有自动修正位置的功能。然而，并不是所有的操作都是自动的，样点的起始点需要手动设定，并且所有样点的网格都必须要用眼睛来确认和修正。如果DNA样点的数量在几千个以上，那么所述操作是非常复杂的并且花费的时间长，这会成为降低分析速度的一个因素。
另一方面，固定在基板上的探针DNA与作为样品的靶DNA之间的杂交通常要十个小时以上。此外，杂交需要大量的样品。结果，如此长的杂交时间和大量样品的制备需要大量的时间、成本和劳动。特别是如果分析表达量低的基因，那么就需要非常多的样品。
“必ずデ一タが出るDNAマイクロアレイ マニユァル基本原理、チツプ作成技術からバイオインフオマテイクスまで”，第一版，羊土社出版，2002年12月1日，第19-21、35和106-108页。
发明内容
本发明的目的是解决这类问题。本发明提供了这样的生物聚合物杂交用基板、生物聚合物杂交设备和杂交方法，它们可以提高生物聚合物的杂交速度，这是通过向平面电极施加交流电压或直流电压以产生电场，从而进行介电电泳(dielectrophoresis)和电泳(electrophoresis)而实现的；并且可以通过激光等读取杂交的生物聚合物。
为了完成该课题，本发明提供如下发明内容。
(1)关于生物聚合物检测用微阵列基板一种生物聚合物用微阵列基板，其中该基板上设置有与直流或交流电源相连的、成对的两条导电路径，在导电路径图案的一部分中，所述的两条导电路径被布置成彼此相邻到使得这两条导电路径之间的电场分布局部增强的程度；并且在该相邻部分的导电路径上或该相邻部分的附近固定有生物聚合物检测用探针分子。
(2)关于生物聚合物检测用微阵列基板一种生物聚合物用微阵列基板，其中该基板上设置有与直流或交流电源相连的、成对的两条导电路径，在导电路径图案的一部分中，所述的两条导电路径被布置成彼此相邻到使得这两条导电路径之间的电场分布局部增强的程度；并且在与所述基板相向设置的对面基板上固定有生物聚合物检测用探针分子，该探针分子固定在该对面基板的与所述相邻部分的导电路径相面对的位置上或与该相邻部分的附近相面对的位置上。
根据所述结构，通过在所述导电路径之间施加交流电压或直流电压，以产生这样的电场分布该电场在所述的相邻布置的导电路径之间达到局部增强，接着所述生物聚合物可以在所述导电路径的经布置的部分中进行介电电泳或电泳，并且很容易地被富集。
(3)生物聚合物用微阵列基板，其具有两个或多个导电路径的相邻部分。
(4)根据(1)或(2)所述的生物聚合物用微阵列基板，其中将玻璃、塑料或陶瓷用作所述基板，并且所述导电路径是通过蚀刻或印刷的方法在玻璃基板上形成的。
(5)根据(1)到(4)中的任意一项所述的生物聚合物用微阵列基板，其中所述导电路径在固定有所述探针分子的区域以外的区域中与溶液绝缘。
(6)根据(1)到(5)中的任意一项所述的生物聚合物用微阵列基板，其具有用于在杂交后检测是否杂交的电极，该电极与所述导电路径不同。
(7)一种生物聚合物杂交设备，该设备包括根据(1)到(6)中的任意一项所述的生物聚合物用微阵列基板；以及电源，用于向被设置在所述基板上的两条导电路径施加交流电压或者直流电压，其中由所述电源向所述导电路径施加电压以产生电场，使得所述基板上的溶液中所含的样品生物聚合物靶物可以沿所述电场进行介电电泳或电泳。
根据该结构，通过由电源在所述导电路径之间施加交流电压或直流电压，以产生这样的电场分布该电场在所述的相邻布置的导电路径之间达到局部增强，接着所述生物聚合物可以在所述导电路径的经布置的部分中进行介电电泳或电泳，并且很容易地被富集；此外还可以容易地获得能提高杂交速度的杂交设备。
(8)根据(7)所述的生物聚合物杂交设备，其中由透明材料制成的盖板被设置成与设有所述导电路径的基板的表面相面对，使得可以通过该盖板来观察由带有荧光标记的杂交的生物聚合物所发出的荧光。
(9)根据(7)所述的生物聚合物杂交设备，其中所述导电路径是在由透明材料制成的盖板上形成的，使得可以从该盖板的背面来观察由带有荧光标记的杂交的生物聚合物所发出的荧光。
(10)一种通过使用根据(7)到(9)中的任意一项所述的设备进行生物聚合物杂交的方法，该方法包括如下步骤将所述电源输出的交流电压或直流电压施加在所述的导电路径之间以产生电场，使得自然扩散在溶液中的样品生物聚合物靶物经介电电泳或电泳而被富集在所述导电路径的附近。
根据该方法，可以容易地加快杂交速度。
(11)根据(10)所述的用于生物聚合物的杂交方法，该方法包括在杂交后，通过荧光信号或电流值来检测所述的样品生物聚合物靶物的步骤。
如上所述，本发明具有以下效果(1)可以容易地分别实现以下内容生物聚合物用微阵列基板，其中在被相邻布置于基板上的二极导电路径(以下，将这些导电路径部分称为平面电极)之间施加交流电压或直流电压，以便在平面电极的附近产生电场，并且由此可以将生物聚合物富集在平面电极的附近；使用该微阵列基板的杂交设备；以及提高杂交速度的方法。
(2)此外，在该杂交设备中，被设置成与具有平面电极表面的基板的表面相面对的盖板是由透明材料制成的，并且通过该盖板，可以容易地由读取装置通过传统的激光等来读取由带有荧光标记的杂交的生物聚合物所发出的荧光，从而使该杂交设备具有这样的优点传统的读取装置可以照样使用。
(3)本发明的基板是仅仅通过将平面电极安装到传统的基板上而制成的，并且可以容易地制成生产成本低的生物聚合物微阵列(例如DNA芯片)。
(4)这种平面电极图案是具有高反射率的金属，因此可以容易地通过测量反射图像来进行网格化。
图1是示出根据本发明的生物聚合物杂交设备的一部分的实施方案的结构图。
图2示出平面电极的形状。
图3示出生物聚合物样点的例子。
图4示出生物聚合物样点的另一个例子。
图5示出平面电极和探针DNA的设置方式的另一个例子。
图6示出平面电极和探针DNA的设置方式的另一个例子。
图7示出平面电极和探针DNA的设置方式的另一个例子。
图8示出平面电极和探针DNA的设置方式的另一个例子。
参考标号的简单说明1.生物聚合物杂交设备2.基板3、31、32、33.平面电极4、41、42、43.平面电极3a、4a.导线5.盖板6.探针DNA61、62、63、64.生物聚合物样点
7.样品靶DNA8.溶液10.电源20.读取装置的物镜具体实施方式
以下参考附图详细描述本发明。
图1是示出根据本发明的生物聚合物杂交设备的一部分的实施方案的结构图，该图还示出了被设置在读取装置(用来读取杂交的生物聚合物的荧光标记)内的物镜。
本实施方案通过使用DNA作为生物聚合物的例子来进行描述。
在图1中，参考标号1表示生物聚合物杂交设备，并且参考标号20表示读取装置的物镜。生物聚合物杂交设备1包括基板2；平面电极3和4，其作为二极导电路径部分被安装在基板2的顶面，这两个导电路径在此处被布置的非常接近；盖板5，其由透明材料制成；以及电源10，用于在平面电极3和4之间施加电场。
在平面电极3和4的上面，固定有探针DNA 6。在基板2和盖板5之间的空间中充满了含有样品靶DNA 7的溶液8。该结构是这样的基板2和盖板5被侧壁(图中没有示出)包围而形成密封的容器，以便阻止溶液8流出。此外，虽然图中示出了与一个位点相关的平面电极3和4以及探针DNA 6，然而，在一个DNA芯片或DNA微阵列上，这种平面电极是以预定的间隔被设置在多个位点上的。
平面电极3和4被如此设置在相邻的位置上，使得这两个电极在基板2上彼此不相接触。平面电极可以使用图2的图2A到图2C中所示的形状。
图2A是具有圆形电极和围绕该圆形电极的环形电极的平面电极，其中圆形电极31和环形电极41分别通过导线3a和4a与电源10相连。此外，图2B是相互嵌套排列的梳状的平面电极，其中电极32和42分别通过导线3a和4a与电源10相连。并且，图2C是成相互盘旋状的电极，其中电极33和43分别通过导线3a和4a与电源10相连。
可以将这种形状的平面电极安装在基板2的表面上，然而，也可按如下方式来制备。使用具有抛光表面的玻璃片作为基板2。采用真空沉积的方法在该玻璃表面上沉积金。在其上涂覆抗蚀剂并且烘烤。然后，使用UV曝光装置使紫外光辐射通过光掩模来辐射玻璃片。在辐射后进行显象，在金表面上形成了具有如图2所示的电极形状的抗蚀剂图案。
除抗蚀剂图案以外的金表面被金蚀刻剂蚀刻。通过这样的操作，可以制成具有金图案(其具有根据光掩模的电极形状)的玻璃基板。可以通过以相同的方式进行的图案化操作而制成导线。
以下说明在该结构中的操作。探针DNA 6预先被压印并被固定在电极表面上。例如，在图2A中，探针DNA被点样在电极31的圆形部分中，并且被固定在该圆形电极上。用含有荧光标记的样品靶DNA 7的溶液8充满介于基板2和盖板5之间的空间。然后，由电源10在平面电极31和41之间施加交流电压。结果，电极31和41之间的电场密度增大，并且自然扩散在溶液8中的带负电荷的样品靶DNA 7通过介电电泳被吸引到电极部分31和41的附近，从而被富集。
结果，可以促进探针DNA 6(其被固定在电极部分上)和样品靶DNA 7之间的杂交。这种采用交流电压所产生的促进效果由例如以下文献阐明“次世代DNA マイクロアレイシステムの開発—MESA型アレイにぉけるハイブリツド形成の增進効果”(由葛西耕平、畠山哲、岛村贵之、近藤恭光、田代朋子和田代英夫在2003年12月10日-13日在神户国际展览馆举办的日本分子生物学会第26次年会上所发表)。
杂交后，未被杂交的样品靶DNA与溶液8一起被洗掉，并且用从读取装置侧穿过盖板5(作为透明窗口)的激发光(例如激光)来辐射与探针DNA杂交的样品靶DNA 7。由荧光标记发出的荧光穿过盖板5进入目镜20，并由读取装置读取。以这种方式，可以测量与探针DNA杂交的样品靶DNA 7。
为了读取荧光标记DNA，可以使用共焦扫描显微镜和非扫描多光束型读取装置等。
被施加给电极3和4的电压可以是交流电压，也可以是直流电压。如果在上述实施方案中施加交流电压，则在频率低的情况下由于在含有样品靶DNA 7的溶液中发生电解而通常产生气泡等。因此优选的是使用高频交流电压。
另一方面，如果施加直流电压，则在施加高电压时，含有样品靶DNA 7的溶液由于高电压而发生电解，从而造成产生泡沫等方面的问题。因此，优选的是使用低电压。带有负电荷的样品靶DNA 7被聚集在正极侧的电极上。
关于电源10，根据要施加的电压是交流电压还是直流电压，来使用交流电源或直流电源。可供选用的另一种方式是，可以使用这样的电源该电源通过设定可以选择性地输出交流电压或直流电压中的任意一种。
本发明不限于上述实施方式，并且可以在不脱离本发明精神实质的条件下，对本发明做出多种修改或改变。
例如，可以将多个图2A到图2C所示的相邻电极部分以阵列的形式设置在基板上。结果，可以同时分析大量的DNA样品。
此外，如图3A到图3C所示，可以将多种类型的生物聚合物样点分别独立地点样在一个相邻电极部分上。
另外，如图4所示，探针DNA 65、66、67...6n的点样可以不在平面电极上进行，而是在平面电极附近的区域中进行。在这种情况下，由于靶DNA 7在电极附近以高浓度存在，所以可以加速杂交。
此外，如图5所示，可将平面电极3和4以及探针DNA 6设置在用来读取荧光的透明盖板5的这一侧上。在这种情况下，探针DNA6被固定在透明的平面电极上。
另外，如图6所示，可将探针DNA 6设置在平面电极附近的区域中。在这种情况下，平面电极不必透明。
此外，可以如图7和图8所示进行设置。在其中任意一幅图中，对于基板2，使用具有以下结构的基板2其中在平板上具有平顶圆柱形突出部分2a或者四棱柱形突出部分2a。平面电极和探针DNA被设置在相对的面上。即，在图7中，平面电极3和4被安装在突出部分2a的顶部，并且探针DNA 6被固定在透明盖板5的底部。在图8中，平面电极3和4被安装在透明盖板5的底部，并且探针DNA 6被安装在突出部分2a的顶部。
在这种情况下，间隙a优选为较狭窄，所述间隙a为图7中的盖板5与平面电极3和4之间的间隙a、以及图8中的平面电极3和4与突出部分2a之间的间隙a。
此外，除了相邻部分以外，也可能会从导线处发生电解，然而，可以采用如下的结构使其与溶液绝缘用绝缘膜覆盖除了固定有生物聚合物以外(固定位点以外)的其它区域。
此外，除了可以通过使用预先经荧光标记的靶DNA等来进行检测以外，还可以通过这样的方法进行检测杂交之后，在DNA双链间插入嵌入型试剂，从而通过荧光信号或电流值进行检测。另外，也可以不通过荧光而是通过吸光率或磷光进行检测。
在电流检测的情况下，除了用于杂交的导电路径以外，还可以单独设置检测用专用电极和检测电路。
工业实用性根据本发明，可以在通常的基因表达分析中以非常高的速度进行杂交，并且如果分析表达量低的基因，则以高速进行杂交也成为可能，而无需制备传统方法所必需的大量样品。
权利要求
1.一种生物聚合物用微阵列基板，其中该基板上设置有与直流或交流电源相连的、成对的两条导电路径，在导电路径图案的一部分中，所述的两条导电路径被布置成彼此相邻到使得这两条导电路径之间的电场分布局部增强的程度；并且在该相邻部分的导电路径上或该相邻部分的附近固定有生物聚合物检测用探针分子。
2.一种生物聚合物用微阵列基板，其中该基板上设置有与直流或交流电源相连的、成对的两条导电路径，在导电路径图案的一部分中，所述的两条导电路径被布置成彼此相邻到使得这两条导电路径之间的电场分布局部增强的程度；并且在与所述基板相向设置的对面基板上固定有生物聚合物检测用探针分子，该探针分子固定在该对面基板的与所述相邻部分的导电路径相面对的位置上或与该相邻部分的附近相面对的位置上。
3.根据权利要求1或2所述的生物聚合物用微阵列基板，该基板具有2个或多个所述的相邻部分。
4.根据权利要求1到3中的任意一项所述的生物聚合物用微阵列基板，其中所述基板是玻璃、塑料或陶瓷，并且所述的两条导电路径是通过蚀刻或印刷的方法在所述基板上形成的。
5.根据权利要求1到4中的任意一项所述的生物聚合物用微阵列基板，其中所述导电路径在固定有所述探针分子的区域以外的区域中与溶液绝缘。
6.根据权利要求1到5中的任意一项所述的生物聚合物用微阵列基板，该基板具有用于在杂交后检测是否杂交的电极，该电极与所述导电路径不同。
7.一种生物聚合物杂交设备，该生物聚合物杂交设备包括根据权利要求1到6中的任意一项所述的生物聚合物用微阵列基板；以及电源，用于向被设置在所述基板上的两条导电路径施加交流电压或者直流电压，其中由所述电源向所述导电路径施加电压以产生电场，使得所述基板上的溶液中所含的样品生物聚合物靶物可以沿所述电场进行介电电泳或电泳。
8.根据权利要求7所述的生物聚合物杂交设备，其中由透明材料制成的盖板被设置成与设有所述导电路径的基板的表面相面对，使得可以通过该盖板来观察由带有荧光标记的杂交的生物聚合物所发出的荧光。
9.根据权利要求7所述的生物聚合物杂交设备，其中所述导电路径是在由透明材料制成的盖板上形成的，使得可以从该盖板的背面来观察由带有荧光标记的杂交的生物聚合物所发出的荧光。
10.一种通过使用根据权利要求7到9中的任意一项所述的设备进行生物聚合物杂交的方法，该方法包括如下步骤将所述电源输出的交流电压或直流电压施加在所述的导电路径之间以产生电场，使得自然扩散在溶液中的样品生物聚合物靶物经介电电泳或电泳而被富集在所述导电路径的附近。
11.根据权利要求10所述的用于生物聚合物的杂交方法，该方法包括在杂交后，通过荧光信号或电流值来检测所述的样品生物聚合物靶物的步骤。
全文摘要
本发明提供这样的生物聚合物杂交用基板、生物聚合物杂交设备和生物聚合物杂交方法，它们可以提高生物聚合物的杂交速度，这是通过向平面电极施加交流电压或直流电压以产生电场，从而进行介电电泳或电泳而实现的；并且可以通过激光等读取杂交的生物聚合物。
文档编号C12M1/00GK1934452SQ20058000644
公开日2007年3月21日 申请日期2005年2月17日 优先权日2004年3月1日
发明者田名纲健雄, 田代英夫 申请人:横河电机株式会社