专利名称：具有光学活性的醇和羧酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及使属于伊氏酵母属(Issatchenkia)等的微生物、该微生物处理物和/或该微生物的培养物与2-戊酮或2-己酮作用，制备作为药物、农药等中间体原料的工业上有用的化合物(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的方法，还涉及使表达下述DNA的转化细胞、该细胞处理物和/或该细胞培养液与2-戊酮或2-己酮作用，制备(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的方法，其中所述DNA编码由上述微生物所得的、具有还原羰基并合成光学活性醇的能力的蛋白质(羰基还原酶)。本发明还涉及光学活性1-甲基烷基丙二酸及其制备方法、以及光学活性3-甲基羧酸的制备方法。
背景技术：
已知化学制备(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的方法例如有在含有聚酰胺型胺类和葡糖酸内酯的树枝状聚合物存在下，对2-戊酮进行还原的方法(J.Am.Chem.Soc.、123卷、5956-5961页、2001年)；或者使用光学活性硼对2-己酮进行还原的方法(特开平11-240894)等。但是，它们都无法满足产物的光学纯度要求。
另-方面，作为用微生物的菌体和/或该菌体处理物生成光学活性的醇化合物的方法，已知有使微生物与外消旋的酯化合物作用，通过光学选择性水解酯，生成光学活性的醇化合物的方法(特开平10-4998)，但这有收率低的问题，另外还有必须舍弃不是所需要的立体化学醇或其酯等问题。另外，作为立体选择性还原具有酮基的化合物，生成光学活性的醇化合物的方法，已知有使微生物与2-戊酮或2-己酮作用进行制备的方法(TetrahedronAsymmetry、14卷、2659-2681页、2003年)，但是产物的光学纯度或生产浓度无法满足要求，菌体固定或者用于丙酮处理等反应中的菌体的前处理复杂，底物的加入浓度低等，无法实际应用。
已知光学活性1-甲基烷基丙二酸是作为医药农药中间体的有用的化合物。还已知光学活性3-甲基羧酸也同样是作为医药农药中间体的有用的化合物。
光学活性1-甲基丁基丙二酸是可用作显示神经抑制作用的巴比土酸衍生物的中间体的化合物(例如参照WO 00/24358)。另外，可由光学活性1-甲基烷基丙二酸合成的光学活性3-甲基己酸和光学活性3-甲基庚酸可用作前列腺素类等药物中间体(例如参照特开昭62-265279)。
已有人报道使用光学活性的2-戊醇进行(S)-1-甲基丁基丙二酸的合成(J.Am.Chem.Soc.，1950，72，4695)。但，该方法中，为了获得光学活性2-戊醇，采用了将外消旋体的2-戊醇制成邻苯二甲酸单酯，用番木鳖碱分割后水解这样非常复杂的方法，另外由于是分割，有一半的量无法利用，并且对于要分割的醇，辅助基团、分割基团的分子量大，效率非常低。
还已知有几个通过1-甲基烷基丙二酸的脱羧反应合成3-甲基羧酸的例子(例如参照J.Am.Chem.Soc.，1950，72，4695、以及NouveauJournal de Chime，1985，9，557)。但是它们都需要难以控制反应的无溶剂、一次性添加法、并且高温(180℃)等，因此在工业上难以实施。
还已知通过使用添加剂，对与本发明不同的底物在低温下进行脱羧的方法。但是对于在氧化铜存在下、在乙腈中回流的方法(参照J.Am.Chem.Soc.，1993，115，801)或在硫酸存在下进行加热的方法(参照Org.Lett.，2002，4，1571)，在验证它们是否可适用于本发明的底物时，均未观测到显著的反应加速效果。由此可知，使用添加剂使脱羧反应低温化的方法根据化合物的不同有可适用也有不能适用的情况。
另一方面，已知有在溶剂中、在100-150℃左右的温度下进行反应的例子(例如参照J.Org.Chem.，1983，48，2994)，但是没有关于溶剂效果验证的报道，另外，根据底物不同，脱羧时所必须的反应温度有差异，溶剂使脱羧反应低温化的效果不明确。
除此之外，对于产生的二氧化碳的控制等安全方面未有考虑，脱羧反应的工业化实施尚残留很多未解决课题。
作为被认为是光学活性1-甲基丁基丙二酸的合成前体的光学活性1-甲基丁基丙二酸酯的合成方法，已知有由香茅醇衍生的方法(例如参照WO 00/24358)，但存在多步骤且低收率等问题。另外，作为光学活性1-甲基戊基丙二酸酯的合成法，已知有通过不对称1，4-加成反应进行合成的方法(例如参照Tetrahedron Asym.，2001，12，1151)，但无法获得足够的光学纯度(最大50％e.e.)，不能实际应用。
另一方面，作为可由光学活性1-甲基烷基丙二酸合成的光学活性3-甲基己酸或光学活性3-甲基庚酸的合成方法，已知有对具有不对称辅助基团的巴豆酸衍生物进行有机铜试剂的加成反应(例如参照Helv.Chim.Acta.，1985，68，212)。但是，该方法需要向分子内导入成本高的不对称辅助基团，另外，需要使用大量有机铜试剂，废液处理成为问题，不能说是适合工业的方法。还已知外消旋化合物的光学分割(例如参照特开昭62-265279)，但通过分割，具有目标立体构型的化合物最多只可取得50％，效率差，要废弃一半量的不需要的立体构型化合物，环境压力大。另外，还已知由香茅酸等衍生的方法(例如参照美国专利第5136020号和Tetrahedron，1977，33，289)，但其也存在步骤多且收率低等问题。
还有光学活性1-甲基丁基丙二酸的合成例(J.Am.Chem.Soc.，1950，72，4695)，但其中记载溴化后在与丙二酸酯偶联时，光学纯度大幅降低，之后，在衍生为光学活性1-甲基丁基丙二酸后即使反复重结晶，也只能将光学纯度提高至70％e.e.。即，以往的方法无法合成具有医药农药中间体所必需的高光学纯度的光学活性1-甲基丁基丙二酸，必须研究使光学纯度不降低的合成方法。
还已知光学活性1-甲基庚基丙二酸(参照Nouveau Journal deChime，1985，9，557)、以及用放射性元素标记的光学活性1-甲基丙基丙二酸(参照J.Am.Chem.Soc.，1980，102，7344)的合成例。但是，与丙二酸酯反应时需要长时间(12小时或以上)，并且用二羧酸重结晶时需要大量溶剂(50倍体积量)，脱羧反应中需要高温(180℃)，成本高效率低，因此在工业实施方面有诸多不利因素。并且对于这些化合物的光学纯度只报告了旋光度，正确的光学纯度还是不明确。
发明内容
本发明的目的在于提供可工业化、简便、低成本地制备光学纯度更高的(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇、优选光学纯度为99.0％e.e.或以上的(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的新型制备方法。本发明的另一目的在于提供可以以高光学纯度获得光学活性1-甲基烷基丙二酸和光学活性3-甲基羧酸的低成本且高效的工业化制备方法。
本发明人为解决上述课题，对(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的制备方法进行了深入研究，结果发现通过使用属于酒香酵母属(Brettanomyces)等的某些微生物，以2-戊酮或2-己酮为底物，可简便、高效地生成(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇。并且，从上述微生物之一的伊氏酵母属微生物中分离还原2-戊酮或2-己酮，生成(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的羰基还原酶、以及编码该酶的DNA，对其碱基序列进行了分析。还制备了表达该DNA的转化体，使该转化细胞、该细胞处理物和/或该细胞培养液与作为原料的2-戊酮或2-己酮作用，发现由此可以以高光学纯度且高浓度获得目标物(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇。
本发明人又发现将光学活性醇变换成离去基团，然后用碳亲核体处理所得的化合物，可以保持高光学纯度进行置换反应，将所得光学活性化合物水解，然后通过晶析，可以以高光学纯度、高效地制备光学活性1-甲基烷基丙二酸。还建立了工业化简便且优异的制备方法，该制备方法是通过脱羧将光学活性1-甲基烷基丙二酸变换成光学活性3-甲基羧酸，此时通过使用高极性溶剂和/或促进脱羧的添加剂，可以在比以往的方法大幅温和的条件下进行反应，且可以控制二氧化碳的产生。
本发明根据以上认识得以实现。
即，本发明提供以下的发明。
1.制备(S)-2-戊醇的方法，该方法是使由微生物或转化细胞、该微生物或细胞处理物、该微生物或细胞培养液、和/或从该微生物或细胞得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与2-戊酮作用，制备(S)-2-戊醇的方法，其特征在于该微生物或转化细胞在其未经溶剂前处理的活菌体与2-戊酮作用时，可生成95％e.e.或以上光学纯度的(S)-2-戊醇，且其产率为1mg(S)-2-戊醇/g干菌体重量/小时或以上。
2.制备(S)-2-己醇的方法，该方法是使由微生物或转化细胞、该微生物或细胞处理物、该微生物或细胞培养液、和/或从该微生物或细胞得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与2-己酮作用，制备(S)-2-己醇的方法，其特征在于该微生物或转化细胞在其未经溶剂前处理的活菌体与2-己酮作用时，可生成95％e.e.或以上光学纯度的(S)-2-己醇，且其产率为1mg(S)-2-己醇/g干菌体重量/小时或以上。
3.高光学纯度的(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的制备方法，其特征在于使由选自酒香酵母属(Brettanomyces)、假丝酵母属(Candida)、Hortaea、伊氏酵母属(Issatchenkia)、路德酵母属(Lodderomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、短小杆菌属(Crutobacterium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、副球菌属(Paracoccus)、根瘤菌属(Rhizobium)、红球菌属(Rhodococcus)的微生物、该微生物处理物、该微生物培养液、和/或从该微生物得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与2-戊酮或2-己酮作用，生成(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇。
4.高光学纯度的(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的制备方法，其特征在于使表达下述DNA的转化细胞、该细胞处理物、该细胞培养液、和/或从该细胞得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与2-戊酮或2-己酮作用，生成(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇，其中，所述DNA编码由下述微生物得到的羰基还原酶，所述微生物选自酒香酵母属(Brettanomyces)、假丝酵母属(Candida)、Hortaea、伊氏酵母属(Issatchenkia)、路德酵母属(Lodderomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、短小杆菌属(Crutobacterium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、副球菌属(Paracoccus)、根瘤菌属(Rhizobium)、红球菌属(Rhodococcus)。
5.权利要求3或4的制备方法，其特征在于所述微生物是选自布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)、异酒香酵母(Breettanomyces anomalus)、无名假丝酵母(Candida famata)、克柔假丝酵母(Candida krusei)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、诞沫假丝酵母(Candida zeylanoides)、Hortaea werneckii、Issatchenkia scutulata、Lodderomyces elongisporus、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、Pichia besseyi、Pichia cactophila、Pichia segobiensis、斯巴达克毕赤酵母(Pichia spartinae)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、微小红酵母(Rhodotorula minuta)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)、多色节杆菌(Arthrobacterpolychromogenes)、节杆菌属某种(Arthrobacter sp.)、硫磺色节杆菌(Arthrobacter sulfurous)、Brevibacterium butanicum、萎蔫短小杆菌(Curtobacterium flaccumfaciens)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、解角质微杆菌(Microbacterium keratanolyticum)、天牛微杆菌(Microbacterium saperdae)、微杆菌属某种(Microbacteriumsp.)、砖红色微杆菌(Microbacterium testaceum)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、苍白杆菌属某种(Ochrobactrum sp.)、卵状假单胞杆菌(Pseudomonas ovalis)、脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、红球菌属某种(Rhodococcus sp.)、解烃棒杆菌(Corynebacterium hydrocarboclastum)的微生物。
6.高光学纯度的(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的制备方法，其特征在于使表达下述(A)-(F)中任一项的DNA的转化细胞、该细胞处理物和/或该细胞培养液与2-戊酮或2-己酮作用，生成(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇(A)编码具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；(B)编码下述蛋白质的DNA，所述蛋白质具有在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中1至多个氨基酸缺失、添加或取代后所得的氨基酸序列、并且具有还原羰基、合成光学活性醇的能力；(C)编码下述蛋白质的DNA，所述蛋白质具有与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列有50％或以上的同源性的氨基酸序列、并且具有还原羰基、合成光学活性醇的能力；(D)具有SEQ ID NO.2所示碱基序列的DNA；(E)具有SEQ ID NO.2所示碱基序列中1至多个碱基缺失、添加或取代后所得的碱基序列、并且具有编码下述蛋白质的碱基序列的DNA，所述蛋白质具有还原羰基、合成光学活性醇的能力；(F)具有与SEQ ID NO.2所示碱基序列或其互补序列在严格条件下杂交的碱基序列，并且具有编码下述蛋白质的碱基序列的DNA，所述蛋白质具有还原羰基、合成光学活性醇的能力。
7.下述通式(5)所示的(R)或(S)-3-甲基羧酸的制备方法，其特征在于 在高极性溶剂和/或促进脱羧作用的添加剂存在下，使下述通式(1)所示的具有光学活性的(R)或(S)-1-甲基烷基丙二酸脱羧，
其中，式(1)中，R1表示碳原子数为3-5的烷基，*表示不对称碳原子；式(5)中，R1与前述含义相同，*表示不对称碳原子。
8.下述通式(1)所示的(R)或(S)-1-甲基烷基丙二酸的制备方法，其特征在于 使下述通式(2)所示的光学活性醇与磺酰化剂反应，得到下述通式(3)所示的光学活性化合物， 然后在碱存在下，与通式(9)所示的碳亲核体反应，制成下述通式(4)所示的光学活性化合物，然后进行水解， 其中，式(1)中，R1表示碳原子数为3-5的烷基，*表示不对称碳原子；
式(2)中，R1与前述含义相同，*表示不对称碳原子；式(3)中，R1与前述含义相同，X表示磺酰基氧基，*表示不对称碳原子；式(9)中，R2和R3各自独立地表示酯基、羧基或氰基，其中R2和R3可一起形成环状结构；式(4)中，R1、R2和R3与前述含义相同，*表示不对称碳原子。
9.下述通式(1)表示的、光学纯度为90％ee或以上的(R)-1-甲基烷基丙二酸或(S)-1-甲基烷基丙二酸 式(1)中，R1表示碳原子数为3-5的烷基，*表示不对称碳原子。
10.权利要求9的(R)-1-甲基烷基丙二酸或(S)-1-甲基烷基丙二酸，其中R1为正丙基或正丁基。
11.通式(6)所示光学活性体的制备方法，该方法包括使下述微生物或转化细胞、该微生物或细胞处理物、该微生物或细胞培养液、和/或从该微生物或细胞得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与2-戊酮作用，变换成(S)-2-戊醇，再将所得的(S)-2-戊醇与磺酰化剂反应，变换成下述通式(6)所示的光学活性体， 其中，式(6)中，R4表示正丙基，X表示磺酰基氧基；所述微生物或转化细胞是包含具有与2-戊酮反应、生成(S)-2-戊醇的活性的羰基还原酶的微生物或转化细胞，其在未经溶剂前处理的活菌体与2-戊酮作用时，可生成95％e.e.或以上光学纯度的(S)-2-戊醇，且其产率为10mg(S)-2-戊醇/g干菌体重量/小时或以上。
12.通式(6)所示光学活性体的制备方法，该方法包括使下述微生物或转化细胞、该微生物或细胞处理物、该微生物或细胞培养液、和/或从该微生物或细胞得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与2-己酮作用，变换成(S)-2-己醇，再将所得的(S)-2-己醇与磺酰化剂反应，变换成下述通式(6)所示的光学活性体， 其中，式(6)中，R4表示正丁基，X表示磺酰基氧基；所述微生物或转化细胞是包含具有与2-己酮反应、生成(S)-2-己醇的活性的羰基还原酶的微生物或转化细胞，其在未经溶剂前处理的活菌体与2-己酮作用时，可生成95％e.e.或以上光学纯度的(S)-2-己醇，且其产率为10mg(S)-2-己醇/g干菌体重量/小时或以上。
13.权利要求11或12的方法，该方法还包括在碱存在下，使所得的通式(6)所示的光学活性体与通式(9)所示的碳亲核体反应，变换成下述通式(7)所示的光学活性化合物的步骤 式(9)中，R2和R3各自独立地表示酯基、羧基或氰基，其中R2和R3可一起形成环状结构； 式(7)中，R2和R3与前述含义相同，R4为正丙基或正丁基。
14.(R)-1-甲基丁基丙二酸或(R)-1-甲基戊基丙二酸的制备方法，其特征在于在碱存在下，使由权利要求11或12的方法得到的通式(6)所示的光学活性体与通式(9)所示的碳亲核体反应，变换成下述通式(7)所示的光学活性化合物，
再将所得光学活性化合物水解，变换成下述通式(8)所示的(R)-1-甲基丁基丙二酸或(R)-1-甲基戊基丙二酸， 其中，式(9)中，R2和R3各自独立地表示酯基、羧基或氰基，R2和R3可一起形成环状结构；式(7)中，R2和R3与前述含义相同，R4为正丙基或正丁基；式(8)中，R4与前述含义相同。
15.(R)-3-甲基己酸或(R)-3-甲基庚酸的制备方法，其特征在于在碱存在下，使由权利要求11或12的方法得到的通式(6)所示的光学活性体与通式(9)所示的碳亲核体反应，变换成下述通式(7)所示的光学活性化合物， 再将所得光学活性化合物水解，变换成下述通式(8)所示的(R)-1-甲基丁基丙二酸或(R)-1-甲基戊基丙二酸，然后再将所得(R)-1-甲基丁基丙二酸或(R)-1-甲基戊基丙二酸脱羧， 其中，式(9)中，R2和R3各自独立地表示酯基、羧基或氰基，R2和R3可一起形成环状结构；式(7)中，R2和R3与前述含义相同，R4为正丙基或正丁基；
式(8)中，R4与前述含义相同。
实施发明的最佳方式以下对本发明的实施方案进行说明，但本发明的范围并不受这些内容限定。
1.使用微生物等进行的光学活性醇的制备方法本发明的(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的制备方法是将微生物或转化细胞、该微生物或细胞处理物、该微生物或细胞培养液、和/或由该微生物或细胞得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与2-戊酮(或2-己酮)作用，制备(S)-2-戊醇(或(S)-2-己醇)的方法，其特征在于将该微生物或转化细胞的未经溶剂前处理的活菌体与2-戊酮(或2-己酮)作用时，可生成95％e.e.或以上的光学纯度的(S)-2-戊醇(或(S)-2-己醇)，且其产率为1mg(S)-2-戊醇(或(S)-2-己醇)/g干菌体重量/小时或以上。
本说明书中所述2-戊酮和2-己酮均指碳链为直链的2-戊酮和2-己酮。
如上所述，对于本发明的方法中使用的微生物或转化细胞的特征是在将其未经溶剂前处理的活菌体与2-戊酮(或2-己酮)作用时，可以生成95％e.e.或以上光学纯度的(S)-2-戊醇(或(S)-2-己醇)，且其产率为1mg(S)-2-戊醇(或(S)-2-己醇)/g干菌体重量/小时或以上。这里所述溶剂有丙酮、甲苯、二甲亚砜、2-丙醇，前处理的方法有将菌体浸泡或将菌体浸泡并在减压条件下干燥等方法。在使用必须进行这些处理的微生物或转化细胞进行的(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的制备方法中，该处理需要劳力和费用，并且难以获得有再现性的结果等，因此不优选。
生成的(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的光学纯度为95％e.e.或以上即可，优选98％e.e.或以上，进一步优选99％e.e.或以上。
关于(S)-2-戊醇的产率，只要是1mg(S)-2-戊醇/g干菌体重量/小时或以上即可，优选为2mg(S)-2-戊醇/g干菌体重量/小时或以上，进一步优选5mg(S)-2-戊醇/g干菌体重量/小时或以上，更进一步优选10mg(S)-2-戊醇/g干菌体重量/小时或以上，特别优选20mg(S)-2-戊醇/g干菌体重量/小时或以上。
关于(S)-2-己醇的产率，只要是1mg(S)-2-己醇/g干菌体重量/小时或以上即可，优选2mg(S)-2-己醇/g干菌体重量/小时或以上，进一步优选5mg(S)-2-己醇/g干菌体重量/小时或以上，更进一步优选10mg(S)-2-己醇/g干菌体重量/小时或以上，又进一步优选20mg(S)-2-己醇/g干菌体重量/小时或以上，再进一步优选50mg(S)-2-己醇/g干菌体重量/小时或以上，特别优选100mg(S)-2-己醇/g干菌体重量/小时或以上。
本发明的(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的制备方法的一个例子可以使用表达以下DNA的转化菌株来实施，所述DNA编码具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的蛋白质或者该氨基酸序列的同源物、并具有还原羰基并合成光学活性醇的能力的蛋白质(以下可将其简称为“羰基还原酶”)。
本说明书中，羰基还原酶活性是指不对称地还原含羰基化合物中的羰基、制成光学活性醇类的活性。所述活性可如下计算在含有含羰基化合物作为底物并含有NADPH或NADH作为辅酶的反应液中，使目标蛋白质、具有表达该蛋白质的能力的转化体、转化体处理物、或培养液作为酶与反应液作用，通过测定反应液的吸光度变化来计算反应液中NADPH或NADH的减少初速度。
本发明所使用的羰基还原酶只要是可以使2-戊酮或2-己酮生成(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的酶即可。在测定本发明所使用的羰基还原酶的羰基还原酶活性时，使用含羰基的化合物作为底物，含羰基化合物不限于2-戊酮或2-己酮，也可优选使用其取代物·衍生物等结构类似化合物。所述例子有1-乙酰氧基-3-氯-2-丙酮等。
如本说明书中记载，羰基还原酶的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的碱基序列已经明确，因此如后所述，根据编码羰基还原酶的部分或全部氨基酸序列的碱基序列，制备探针，使用该探针，从具有羰基还原酶活性的任意微生物中分离编码羰基还原酶的DNA，然后以此为基础，采用常规基因工程方法获得。
还可以如为完成本发明而做的那样，从具有羰基还原酶活性的微生物、即从具有编码羰基还原酶的DNA的微生物，例如选自酒香酵母属、假丝酵母属、Hortaea、伊氏酵母属、路德酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、节杆菌属、短杆菌属、短小杆菌属、土芽孢菌属、微杆菌属、苍白杆菌属、副球菌属、根瘤菌属、红球菌属的微生物、优选伊氏酵母属酵母的培养物中纯化。
伊氏酵母属酵母可优选使用Issatchankia scutulata var.scutulata，例如来自Issatchankia scutulata var.scutulata JCM 1828菌株的羰基还原酶作为本发明的羰基还原酶使用，则在光学活性醇的制备上特别优异。该菌株可购自日本理化学研究所微生物系统保存设施(JapanCollection of Microorganism(JCM))。
通过与2-戊酮作用来制备(S)-2-戊醇时，羰基还原酶或编码该酶的DNA优选使用来自属于酒香酵母属、假丝酵母属、Hortaea、路德酵母属、或者毕赤酵母属的微生物的羰基还原酶或编码该酶的DNA。
进一步优选使用来自布鲁塞尔酒香酵母、热带假丝酵母、诞沫假丝酵母、Hortaea werneckii、Lodderomyces elongisporus、Pichiasegobiensis、斯巴达克毕赤酵母、球形节杆菌、氧化节杆菌、多色节杆菌、萎蔫短小杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、砖红色微杆菌、人苍白杆菌、苍白杆菌属某种(卵状假单胞菌)、放射根瘤菌的羰基还原酶或编码该酶的DNA。
具体的说，特别优选使用来自布鲁塞尔酒香酵母NBRC 0629、布鲁塞尔酒香酵母NBRC 0797、热带假丝酵母NBRC 0006、诞沫假丝酵母CBS 6408、诞沫假丝酵母JCM 1627、Hortaea werneckii NBRC4875、Lodderomyces elongisporus NBRC 1676、Pichia segobiensis JCM10740、斯巴达克毕赤酵母JCM 10741、球形节杆菌NBRC 12137、氧化节杆菌DSM 20120、多色节杆菌DSM 342、萎蔫短小杆菌ATCC12813、嗜热脂肪地芽孢杆菌NBRC 12550、嗜热脂肪地芽孢杆菌IAM11002、嗜热脂肪地芽孢杆菌IAM 11004、嗜热脂肪地芽孢杆菌IAM12043、砖红色微杆菌JCM 1353、人苍白杆菌ATCC 49237、苍白杆菌属某种(卵状假单胞菌)NBRC 12950、苍白杆菌属某种(卵状假单胞菌)NBRC 12952、苍白杆菌属某种(卵状假单胞菌)NBRC 12953、放射根瘤菌IAM 12048的羰基还原酶或编码该酶的DNA。
通过与2-己酮作用来制备(S)-2-己醇时，羰基还原酶或编码该酶的DNA优选使用来自属于酒香酵母属、假丝酵母属、伊氏酵母属、路德酵母属、毕赤酵母属或红酵母属的微生物的羰基还原酶或编码该酶的DNA。
其中特别优选使用来自异酒香酵母、无名假丝酵母、克鲁斯氏假丝酵母、麦芽糖假丝酵母、诞沫假丝酵母、Issatchankia scutulata、Lodderomyces elongisporus、安格斯毕赤酵母、Pichia cactophila、Pichiasegobiensis、喜海藻糖毕赤酵母和小红酵母的羰基还原酶或编码该酶的DNA。
具体的说，优选使用来自异酒香酵母NBRC 0627、无名假丝酵母ATCC 10539、克鲁斯氏假丝酵母NBRC 1664、克鲁斯氏假丝酵母JCM2284、克鲁斯氏假丝酵母JCM 2341、麦芽糖假丝酵母NBRC 1977、诞沫假丝酵母CBS 6408、Issatchankia scutulata var.scutulata JCM 1828、Lodderomyces elongisporus NBRC 1676、安格斯毕赤酵母NBRC 1024、安格斯毕赤酵母NBRC 1071、Pichia cactophila JCM 1830、Pichiasegobiensis JCM 10740、喜海藻糖毕赤酵母JCM 3651、以及小红酵母NBRC 0879、节杆菌属某种DSM 20407、硫磺色节杆菌(硫黄短杆菌(Brevibacterium sulfureum))JCM 1338、Brevibacterium butanicumATCC 21196、硫黄短杆菌JCM 1485、萎蔫短小杆菌ATCC 12813、解角质微杆菌NBRC 13309、天牛微杆菌JCM 1352、微杆菌属某种NBRC15615、人苍白杆菌ATCC 49237、苍白杆菌属某种(卵状假单胞菌)NBRC 12952、苍白杆菌属某种(卵状假单胞菌)NBRC 12953、脱氮副球菌NBRC 12442、放射根瘤菌IAM 12048、放射根瘤菌IAM 13129、红球菌属某种ATCC 15960的羰基还原酶或编码该酶的DNA。
从微生物的培养物中获得羰基还原酶的方法可以使用常规的酶纯化方法，例如可按照以下方法进行。将上述微生物在YM培养基等酵母培养用常规培养基上培养，待充分增殖后回收，在加入有DTT(二硫苏糖醇)等还原剂或苯甲基磺酰氟(PMSF)等蛋白酶抑制剂的缓冲液中破碎，制成无细胞提取液。将根据蛋白质溶解度的分级(通过有机溶剂沉淀或通过硫酸胺等盐析等)、或阳离子交换、阴离子交换、凝胶过滤、疏水、羟基磷灰石层析、螯合、染料、使用抗体等的亲和层析等适当组合，可以从无细胞提取液中纯化。
如本说明书的实施例所示，通过使用DEAE Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences制造)进行的阴离子交换色谱、使用ButylSepharose4 Fast Flow(Amersham Biosciences制造)进行的疏水性相互作用色谱、使用MonoQ(Amersham Biosciences制造)进行的阴离子交换色谱、使用Superdex 200(Amersham Biosciences制造)进行的凝胶过滤色谱等，可纯化至电泳检测为几乎单一的条带。
如上所述纯化的、来自Issatchankia scutulata var.scutulata JCM1828菌株的羰基还原酶(以下可将该酶称为“IsADH1”)含有一种亚单元，该亚单元根据十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(以下简称SDS-PAGE)测定的分子量约为40,000Da，用Superdex 200 HR10/30(Amersham Biosciences制造)进行的凝胶过滤确定的分子量约为40,000Da。以上可以推论IsADH1是含有一种约40,000Da的亚单元的单体。
编码羰基还原酶的DNA例如可通过以下的方法进行分离。
首先，按照上述方法等纯化羰基还原酶，然后分析N末端氨基酸序列，再通过赖氨酰内肽酶、V8蛋白酶等酶切断，通过反相液相色谱等纯化肽片段，通过蛋白质测序仪分析氨基酸序列，由此可确定多个氨基酸序列。
根据确定的氨基酸序列设计PCR用引物，以生产羰基还原酶的微生物菌株的染色体DNA或cDNA文库为模板，使用由氨基酸序列设计的PCR引物，进行PCR，由此可得到本发明的DNA的一部分。再以所得DNA片段为探针，将生产羰基还原酶的微生物菌株的染色体DNA的限制酶消化产物导入噬菌体、质粒等，转化大肠杆菌，利用所得文库或cDNA文库，通过集落杂交、噬菌斑杂交等，可得到编码羰基还原酶的DNA。
对由PCR得到的DNA片段的碱基序列进行分析，由所得序列设计用于在已知的DNA外侧延伸的PCR引物，使用生产羰基还原酶的微生物菌株的cDNA，通过RACE法(cDNA末端快速扩增)(MolecularCloning 3rd Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、以下称为“分子克隆”)，也可得到本发明的DNA。
这样，由Issatchankia scutulata var.scutulata JCM 1828菌株的染色体DNA分离的、编码羰基还原酶IsADH1的DNA的碱基序列如SEQID NO.2所示。
编码羰基还原酶IsADH1的DNA除由上述方法克隆的基因组DNA、或cDNA之外，还如本说明书所述，其碱基序列已经是清楚的，因此也可通过基于SEQ ID NO.2的化学合成等来获得。
编码IsADH1的DNA的同源物是指在不损害羰基还原酶活性的范围内，具有在SEQ ID NO.1的氨基酸序列中经缺失、取代、或添加一个或多个氨基酸得到的氨基酸序列。这里，“多个”具体指20个或以下，优选10个或以下，更优选5个或以下。
IsADH1的同源物是指具有与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少50％或以上、优选70％或以上、更优选80％或以上同源性的蛋白质。
顺便，上述蛋白质的同源性检索例如可以以DNA Databank ofJAPAN(DDBJ)等为对象，使用FASTA或BLAST等程序进行。使用SEQ ID NO.1的氨基酸序列，以DDBJ为对象，使用BLAST程序进行同源检索，结果在已知的蛋白质中，显示最高同源性的是来自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的功能未知的蛋白质Ydr541cp蛋白质(SEQ ID NO.3检索号AAB64983)，显示42％的同源性。
编码IsADH1的DNA是编码上述IsADH1的DNA或其同源物，是编码具有羰基还原酶活性的蛋白质的DNA。
编码上述蛋白质的DNA例如有包含SEQ ID NO.2所示碱基序列的DNA。
编码IsADH1的DNA的同源物包括以下DNA该DNA编码在不损害羰基还原酶活性的范围内含有在SEQ ID NO.1的氨基酸序列中经缺失、取代、或添加一个或多个氨基酸而得的氨基酸序列的蛋白质。这里，多个具体是指60个或以下，优选30个或以下，更优选10个或以下。
本领域技术人员通过使用定点诱变法(Nucleic Acids Res.、10卷、6487页(1982)、Methods in Enzymol.、100卷、448页(1983)、MolecularCloning、PCR-A Practical Approach、IRL Press、200页(1991))等，向SEQ ID NO.2的DNA中导入适当取代、缺失、插入和/或添加变异，则可得到编码IsADH1的DNA的同源物。
根据IsADH1的氨基酸序列或其一部分、或者编码IsADH1的DNA或其一部分，例如在DNA Databank of JAPAN(DDBJ)等数据库中进行同源性检索，也可以获得本发明的编码蛋白质的DNA同源物的碱基序列信息。本领域技术人员根据该碱基序列信息，通过对保藏菌株的PCR来获得该DNA片段。
编码IsADH1的DNA的同源物还可以如下获得使用编码IsADH1的DNA或其一部分作为探针，通过集落杂交法、噬菌斑杂交法、或DNA印迹杂交法等，在严格条件下与由具有羰基还原酶活性的任意微生物制备的DNA进行杂交，获得杂交的DNA。本发明的编码蛋白质的DNA的“一部分”是其长度足以作为探针使用的DNA，具体为15bp或以上，优选50bp或以上，更优选100bp或以上。
各种杂交可按照“分子克隆”等中记载的方法进行。
本说明书中，“在严格条件下杂交的DNA”是指使用DNA作为探针，在严格条件下，通过使用集落杂交法、噬菌斑杂交法、或者DNA印迹杂交法等而得到的DNA的碱基序列，关于严格条件，例如在集落杂交法和噬菌斑杂交法中，是使用固定有来自集落或噬菌斑的DNA或该DNA片段的滤膜，在0.7-1.0M氯化钠存在下、在65℃进行杂交，然后用0.1-2×SSC溶液(1×SSC的组成为150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)、在65℃的条件下洗涤滤膜的条件。
通过将如上所述分离的、编码羰基还原酶的DNA以可表达的方式插入公知的表达载体，可以提供羰基还原酶表达载体。通过培养用该表达载体转化的转化体，可由该转化体得到羰基还原酶。或者，转化体也可以通过将编码羰基还原酶的DNA以可表达的方式整合到公知的宿主染色体DNA中来获得。
转化体的制备方法具体如下将本发明的DNA导入可在微生物中稳定存在的质粒载体或噬菌体载体中，将构建的表达载体导入该微生物中，或者将编码羰基还原酶的DNA直接导入宿主基因组中，使该遗传信息转录、翻译。
此时，如果编码羰基还原酶的DNA不含有可在宿主微生物中表达的启动子，则需要将适当的启动子整合到本发明的DNA链的5’-一侧上游，更优选还将终止子整合到3’-一侧下游。该启动子和终止子只要是已知可在用作宿主的微生物中发挥功能的启动子和终止子即可，没有特别限定，关于这些可在各种微生物中利用的载体、启动子和终止子等，在例如“微生物学基础讲座8遗传子工学·共立出版”中有描述，特别是关于酵母，在Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)、Yeast 8，423-488(1992)等中有详细记载。
用于使本发明的羰基还原酶表达的、作为转化对象的宿主微生物只要是宿主本身对本反应没有不良影响即可，没有特别限定，具体有以下所示的微生物。
所确立的属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebaterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳芽孢杆菌属(Lactobacillus)等的宿主载体系统得到的细菌。
所确立的属于红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)等的宿主载体系统得到的放线菌。
所确立的属于糖酵母属(Saccharomyces)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、裂殖糖酵母属、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、接合糖酵母属(Zygosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、丝孢酵母属(Trichosporon)、红冬孢属(Rhodosporidium)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)等的宿主载体系统得到的酵母。
所确立的属于链孢霉属(Neurospora)、曲霉属(Aspergillus)、头孢属(Cephalosporium)、木霉属(Trichoderma)等的宿主载体系统得到的霉菌。
上述微生物中，宿主优选埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属，特别优选埃希氏杆菌属、棒状杆菌属。
转化体制备顺序，适合于宿主的重组载体的构建以及宿主的培养方法可按照分子生物学、生物工程、遗传工程领域中常用的技术进行(例如“分子克隆”中记载的方法)。
以下，具体给出优选的宿主微生物、各微生物的优选的转化方法、载体、启动子、终止子等的例子，但本发明并不限于这些例子。
埃希氏杆菌属中、特别是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)中，质粒载体有pBR、pUC系质粒，有来自lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操纵子)、tac、trc(lac、trp的融合)、λ噬菌体PL、PR等的启动子等。终止子有来自trpA、来自噬菌体、来自rrnB RNA的终止子等。
芽孢杆菌属中，载体可以是pUB110系质粒、pC194系质粒等，还可以整合到染色体中。启动子和终止子可以利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等酶基因的启动子或终止子等。
假单孢菌属中，载体有所建立的恶臭假单孢菌(PseudomonasPutida)、葱头假单孢菌(Pseudomonas cepacia)等的常规的宿主载体系统或与甲苯化合物的分解有关的质粒、以TOL质粒为基础的广宿主范围载体(包含来自RSF1010等的自主复制所需的基因)pKT240(Gene，26，273-82(1983))。
短杆菌属、特别是乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)中，载体可以例举pAJ43(Gene，39，281(1985))等质粒载体。启动子和终止子可以利用在大肠杆菌中使用的各种启动子和终止子。
棒状杆菌属、特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中，载体有pCS11(特开昭57-183799)、pCB101(Mol.Gen.Genet.196，175(1984))等质粒载体。
糖酵母属、特别是啤酒糖酵母中，载体有YRp系、YEp系、YCp系、YIp系质粒。可以利用醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶等各种酶基因的启动子、终止子。
裂殖糖酵母属中，载体可以例举Mol.Cell.Biol.6，80(1986)中记载的来自粟酒裂殖糖酵母的质粒载体。特别是，pAU224由宝酒造公司销售，可以容易地利用。
曲霉属中，黑色曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)等在霉菌得到最充分的研究，可以利用向质粒或向染色体中整合，也可以利用来自菌体外蛋白酶或淀粉酶的启动子(Trends inBiotechnology 7，283-287(1989))。
除上述之外，只要建立了适应各种微生物的宿主载体系统，则它们都可以适当使用。
除微生物之外，在植物、动物中也构建了各种宿主·载体体统，特别是在使用蚕的昆虫等动物中(Nature 315，592-594(1985))或菜籽、玉米、马铃薯等植物中构建了大量表达异源蛋白质的系统、以及使用大肠杆菌无细胞提取液或小麦胚芽等无细胞蛋白质合成体系的系统，它们均可优选利用。
本发明通过使由上述方法等得到的转化细胞、该转化细胞处理物和/或培养液与反应底物2-戊酮或2-己酮作用，可使该化合物的羰基不对称还原，制备(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇，其中上述转化细胞是保有重组体DNA的转化细胞或将该DNA整合到染色体DNA中而得到的转化细胞，其中所述重组体DNA是将具有编码具SEQ ID NO.1的氨基酸序列的蛋白质的碱基序列的DNA整合到载体中而得到的。
本发明可将下述转化体、或将上述重组体DNA整合到染色体DNA中得到的转化细胞、该转化细胞处理物和/或培养液与反应底物2-戊酮或2-己酮作用，使该化合物的羰基不对称还原，制备(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇，其中所述转化体保有将具有编码下述蛋白质的碱基序列的DNA整合到载体中而得到的重组体DNA，所述蛋白质是含有与SEQ IDNO.1的氨基酸序列具有50％或以上同源性的氨基酸序列，且具有还原羰基、合成光学活性醇的能力的蛋白质。
本发明通过将选自酒香酵母属、假丝酵母属、Hortaea、伊氏酵母属、路德酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、节杆菌属、短杆菌属、短小杆菌属、地芽孢杆菌属、微杆菌属、苍白杆菌属、副球菌属、根瘤菌属、红球菌属的微生物、该微生物处理物、该微生物培养液和/或由该微生物得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与反应底物2-戊酮或2-己酮作用，可以不对称还原该化合物的羰基，制备(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇。
通过与2-戊酮作用来制备(S)-2-戊醇时，优选使用属于酒香酵母属、假丝酵母属、Hortaea、路德酵母属或毕赤酵母属的微生物，特别优选使用布鲁塞尔酒香酵母、热带假丝酵母、诞沫假丝酵母、Hortaeawerneckii、Lodderomyces elongisporus、Pichia segobiensis、斯巴达克毕赤酵母、球形节杆菌、氧化节杆菌、多色节杆菌、萎蔫短小杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、砖红色微杆菌、人苍白杆菌、苍白杆菌属某种(卵状假单胞菌)、放射根瘤菌，具体优选使用布鲁塞尔酒香酵母NBRC0629、布鲁塞尔酒香酵母NBRC 0797、热带假丝酵母NBRC 0006、诞沫假丝酵母CBS 6408、诞沫假丝酵母JCM 1627、Hortaea werneckiiNBRC 4875、Lodderomyces elongisporus NBRC 1676、Pichia segobiensisJCM 10740、斯巴达克毕赤酵母JCM 10741、球形节杆菌NBRC 12137、氧化节杆菌DSM 20120、多色节杆菌DSM 342、萎蔫短小杆菌ATCC12813、嗜热脂肪地芽孢杆菌NBRC 12550、嗜热脂肪地芽孢杆菌IAM11002、嗜热脂肪地芽孢杆菌IAM 11004、嗜热脂肪地芽孢杆菌IAM12043、砖红色微杆菌JCM 1353、人苍白杆菌ATCC 49237、苍白杆菌属某种(卵状假单胞菌)NBRC 12950、苍白杆菌属某种(卵状假单胞菌)NBRC 12952、苍白杆菌属某种(卵状假单胞菌)NBRC 12953、放射根瘤菌IAM 12048。
通过与2-己酮作用来制备(S)-2-己醇时，优选属于酒香酵母属、假丝酵母属、伊氏酵母属、路德酵母属、毕赤酵母属或红酵母属的微生物。
其中，特别优选使用异酒香酵母、无名假丝酵母、克鲁斯氏假丝酵母、麦芽糖假丝酵母、诞沫假丝酵母、Issatchankia scutulata、Lodderomyces elongisporus、安格斯毕赤酵母、Pichia cactophila、Pichiasegobiensis、喜海藻糖毕赤酵母和小红酵母。
具体优选使用异酒香酵母NBRC 0627、无名假丝酵母ATCC10539、克鲁斯氏假丝酵母NBRC 1664、克鲁斯氏假丝酵母JCM 2284、克鲁斯氏假丝酵母JCM 2341、麦芽糖假丝酵母NBRC 1977、诞沫假丝酵母CBS 6408、Issatchankia scutulata var.scutulata JCM 1828、Lodderomyces elongisporus NBRC 1676、安格斯毕赤酵母NBRC 1024、安格斯毕赤酵母NBRC 1071、Pichia cactophila JCM 1830、Pichiasegobiensis JCM 10740、喜海藻糖毕赤酵母JCM 3651、以及小红酵母NBRC 0879、节杆菌属某种DSM 20407、硫磺色节杆菌(硫黄短杆菌)JCM 1338、Brevibacterium butanicum ATCC 21196、硫黄短杆菌JCM1485、萎蔫短小杆菌ATCC 12813、解角质微杆菌NBRC 13309、天牛微杆菌JCM 1352、微杆菌属某种NBRC 15615、人苍白杆菌ATCC49237、苍白杆菌属某种(卵状假单胞菌)NBRC 12952、苍白杆菌属某种(卵状假单胞菌)NBRC 12953、脱氮副球菌NBRC 12442、放射根瘤菌IAM 12048、放射根瘤菌IAM 13129、红球菌属某种ATCC 15960。
反应底物2-戊酮或2-己酮通常在底物浓度为0.01-90％w/v，优选0.1-30％w/v的范围内使用。反应底物可以在反应起始时一次性添加，但在酶对底物有抑制时，从减少影响的角度或提高产物蓄积浓度的角度考虑，优选连续或间歇性添加。
本发明的制备方法中，使上述转化细胞或具有羰基还原活性的微生物与2-戊酮或2-己酮等含羰基化合物(反应底物)作用时，可以直接使用该转化细胞或微生物细胞，也可以使用该细胞处理物例如进行冻干处理的或者经物理或酶破碎后得到的细胞处理物、该细胞中的羰基还原酶组分以粗纯化物或纯化物的形式提取的、或者将它们固定在以聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶凝胶等为代表的载体上的物质等。向反应液中添加的转化细胞或微生物细胞和/或该细胞处理物的量是以该细胞的浓度通常按照湿菌体重量计为0.1-50％w/v左右，优选1-20％w/v，添加到反应液中，使用酶等制备物时，可以求出酶的比活性，添加可达到上述细胞浓度的量。
本发明的制备方法中，优选添加辅酶NADP+或NADPH、或NAD+或者NADH，关于辅酶的浓度，通常添加0.001mM-100mM，优选0.01-10mM。
添加上述辅酶时，将由NADPH(NADH)生成的NADP+(NAD+)再生为NADPH(NADH)，这可提高生产效率，因而优选，再生方法有以下几种1)利用宿主微生物自身的NADP+(NAD+)还原能的方法；2)向反应体系内添加具有由NADP+(NAD+)生成NADPH(NADH)的能力的微生物或其处理物、或者葡糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)等可用于NADPH(NADH)的再生的酶(再生酶)的方法；(3)在制备转化体时，将可用于NADPH(NADH)的再生的酶——上述再生酶类的基因与本发明的DNA同时导入宿主并使其表达的方法等。
其中，上述(1)的方法中，优选向反应体系中添加葡萄糖或乙醇、甲酸等。
上述(2)的方法中，可以使用含有上述再生酶类的微生物，将该微生物菌体经丙酮处理后、冻干处理后、物理或酶破碎等制得的菌体处理物，将该酶组分以粗纯化物或纯化物的形式提取，以及将它们固定于以聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶凝胶等为代表的载体上应用等等，也可以使用市场销售的酶。
具体来说，这种情况下，上述再生酶的使用量与本发明的羰基还原酶比较，以酶活性计，通常添加0.01-100倍，优选0.5-20倍左右。
还必须添加作为上述再生酶的底物的化合物，例如利用葡糖脱氢酶时的葡萄糖、利用甲酸脱氢酶时的甲酸、利用醇脱氢酶时的乙醇或异丙醇等，其添加量相对于反应原料2-戊酮或2-己酮，通常添加0.1-20倍摩尔当量，优选1-5倍摩尔当量。
对于上述(3)的方法，可以采用以下方法将编码羰基还原酶的DNA和上述再生酶类的DNA整合到染色体中的方法；向单一的载体中导入两种DNA，转化宿主的方法；以及将两种DNA分别导入到不同的载体中，然后转化宿主的方法；当采用将两种DNA分别导入不同载体、然后转化宿主的方法时，必须考虑两种载体之间的不相容性，适当选择载体。
向单一载体中导入多个基因时，可以采用将启动子和终止子等表达控制相关区域分别与各基因连接的方法，或者以乳糖操纵子等含多顺反子的操纵子的形式使其表达。
本发明的制备方法是在含有反应底物和表达编码羰基还原酶的DNA的转化细胞、该细胞处理物、该细胞培养液、和/或由该细胞得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物、以及根据需要添加的各种辅酶及其再生系统的水性介质中或该水性介质与有机溶剂的混合物中进行。
本发明的制备方法是在含有反应底物和酒香酵母属、假丝酵母属、Hortaea、伊氏酵母属、路德酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、节杆菌属、短杆菌属、短小杆菌属、地芽孢杆菌属、微杆菌属、苍白杆菌属、副球菌属、根瘤菌属、红球菌属的具有羰基还原酶活性的微生物、该微生物处理物、该微生物培养液、和/或由该微生物得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物、以及根据需要添加的各种辅酶及其再生系统的水性介质中或该水性介质与有机溶剂的混合物中进行。
水性介质有水或缓冲液。缓冲液有磷酸钠或磷酸钾、Tris、乙酸钠、柠檬酸钠等，有机溶剂可使用乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷、二甲基亚砜等反应底物溶解度高的溶剂。
本发明的方法通常在4-60℃、优选10-45℃的反应温度下，通常pH3-11、优选pH 5-8中进行。反应时间通常为1-72小时左右。也可以利用膜反应器进行。
根据本发明的方法生成的光学活性醇可如下纯化反应终止后，通过离心、膜处理等分离反应液中的菌体或蛋白质，然后将用乙酸乙酯、甲苯等有机溶剂萃取，蒸馏，柱层析，晶析等适当组合进行纯化。
2.光学活性3-甲基羧酸的制备方法本发明的制备方法中，下述通式(5)所示的光学活性3-甲基羧酸是在高极性溶剂和/或促进脱羧的添加剂存在下，通过对上述通式(1)所示的光学活性1-甲基烷基丙二酸进行脱羧来制备。
上述通式(1)中，R1为碳原子数3-5的正丙基、正丁基、正戊基、异丙基、异丁基、异戊基、环戊基等直链、支链或环状烷基。其中优选正丙基、正丁基、正戊基、异丙基、异丁基，进一步优选正丙基或正丁基。
*表示不对称碳原子，可以是R构型和S构型的任何构型，优选R构型，其光学纯度通常为80％e.e.或以上，优选90％e.e.或以上，特别是用作医药原料或中间体时，要求高光学纯度，因此进一步优选95％e.e.或以上，特别优选99％e.e.或以上。
上述脱羧反应可以在高极性溶剂和/或促进脱羧的添加剂存在下进行加热，也可以在低极性溶剂存在下或在无溶剂下进行高温加热，从工业化实施的容易程度考虑，更优选在高极性溶剂和/或促进脱羧的添加剂存在下将反应温度控制在较低。通常脱羧反应必须在150℃-200℃高温条件下进行，接近通常的搪玻璃反应器的使用极限温度，升温、冷却也花费时间，并且必须要有大量的热量，因此使反应温度低温化的优点非常大。另外，通常光学活性1-甲基烷基丙二酸在常温下为固体，在无溶剂下进行反应时，加入到反应槽后必须进行加热熔解。但是在只加入固体的状态下，在通常的反应槽中无法搅拌，而不搅拌即进行加热，则导热效率极差，另外部分升温有反应失控的危险，因此无法实际应用。因此优选使用溶剂，将光学活性1-甲基烷基丙二酸以溶液或淤浆状态进行处理。
另一方面，反应产生大量二氧化碳，因此在工业化规模实施时，为确保安全性，控制二氧化碳的发生速度是很重要的。
从按制二氧化碳的发生速度角度考虑，优选将溶解了光学活性1-甲基烷基丙二酸的溶液或加热熔解的光学活性1-甲基烷基丙二酸连续滴加进行反应。滴加法容易控制反应，且可以使用常规反应装置。另外，也可以将反应中生成的光学活性3-甲基羧酸作为溶剂使用，此时，由于不含有反应后必须要除去的溶剂等，纯化负担小，因此优选。
还可以使用比生成的光学活性3-甲基羧酸沸点高的溶剂。通过使用比产物的沸点高的溶剂作为反应溶剂，蒸馏反应液时，光学活性3-甲基羧酸作为第一馏出成分馏出，因此可以避免使用低沸点溶剂时出现的低沸点成分的混入的问题，且通过将高沸点溶剂作为高沸点稀释剂残留在蒸馏容器中，可以更多地馏出目标产物，提高蒸馏效率。
还可以进行反应蒸馏，即，在减压下，一边向反应容器内滴加光学活性1-甲基烷基丙二酸溶液使其反应，一边连续馏去生成的光学活性3-甲基羧酸。反应蒸馏法容易控制反应，且加热时间短，可以抑制因长时间加热而产生的杂质，故优选。
通过将光学活性1-甲基烷基丙二酸溶液通入到加热的反应装置中的流动法，可以变换成光学活性3-甲基羧酸。流动法中，通过控制对反应装置的溶液供给，可以控制二氧化碳发生速度。另外加热时间短，因此可以抑制因长时间加热而产生的杂质，故优选。流动反应的反应装置优选使用管状反应器，薄膜蒸馏器或多段式槽型流动反应器。采用薄膜蒸馏器时，可以在减压下进行反应。
上述脱羧反应中使用的溶剂有丁基醚、四氢呋喃、1，2-二甲氧基乙烷、二烷、聚乙二醇、聚乙二醇二甲醚、聚四氢呋喃等醚系溶剂；四氯化碳、二氯苯等卤素系溶剂；丁醇、乙二醇等醇系溶剂；乙酸乙酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二异壬酯、邻苯二甲酸二(十三烷基)酯、偏苯三酸三辛酯等酯系溶剂；乙腈、丙腈等腈系溶剂；甲苯、二甲苯、十四烷、十三烷、液体石蜡、一甲基萘、异丙基联苯、二苄基甲苯、氢化三苯、硅油等烃系溶剂；二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺系溶剂；甲酸、乙酸等有机酸系溶剂；吡啶、2，6-二甲基吡啶、三乙胺等碱性溶剂；二甲基亚砜；水等。也可以将选自其中的多种溶剂以任意比例混合使用。为了溶解高极性底物或添加剂，优选高极性溶剂乙腈、四氢呋喃、二甲基亚砜、吡啶、乙酸、水等，特别优选反应加速效果大的非质子性溶剂二甲基亚砜、吡啶。
另外，十四烷、十三烷、聚乙二醇、聚乙二醇二甲醚、聚四氢呋喃、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二异壬基酯、邻苯二甲酸二(十三烷基)酯、偏苯三酸三辛酯、液体石蜡、一甲基萘、异丙基联苯、二苄基甲苯、氢化三苯、硅油等高沸点溶剂在蒸馏时可作为高沸点稀释剂使用。
溶剂的使用量可以使用任意量的溶剂，通常相对于原料底物为1-20倍体积量，优选1-5倍体积量。
也可以使用用于促进反应的添加剂作为溶剂。此时，为使光学活性1-甲基烷基丙二酸溶解或悬浮，通常，相对于底物使用0.5-20倍体积量。为了减轻溶剂馏去、回收等负担，优选0.5-3倍体积量。
上述脱羧反应中使用的添加剂有硫酸、盐酸等无机酸；氯化钠、氯化锂等无机盐；乙酸钠、甲酸铵等有机盐；氰化钠、氰化铜等氰化物；氯化铜、氯化铁等重金属盐；氧化铜、氧化银等重金属氧化物；吡啶、2，6-二甲基吡啶、三乙胺、苄胺、1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯、1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷等有机碱；氢氧化钠、氢氧化钙、碳酸钾等无机碱；乙酸酐、富马酸酐等酸酐；等。它们可以以任意的比例混合使用。优选重金属盐、重金属氧化物、有机碱、酸酐以及它们的混合物，进一步优选氧化铜、吡啶、2，6-二甲基吡啶、乙酸酐以及它们的混合物，特别优选价格低廉且反应加速效果大、可通过蒸馏与目标物分离的吡啶。
所使用的添加剂的量通常相对于底物为0.01-50wt％，为了避免二氧化碳的剧烈生成，且减轻纯化负担，优选抑制为必要最低限度，优选0.01-5wt％。
反应温度通常为30-200℃，根据添加剂的有无、所使用的添加剂的类型等反应条件，所需温度各有不同。从工业化角度考虑，过度的高温反应在装置上受到制约，难以实施，同时，升温、冷却需要长时间，故不优选，优选30-150℃，进一步优选30-110℃。
上述反应中制得的光学活性3-甲基羧酸优选通过蒸馏和/或萃取等方法纯化。
3.光学活性1-甲基烷基丙二酸的制备方法本发明的光学活性1-甲基烷基丙二酸是将下述通式(2)所示的光学活性醇变换为磺酰基氧基，得到下述通式(3)所示的光学活性化合物， 然后与下述通式(9)所示的碳亲核体反应，
再将制得下述通式(4)所示光学活性化合物水解来制备。
上述通式(2)、(3)和(4)中的R1与本说明书前述相同。
上述通式(4)和(9)中，R2和R3各自独立地为酯基、羧基或氰基，优选酯基。这里，R2和R3可一起形成5-(1-甲基烷基)-2，2-二甲基-1，3-二烷-4，6-二酮等环状结构。
该酯基的醇成分只要是不对反应产生不良影响的基团即可，没有特别限定，优选甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇、环己醇等直链、支链或环状烷基醇；酚、萘酚等芳基醇，进一步优选甲醇或乙醇。
上述通式(3)中，X为甲磺酰氧基、甲苯磺酰氧基、硝基苯磺酰氧基、氯甲磺酰氧基、三氟甲磺酰氧基等磺酰氧基，优选甲磺酰氧基、甲苯磺酰氧基、硝基苯磺酰氧基、氯甲磺酰氧基、三氟甲磺酰氧基，进一步优选甲磺酰氧基或甲苯磺酰氧基。
上述通式(1)-(5)中，*表示不对称碳原子，其光学纯度通常为80％e.e.或以上，优选90％e.e.或以上，进一步优选95％e.e.或以上，特别优选99％e.e.或以上。绝对立体构型可以是R构型和S构型的任何构型，优选上述通式(2)和(3)中为S构型，上述通式(1)、(4)和(5)中为R构型。
作为原料使用的光学活性醇可通过包含对应的酮的不对称还原、通过脂酶分割等的不对称反应，采用公知的方法进行任意的合成，但是分割法必须舍掉不需要的立体构型的醇或其酯，因此优选通过可以完全利用原料的酮的不对称反应进行合成。进一步优选使具有还原羰基、以较高光学纯度合成光学活性醇的能力的蛋白质或表达编码该蛋白质的DNA的微生物或转化细胞等与结构单纯的脂族酮作用的合成方法。
将上述通式(2)所示的光学活性醇变换为磺酰氧基的方法有羟基的磺酰化。
羟基的磺酰化法有使用甲磺酰氯、甲磺酸酐等甲磺酰化剂；甲苯磺酰氯、甲苯磺酸酐等甲苯磺酰化剂；三氟甲磺酸酐等三氟甲磺酸化剂等的方法。
优选的磺酰氧基有甲磺酰基、甲苯磺酰基、硝基苯磺酰基、氯甲磺酰氧基、三氟甲磺酰基，进一步优选可低成本工业化的甲磺酰基或甲苯磺酰基。
上述反应中使用的磺酰化剂的量相对于底物为1-10当量，优选1-2当量。
所使用的溶剂有乙醚、丙醚、丁基甲基醚、四氢呋喃等醚系溶剂；二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、氯苯等卤素系溶剂；乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯系溶剂；己烷、苯、甲苯等烃系溶剂；二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺系溶剂；乙腈等腈系溶剂等。可以将选自其中的多种溶剂以任意比例混合使用。优选的溶剂有成本低且容易回收的二氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯。
溶剂的使用量可以使用任意量的溶剂，通常相对于原料底物为2-50倍体积量，优选3-10倍体积量。
上述反应中，优选与碱共存。所使用的碱有三乙胺或吡啶等有机碱；氢氧化钠、碳酸钾、碳酸氢钠等无机碱，优选有机碱，进一步优选三乙胺、吡啶。
所使用的碱的当量通常是用于中和副生的酸所需的量，相对于底物为1-10当量，优选1-2当量，也可以使用碱作为溶剂。
反应温度通常为-20至100℃，根据所导入的离去基团和/或反应条件，其最佳温度也不同。使用特别优选的甲磺酰基或甲苯磺酰基时，优选0-40℃。
反应时间可以任意设定，从降低制造成本角度考虑，优选在10小时或以内进行。
上述反应中使用的通式(9)所示的碳亲核体有丙二酸酯、丙二酸、丙二腈、丙二酸单酯、氰基乙酸、氰基乙酸酯、丙二酸环(亚)异丙酯(Meldrum′s acid)，优选丙二酸酯、丙二腈、氰基乙酸酯，进一步优选工业化成本低且容易水解的丙二酸酯。
该酯的醇成分只要是不对反应有不良影响的基团即可，没有特别限定，优选甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、环己醇等直链、支链或环状的烷基醇；酚、萘酚等芳基醇，进一步优选甲醇或乙醇。
所使用的碳亲核体的量通常相对于底物为1-10当量，为了抑制同一个碳亲核体中有两分子的底物反应而生成二烷基化合物，优选比底物过量使用，相对于底物为1-3当量，进一步优选1.2-2.0当量。
上述反应中，所使用的碱有氢化钠、氢化锂等氢化金属化合物；二异丙基氨基锂、potassium hexamethydisilazide等金属酰胺化合物；正丁基锂、溴化异丙基镁等有机金属化合物；钠、钾、锂等碱金属；钙、镁等碱土金属；甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾等金属醇化物；氢氧化钠、碳酸钾等无机碱等，优选氢化金属化合物、碱金属和金属醇化物，进一步优选氢化钠、钠和甲醇钠。
所使用的碱的当量相对于底物为1-10当量，优选1-3当量。
所使用的溶剂有丁基甲基醚、四氢呋喃、1，2-二甲氧基乙烷、二烷等醚系溶剂；二氯甲烷、二氯乙烷、氯苯等卤素系溶剂；甲醇、乙醇、异丙醇等醇系溶剂；己烷、甲苯等烃系溶剂；二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺系溶剂；二甲基亚砜等。可以将选自其中的多种溶剂以任意比例混合使用。优选的溶剂有甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲苯，进一步优选四氢呋喃，它可以以高极性使反应顺畅进行，且萃取时可以与水层分离，即使混入，下一步骤也不会产生问题。
溶剂的使用量可以使用任意量，通常相对于原料底物为0.5-20倍体积量，只要可以顺畅进行反应，越少则越可以提高反应速度，因此优选1-8倍体积量，进一步优选2-4倍体积量。
反应温度通常为0-100℃，根据离去基团、碳亲核体的种类或反应条件，其最佳温度也不同。为了抑制外消旋化，优选在反应时间不太长的范围且在低温进行，在具有特别优选的甲磺酰基或甲苯磺酰基的上述通式(3)与丙二酸酯反应时，优选为30-100℃，进一步优选50-80℃。
反应时间与离去基团、碳亲核体的种类或反应条件有很大相关，从降低制造成本角度考虑，优选在10小时或以内进行。但是如果为了缩短反应时间而采用高温等过激的反应条件，则产物的光学纯度降低，因此必须选择反应时间、温度、溶剂等适当的条件。
在将上述反应制得的通式(4)所示的光学化合物变换为上述通式(1)所示的光学活性1-甲基烷基丙二酸时，也可以不用纯化，直接使用反应溶液，但是通过蒸馏和/或萃取等方法纯化，可以获得纯度更高的光学活性1-甲基烷基丙二酸，因而优选。
变换成光学活性1-甲基烷基丙二酸的方法有通过酸处理、碱处理等将酯基和/或氰基变换成羧基的方法，也可以在将氰基变换为酯基后再水解等通过分步方法进行，但在含水溶剂中以单步骤中进行，这可以减少步骤数，因而优选。
上述反应中所使用的试剂有硫酸、盐酸等无机酸；氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾等无机碱；1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯、甲醇钠等有机碱等。优选工业成本低的氢氧化钠、氢氧化钾、硫酸、盐酸。
所使用的溶剂有丙醚、四氢呋喃、1，2-二甲氧基乙烷、二烷等醚系溶剂；二氯甲烷、二氯乙烷、氯苯等卤素系溶剂；甲醇、乙醇、乙二醇等醇系溶剂；己烷、甲苯等烃系溶剂；二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺系溶剂；甲酸、乙酸等有机酸系溶剂；二甲基亚砜；水等。可以将选自其中的多种溶剂以任意的比例混合使用。由于进行水解，因此优选水或者与水混合的溶剂和水的混合溶剂系统，与水混合的溶剂有四氢呋喃、甲醇、乙醇、乙酸，进一步优选水。
溶剂的使用量可以使用任意量的溶剂，通常相对于原料底物为1-20倍体积量，优选2-8倍体积量。
上述通式(1)所示的光学活性1-甲基烷基丙二酸是结晶性好的化合物，在光学纯度不够时，优选通过晶析提高光学纯度。晶析后的光学纯度优选为90％e.e.或以上，特别是作为医药原料或中间体使用时，要求高的光学纯度，因此进一步优选95％e.e.或以上，特别优选99％e.e.或以上。
晶析除了从萃取液等溶剂中析出结晶的常规晶析法之外，还包含通过浓缩、冷却、添加溶剂等操作析出晶体，再将该析出的晶体通过添加溶剂、加热等溶解，再从中析出晶体的重结晶，然后将产生的晶体用溶剂清洗等方法。
所使用的溶剂有丙醚、甲基丁基醚、四氢呋喃、1，2-二甲氧基乙烷、二烷等醚系溶剂；二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、氯苯等卤素系溶剂；甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇等醇系溶剂；乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯系溶剂；乙腈、丙腈等腈系溶剂；己烷、庚烷、苯、甲苯、二甲苯等烃系溶剂；二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺系溶剂；二甲基亚砜；水等。可以将选自其中的多种溶剂以任意的比例混合使用。优选成本低且容易使晶体干燥的丙醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、乙酸乙酯，进一步优选闪点较高、容易工业处理的庚烷、甲苯、二甲苯、乙酸乙酯，特别优选对目标物的溶解度在适当范围内、对混入的杂质的溶解度较高、且在单一溶剂下可以析出晶体的甲苯。
溶剂可以使用任意量，通常相对于原料底物为1-50倍体积量，但是溶剂量与结晶的大小或溶剂成本有关，因此在可实现结晶目的的范围内尽量少，优选1-20倍体积量，进一步优选1-10倍体积量。
4.光学活性1-甲基烷基丙二酸本发明的光学活性1-甲基烷基丙二酸是下述通式(1)所示化合物。
上述通式(1)中，R1为碳原子数3-5的正丙基、正丁基、正戊基、异丙基、异丁基、异戊基、环戊基等直链、支链或环状的烷基。其中优选正丙基、正丁基、正戊基、异丙基、异丁基，进一步优选正丙基或正丁基。
*表示不对称碳原子，可以是R构型和S构型的任何构型，优选R构型，其光学纯度通常为80％e.e.或以上，优选90％e.e.或以上，特别是作为医药原料或中间体使用时，要求高光学纯度，因此进一步优选95％e.e.或以上，特别优选99％e.e.或以上。
通过以下的实施例进一步具体说明本发明，但本发明的范围并不受以下实施例限定。
实施例实施例A(使用微生物制备具有光学活性的醇)(1)由2-戊酮生成(S)-2-戊醇的微生物、以及由生成2-己酮生成(S)-2-己醇的微生物的分离在2.5mL含有5g/L酵母提取物(Difco制造)、5g/L聚胨(日本制药制造)、3g/L麦芽提取物(Difco制造)、20g/L葡萄糖(日本食品加工制造)组成的液体培养基中接种表1所示的各种菌株，在30℃有氧培养24-72小时。从所得各培养液中分别取1mL培养液，通过离心收集菌体。向该菌体中加入0.04mL Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)、9.028mL脱盐水，使菌体充分悬浮，然后添0.05mL 100g/L的葡萄糖、9.02mL 12g/L NADP+(Oriental酵母制造)，再加入0.01mL将反应底物2-戊酮或2-己酮溶解于异丙醇中形成100g/L的溶液，在30℃反应20小时。
将反应终止后的反应液用乙酸乙酯萃取，对生成的(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇进行定量。生成物的定量是使用气相色谱仪(GC)，对乙酸乙酯萃取溶液进行测定。GC的条件如下所述。
柱β-DEX 120(SUPELCO制造、30m×0.25mm ID、0.25μm膜)载气He 1.5mL/分钟、分流比1/50柱温进行(S)-2-戊醇定量时为50℃、进行(S)-2-己醇定量时为65℃。
注样温度250℃检测FID 250℃GC岛津GC-14A(S)-2-戊醇的定量结果如表1所示，(S)-2-己醇的定量结果如表2所示。
表1由2-戊酮生成(S)-2-戊醇的酵母
由2-戊酮生成(S)-2-戊醇的细菌
表2由2-己酮生成(S)-2-己醇的酵母
由2-己酮生成(S)-2-己醇的细菌
(2)来自Issatchankia scutulata var.scutulata JCM 1828菌株的羰基还原酶的分离将Issatchankia scutulata var.scutulata JCM 1828菌株在2L培养基(80g葡萄糖、20g酵母提取物(Difco制造)、40g/L蛋白胨(极东制药制造))中培养，通过离心制备菌体。将150g所得湿菌体悬浮于10mM磷酸钾缓冲液(pH 7)、0.1mM DTT(以下简称为“缓冲液”)，通过DYNO-MILL KDL(Shimaru Enterprises制造)破碎，然后通过离心除去菌体残渣，得到无细胞提取液。向该无细胞提取液中加入PEG6000，使浓度为90g/L，在4℃静置1小时，然后通过离心除去沉淀。然后通过使用DEAE Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences制造)进行的阴离子交换色谱、使用Butyl Sepharose4 Fast Flow(AmershamBiosciences制造)进行的疏水性相互作用色谱、使用MonoQ(AmershamBiosciences制造)进行的阴离子交换色谱、和使用Superdex 200(Amersham Biosciences制造)进行的凝胶过滤色谱等，从该上清中纯化目标羰基还原酶，直至电泳呈现单一条带。
纯化时，羰基还原酶的活性可如下测定在37℃使含有酶液的反应液(100mM Tris-HCl pH 7.5、0.32mM NADPH、2mM 1-乙酰氧基-3-氯-2-丙酮)反应，由340nm吸光度的减少计算NADPH的消耗量。吸光度的测定使用SPECTRAmax 190(Molecular Devices制造)。上述反应中，以1分钟消耗1nmol NADPH的活性为1U。
来自Issatchankia scutulata var.scutulataJCM 1828菌株的羰基还原酶的纯化结果如表3所示。
表3
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对上述表3的纯化阶段中的Superdex200活性组分进行分析，结果，纯化的蛋白质几乎为单一条带，其分子量为约40,000Da。
(3)IsADH1的底物专一性制备含有上述(2)中纯化的羰基还原酶液的反应液(100mMTris-HCl pH 7.5、0.32mM NADPH、2mM底物)，在37℃与各种羰基化合物反应。通过340nm吸光度监控反应液中的NADPH的消耗量，由此测定羰基还原酶对各种化合物的活性。吸光度的测定使用SPECTRAmax 190(Molecular Devices制造)。以羰基还原酶对1-乙酰氧基-3-氯-2-丙酮的活性为100，此时羰基还原酶对各底物化合物的相对活性如表4所示。
表4
-未检出活性trace有微弱活性(4)IsADH1的氨基酸序列分析将上述(2)中所得的上述表3的纯化阶段中Superdex200的含羰基还原酶组分进行脱盐、浓缩，然后通过埃德曼法对N末端氨基酸进行分析，确定了18个残基的N末端氨基酸序列。结果如SEQ ID NO.4所示。
通过使用赖氨酰内肽酶的消化法(蛋白质实验手册下、羊土社出版)，对纯化的羰基还原酶进行消化，使用反相HPLC(AmershamBiosciences制造μRPC C2/C18 PC3.2/3)对所得肽进行肽的分离。通过埃德曼法对分离的一种肽峰进行氨基酸序列分析，氨基酸序列如SEQID NO.5所示。
(5)编码IsADH1的DNA的序列分析以及转化体的制备将Issatchankia scutulata var.scutulata JCM 1828菌株在上述(2)所示的培养基中培养，制备菌体。
使用Dneasy tissue kit(Qiagen制造)从菌体中提取基因组DNA并纯化。根据所得基因组DNA，使用逆转录酶Super Script II逆转录酶(Invitrogen制造)，按照酶所附的说明进行cDNA的合成。
根据上述(4)所得SEQ ID NO.4的N末端氨基酸序列，合成有义简并引物，以及根据SEQ ID NO.5的内部氨基酸序列，合成反义的简并引物，共合成两种。它们的碱基序列分别如SEQ ID NO.6、7所示。使用该两种引物，对Issatchankia scutulata var.scutulata JCM 1828菌株的cDNA进行简并PCR，可以确认有约350bp的扩增片段。
将该DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，切取约350bp的片段的条带，通过MinElute凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)进行纯化并回收。将所得DNA片段用pGEM-Teasy Vector(Promega制造)连接，转化大肠杆菌DH5α菌株(东洋纺制造)。将转化菌株在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂培养基中培养，取一些菌落，使用T7引物(Promega制造)和SP6引物(Promega制造)进行菌落直接PCR，确认插入片段的大小。将认为插入了目标DNA片段的菌落在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上培养，通过QIAPrep Spin Mini Prep试剂盒(Qiagen制造)纯化质粒。
使用纯化的质粒，通过染料终止子法对插入的DNA碱基序列进行分析。确定的碱基序列如SEQ ID NO.8所示。
接着，根据Issatchankia scutulata var.scutulata JCM 1828菌株的基因组DNA，按照“分子克隆”中记载的方法，合成RACE反应用的cDNA，按照该文献中记载的方法进行5’-和3’-RACE反应。反应中使用了根据上述碱基序列设计的SEQ ID NO.9和10所示的两种基因特异性引物。
对通过RACE反应扩增的基因片段进行序列分析，结果，本发明的羰基还原酶的推定cDNA序列如SEQ ID NO.11所示，该DNA所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码SEQ ID NO.1的氨基酸序列的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
接着，根据上述SEQ ID NO.11的序列，合成SEQ ID NO.12的碱基序列和SEQ ID NO.13的碱基序列，以此作为克隆用引物，使用100μL含有各50pmol上述引物、各1000nmol dNTP、250ng Issatchankiascutulata var.scutulata JCM 1828菌株的cDNA、10μL ExTaq DNA聚合酶用10×缓冲液(宝生物制造)、5单位ExTaq DNA聚合酶(宝生物制造)的反应液，使用PTC-200(MJ Research制造)，进行变性(95℃、1分钟)、退火(58℃、1分钟)、延伸(72℃、1分钟)共30个循环。将PCR反应液的一部分通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果可以检测出特异性的条带。
将上述反应液用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen制造)纯化。将纯化的DNA片段用限制酶EcoRI和XbaI消化，进行琼脂糖凝胶电泳，切取目标条带部分，通过Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)进行纯化，然后回收。将所得DNA片段用经EcoRI和XbaI消化的pUC118和Ligation high(东洋纺织制造)进行连接，转化大肠杆菌JM109菌株。
将转化体在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB琼脂培养基上培养，进行菌落直接PCR，确认插入片段的大小。
将被认为插入了目标DNA片段的转化体在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上培养，用QIAPrepSpin Mini Prep试剂盒(Qiagen制造)进行质粒纯化，制成pUCIsADH1。
通过染料终止子法对插入到质粒中的DNA的碱基序列进行分析，结果，所插入的DNA片段与SEQ ID NO.2的碱基序列一致。
(6)使用经编码IsADH1的DNA转化的大肠杆菌进行(S)-2-戊醇的合成将上述(5)所得转化体在100mL含有氨苄青霉素(50μg/mL)的Circle Grow培养基中(DIO 101制造)、30℃培养30分钟，10级(series)培养。通过离心收集所得菌体，然后按照以下所示方法，以2-戊酮为底物进行(S)-2-戊醇的合成。
向10g上述菌体中添加20mg 0.6g/L NADP+(Oriental酵母制造)、10mL 1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)、40mL 100g/L葡萄糖、20mg葡萄糖脱氢酶(天野制药制造、76单位/mg)、1g 2-戊酮(东京化成制造、Neat)，然后在30℃反应8小时。通过2M碳酸钠使反应时的pH保持在7.0。将反应终止后的反应液用乙酸乙酯萃取，对生成的(S)-2-戊醇进行定量。
定量使用气相色谱(GC)对乙酸乙酯溶液进行测定。GC的条件如下所示。
柱β-DEX120(SUPELCO制造、30m×0.25mm ID、0.25μm膜)载气He 1.5mL/分钟、分流比1/50柱温50℃注样温度250℃检测FID 250℃GC岛津GC-14A结果，(S)-2-戊醇的收量为0.99g，光学纯度＞99.0％e.e.。
(7)使用经编码IsADH1的DNA转化的大肠杆菌进行(S)-2-己醇的合成使用上述(6)所得的转化体，按照以下所示方法，以2-己酮为底物，进行(S)-2-己醇的合成。
向10g上述菌体中添加20mg 0.6g/LNADP+(Oriental酵母制造)、10mL 1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)、40mL 100g/L葡萄糖、20mg葡萄糖脱氢酶(天野制药制造、76单位/mg)、1g 2-己酮(东京化成制造、Neat)，然后在30℃反应6小时。通过2M碳酸钠将反应时的pH保持在7.0。反应终止后的反应液用乙酸乙酯萃取，对生成的(S)-2-己醇进行定量。
定量使用气相色谱(GC)，对乙酸乙酯溶液进行测定。GC的条件如下所示。
柱β-DEX120(SUPELCO制造、30m×0.25mm ID、0.25μm膜)载气He 1.5mL/分钟、分流比1/50柱温65℃注样温度250℃检测FID 250℃GC岛津GC-14A结果，(S)-2-己醇的收量为0.99g，光学纯度＞99.0％e.e.。
(8)使用经编码IsADH1的DNA转化的大肠杆菌进行(S)-2-戊醇的合成(放大)使用上述(6)所得转化体，按照以下所示方法，以2-戊酮为底物，进行(S)-2-戊醇的合成。
向140g上述菌体(相当于约42g干菌体重量)中添加84mg NADP+(Oriental酵母制造)、140mL 1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)、118g葡萄糖、40mg葡萄糖脱氢酶(天野制药制造、76单位/mg)、28g 2-戊酮(东京化成制造、Neat)，然后加入脱盐水，使反应容量为1.4L，在30℃反应16小时。用2M碳酸钠使反应时的pH保持在7.0。反应终止后的反应液用乙酸乙酯萃取，对生成的(S)-2-戊醇进行定量，(S)-2-戊醇的收量为17.2g，光学纯度＞99.0％e.e.。
(9)使用经编码IsADH1的DNA转化的大肠杆菌进行(S)-2-己醇的合成(放大)使用上述(6)所得转化体，按照以下所示方法，以2-己酮为底物，进行(S)-2-己醇的合成。
向50g上述菌体(相当于约15g干菌体重量)中加入30mg NADP+(Oriental酵母制造)、50mL 1M Tris-HCl缓冲液(pH7.0)、54g葡萄糖、20mg葡萄糖脱氢酶(天野制药制造、76单位/mg)、15g 2-己酮(东京化成制造、Neat)，然后加入脱盐水，使反应容量为500mL，在30℃反应7.5小时。用2M碳酸钠使反应时的pH保持7.0。反应终止后的反应液用乙酸乙酯萃取，对生成的(S)-2-己醇进行定量，结果(S)-2-己醇的收量为15.1g，光学纯度＞99.0％e.e.。
实施例B(通过化学合成制备光学活性羧酸)(实施例1)(S)-2-甲磺酰氧基戊烷的合成向200mL三颈烧瓶加入4.14g(47.0mmol，99.1％e.e.)(S)-2-戊醇和9.8mL(71mmol)三乙胺、41mL二氯甲烷。将该混合液冰冷却，滴加4.36mL(56.4mmol)甲磺酰氯。然后搅拌30分钟，添加40mL饱和氯化铵水溶液和20mL水，中止反应。将混合物用80mL二乙醚萃取，将有机层用20mL饱和氯化铵水溶液和20mL饱和食盐水洗涤，用硫酸镁干燥。馏去溶剂，得到8.5g粗制(S)-2-甲磺酰氧基戊烷，无需再次纯化即可用于以下的反应。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.95(t，J＝7.2Hz，3H)，1.42(d，J＝6.3Hz，3H)，1.34-1.50(m，2H)，1.50-1.63(m，1H)，1.67-1.77(m，1H)，3.00(s，3H)，4.77-4.86(m，1H).
(实施例2)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸二乙酯的合成将8.5g实施例1中所得的粗制(S)-2-甲磺酰氧基戊烷和14.2g(88mmol)丙二酸二乙酯、22mL DMF装入200mL的茄型烧瓶中，将该混合液冰冷却，添加3.5g(88mmol)60％氢化钠(油性)。然后在60℃反应5小时，在80℃反应3小时，然后在室温下添加40mL饱和氯化铵水溶液和10mL水，中止反应。将混合物用100mL乙酸乙酯萃取，将有机层用20mL饱和氯化铵水溶液、20mL水、20mL饱和食盐水洗涤，用硫酸镁干燥。馏去溶剂，通过硅胶柱层析纯化，得到7.77g(R)-(1-甲基丁基)丙二酸二乙酯(无色油状物质、33.8mmol、收率72％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.89(t，J＝6.9Hz，3H)，0.98(d，J＝6.6Hz，3H)，1.27(t，J＝7.1Hz，6H)，1.15-1.46(m，4H)，2.20-2.31(m，1H)，3.22(d，J＝8.1Hz，1H)，4.19(q，J＝7.1Hz，4H).
(实施例3)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸的合成将7.77g(33.5mmol)实施例2所得的(R)-(1-甲基丁基)丙二酸二乙酯和16.1g(100mmol)25％氢氧化钠水溶液、3.9mL乙醇、15.4mL水装入200mL的茄型烧瓶中。将该混合液在60℃反应1.5小时，然后在室温下添加9mL浓盐酸，使其为酸性。向混合液中加入食盐，使其饱和，然后用100mL乙酸乙酯萃取。用50mL乙酸乙酯再次萃取水层，用硫酸钠干燥有机层。馏去溶剂后，从58mL乙烷和5.8mL乙酸乙酯中析出晶体，得到4.73g(R)-(1-甲基丁基)丙二酸(白色板状结晶、27.1mmol、收率81％)。手性分析结果，光学纯度为99.3％e.e.(Supelco，β-DEX120，inj.300℃，FID250℃，Det.250℃，Oven 130℃，对注射时脱羧产生的3-甲基己酸进行分析)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.91(t，J＝6.8Hz，3H)，1.06(d，J＝6.8Hz，3H)，1.22-1.40(m，2H)，1.40-1.58(m，2H)，2.25-2.37(m，1H)，3.37(d，J＝7.6Hz，1H)，10.67(brs，2H).
(实施例4)(S)-2-甲磺酰氧基己烷的合成向300mL三颈烧瓶加入6.3g(62.0mmol，99.7％e.e.)(S)-2-己醇和13mL(93mmol)三乙胺、126mL乙酸乙酯。将该混合液冰冷却，滴加5.7mL(74mmol)甲磺酰氯。然后搅拌30分钟，添加40mL饱和氯化铵水溶液和20mL水，使反应中止，分离水层。将有机层用20mL饱和氯化铵水溶液和20mL饱和食盐水洗涤，用硫酸镁干燥。馏去溶剂，得到10.8g粗制(S)-2-甲磺酰氧基己烷，无需进一步纯化即可用于以下的反应。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.92(t，J＝7.1Hz，3H)，1.25-1.45(m，4H)，1.42(d，J＝6.3Hz，3H)，1.55-1.65(m，1H)，1.68-1.79(m，1H)，3.00(s，3H)，4.75-4.84(m，1H).
(实施例5)(R)-(1-甲基戊基)丙二酸二乙酯的合成将10.8g实施例4中所得的粗制(S)-2-甲磺酰氧基己烷和19.2g(120mmol)丙二酸二乙酯、32mL DMF加入到200mL的茄型烧瓶中。将该混合液冰冷却，添加4.8g(120mmol)60％氢化钠(油性)。然后在60℃反应1小时、在80℃反应3小时，然后在室温下加入50mL饱和氯化铵水溶液和10mL水，使反应中止。将混合物用100mL乙酸乙酯萃取，将有机层用30mL水洗涤两次，再用30mL饱和食盐水洗涤，用硫酸镁干燥。馏去溶剂后，通过硅胶柱层析纯化，得到12.0g(R)-(1-甲基戊基)丙二酸二乙酯(无色油状物质、49mmol、收率82％)。
1H-NMR(400MNz，CDCl3)δ0.891(t，J＝6.9Hz，3H)，0.98(d，J＝6.6Hz，3H)，1.27(t，J＝7.1Hz，6H)，1.15-1.45(m，6H)，2.17-2.29(m，1H)，3.22(d，J＝8.1Hz，1H)，4.19(q，J＝7.1Hz，4H).
(实施例6)(R)-(1-甲基戊基)丙二酸的合成将11.7g(48mmol)实施例5中所得的(R)-(1-甲基戊基)丙二酸二乙酯和23g(144mmol)25％氢氧化钠水溶液、5.9mL乙醇、24mL水装入100mL的茄型烧瓶中。将该混合液在60℃反应2小时，然后在室温下添加13mL浓盐酸，使其为酸性。向混合液中加入食盐，使其饱和，然后用120mL乙酸乙酯萃取。用40mL乙酸乙酯再次萃取水层，用硫酸钠干燥有机层。馏去溶剂后，从90mL乙烷和18mL乙酸乙酯中晶析，得到6.5g(R)-(1-甲基戊基)丙二酸(白色柱状结晶、35mmol、收率72％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.90(t，J＝6.7Hz，3H)，1.07(d，J＝6.8Hz，3H)，1.21-1.41(m，5H)，1.46-1.56(m，1H)，2.22-2.33(m，1H)，3.39(d，J＝7.3Hz，1H).
(实施例7)(R)-3-甲基己酸的合成将4.56g(26.2mmol)实施例3中所得的(R)-(1-甲基丁基)丙二酸装入50mL茄型烧瓶中，升温至180℃，待气体的发生停止后，再搅拌10分钟，然后冷却至室温。将所得粗制产物减压蒸馏，得到2.05g(R)-3-甲基己酸(无色油状物质、沸点77℃/3mmHg、15.7mmol、收率60％)。手性分析结果，光学纯度为99.2％e.e.(Supelco，β-DEX120，inj.250℃，FID250℃，Det.250℃，Oven 130℃)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.90(t，J＝7.1Hz，3H)，0.96(d，J＝6.6Hz，3H)，1.16-1.44(m，4H)，1.91-2.05(m，1H)，2.15(dd，J＝14.9，8.1Hz，1H)，2.35(dd，J＝14.9，5.8Hz，1H)，11.00(brs，1H).
(实施例8)(R)-3-甲基庚酸的合成将3.00g(15.9mmol)实施例6所得的(R)-(1-甲基戊基)丙二酸装入到20mL茄型烧瓶中，升温至180℃。待气体的发生停止后，再搅拌10分钟，然后冷却至室温。将所得粗制产物减压蒸馏，得到1.69g(R)-3-甲基庚酸(无色油状物质、沸点86℃/4mmHg、11.7mmol、收率74％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ0.89(t，J＝6.8Hz，3H)，0.97(d，J＝6.8Hz，3H)，1.17-1.39(m，6H)，1.88-2.03(m，1H)，2.14(dd，J＝14.9，8.1Hz，1H)，2.35(dd，J＝14.9，5.9Hz，1H)11.36(brs，1H).
(实施例9)(R)-3-甲基己酸的合成(吡啶溶剂)在氮气氛下，将1.00g(5.8mmol)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸、2mL吡啶装入15mL磨砂口试管，并升温。从90℃起始反应，用115分钟升温至130℃，再搅拌30分钟，然后冷却至室温。通过HPLC分析，转化率为100.0％。
(实施例10)(R)-3-甲基己酸的合成(DMSO溶剂)在氮气氛下，将2.00g(11.5mmol)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸、4mLDMSO加入到15mL磨砂口试管中并升温。从100℃起始反应，用75分钟升温至140℃，再搅拌20分钟，然后冷却至室温。通过HPLC分析，转化率为100.0％。
(实施例11)(R)-3-甲基己酸的合成(添加吡啶)
在氮气氛下，将2.00g(11.5mmol)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸、182mg(2.3mmol)吡啶加入到15mL磨砂口试管中并升温。从100℃起始反应，用95分钟升温至150℃，再搅拌15分钟，然后冷却至室温。通过HPLC分析，转化率为100.0％。
(实施例12)(R)-3-甲基己酸的合成(添加DABCO)在氮气氛下，将2.00g(11.5mmol)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸、258mg(2.3mmol)1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)加入到15mL磨砂口试管中并升温。从100℃起始反应，用95分钟升温至140℃，再搅拌15分钟，然后冷却至室温。通过HPLC分析，转化率为100.0％。
(实施例13)(R)-3-甲基己酸的合成(添加DBU)在氮气氛下，将2.00g(11.5mmol)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸、350mg(2.3mmol)1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯(DBU)加入到15mL磨砂口试管中，升温。从110℃起始反应，用50分钟升温至140℃，再搅拌20分钟，然后冷却至室温。通过HPLC分析，转化率为100.0％。
(实施例14)(R)-3-甲基己酸的合成(乙酸酐催化剂·吡啶溶剂)在氮气氛下，将1.00g(5.8mmol)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸、2mL吡啶加入到15mL磨砂口试管中，添加294mg(2.88mmol)乙酸酐。在室温下搅拌2小时，在40℃搅拌1小时，然后冷却至室温。用HPLC进行分析，转化率为99.8％。
(实施例15)(R)-3-甲基己酸的合成(添加硫酸)在氮气氛下，将2.00g(11.5mmol)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸、113mg(1.15mmol)硫酸加入到15mL磨砂口试管中并升温。从130℃起始反应，用100分钟升温至180℃，再搅拌20分钟，然后冷却至室温。通过HPLC进行分析，转化率为100.0％。
(实施例16)(R)-3-甲基己酸的合成(添加Fe3O4)在氮气氛下，将2.00g(11.5mmol)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸、40mg(2wt％)氧化铁(Fe3O4)加入到15mL磨砂口试管中并升温。从130℃起始反应，用100分钟升温至180℃，再搅拌20分钟，然后冷却至室温。通过HPLC进行分析，转化率为100.0％。
(实施例17)(R)-3-甲基己酸的合成(添加氧化铜(I))在氮气氛下，将2.00g(11.5mmol)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸、82.8mg(0.58mmol)氧化铜(I)、20mL乙腈加入到100mL的烧瓶中，加热回流。反应6小时后，冷却至室温。通过HPLC进行分析，转化率为64.3％。
(实施例18)(R)-3-甲基己酸的合成(无添加剂)在氮气氛下，将3.00g(17.2mmol)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸装入到茄型烧瓶中并升温。从130℃起始反应，用75分钟升温至180℃，再搅拌15分钟，然后冷却至室温。通过HPLC进行分析，转化率为100.0％。
上述实施例9-18的结果如以下表5所示。
表5
(实施例19)(R)-2-甲磺酰氧基戊烷的合成向2L分离式烧瓶中加入417g含有100g(1.13mol，100％e.e.)(S)-2-戊醇的乙酸乙酯溶液和149g(1.47mol)三乙胺。将该溶液冷却至5℃，滴加156g(1.36mol)甲磺酰氯。然后在室温下搅拌1小时，添加440g水，中止反应。除去水层，向有机层中加入267g 10％食盐水，然后用5％碳酸氢钠水溶液使水层的pH为中性。除去水层，馏去溶剂，然后将添加甲苯、浓缩的步骤重复两次，得到191g粗制(S)-2-甲磺酰氧基戊烷(淡褐色油状物质、化学纯度93.5％、1.07mol、收率94.6％)。
(实施例20)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸二乙酯的合成向4000mL分离式烧瓶中加入71.7g(1.79mol)60％氢化钠(油性)、605g THF。将287g丙二酸二乙酯(1.79mol)和28.4g THF在25-40℃滴加到反应液中，用28.4g THF冲洗。升温至65-70℃，然后添加266g(纯度80.1％、1.28mol)粗制(S)-2-甲磺酰氧基戊烷和28.4g THF。然后在回流下反应6小时，在室温下加入638mL水，然后加入浓盐酸，使pH值调节为6-7。除去水层，馏去溶剂，得到443g粗制(R)-(1-甲基丁基)丙二酸二乙酯(无色油状物质、纯度59.9％、1.15mol、收率90.5％)。
(实施例21)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸的合成将439g(纯度59.9％、1.14mmol)粗制(R)-(1-甲基丁基)丙二酸二乙酯和6650g(4.04mol)25％氢氧化钠水溶液、797mL水加入到4000mL分离式烧瓶中。将该混合液在60-70℃反应6小时，然后冷却。将反应液倒出，将421g浓盐酸(4.05mol)加入到烧瓶中，然后滴加反应液。混合液的pH为1.1。将混合液用717g乙酸乙酯萃取。用532mL 0.26M盐酸洗涤有机层，馏去溶剂，用甲苯置换。从974g甲苯中晶析，得到170g(R)-(1-甲基丁基)丙二酸(白色板状晶体、纯度95.3％、0.931mmol、收率81.7％)。手性分析的结果，光学纯度为99.7％e.e.。
(实施例22)(R)-3-甲基己酸的合成在氮气氛下，将89g吡啶加入到1L的茄型烧瓶中，升温至110℃，用5小时滴加使140g(766mmol、纯度95.4％)(R)-(1-甲基丁基)丙二酸溶解于147g吡啶所得的溶液中。再搅拌1小时，然后冷却至室温，得到329g(R)-3-甲基己酸的吡淀溶液。通过HPLC进行分析，转化率为100.0％，收率为定量。
将754g含有169g(1.29mmol)反应所得的(R)-3-甲基己酸的吡啶溶液在约50Torr下进行减压蒸馏，除去吡啶，得到197g粗制(R)-3-甲基己酸。将190g该粗制(R)-3-甲基己酸在约10Torr下精馏，得到152g(R)-3-甲基己酸(无色油状物质、1.17mol、收率90％、纯度99.3％)。手性分析的结果，光学纯度为99.5％e.e.。
产业实用性根据本发明的方法，可以以高光学纯度且高浓度获得可用作医药、农药等的中间体原料的工业上有用的化合物(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇。
根据本发明，可以通过成本低且效率高的工业化制备方法，以高光学纯度获得可用作医药、农药中间体的光学活性1-甲基烷基丙二酸和光学活性3-甲基羧酸。
序列表<110>API Corporation<120>具有光学活性的醇和羧酸的制备方法<130>A51051A<160>13<210>1<211>345<212>PRT<213>Issatchenkia scutulata<400>1Met Ser Asn Lys Thr Val Leu Val Thr Gly Ala Thr Gly Phe Ile Ala1 5 10 15Leu His Ile Ile Asp Asn Leu Leu Ser Lys Gly Tyr Ser Val Ile Gly20 25 30Thr Ala Arg Ser Gln Ser Lys Tyr Gln Pro Ile Leu Asp Ala Phe Lys35 40 45Lys Lys Tyr Pro Asp Ala Asn Leu Thr Phe Glu Val Val Pro Asp Ile50 55 60Ser Thr Glu Asn Ala Phe Asp Asp Val Leu Lys Lys His Pro Glu Ile65 70 75 80Thr Ala Val Leu His Thr Ala Ser Pro Phe Ser Phe Gly Leu Asn Lys85 90 95Asp Leu Lys Glu Ala Tyr Leu Lys Pro Ala Val Asp Gly Thr Leu Asn100 105 110Ile Leu Lys Ala Ile Glu Lys Tyr Ala Pro Gln Val Thr Lys Val Val115 120 125Ile Thr Ser Ser Tyr Ala Ala Ile Met Thr Gly Asn Pro Ser His Val
130 135 140His Thr Ser Glu Thr Trp Asn Pro Ile Asn Trp Glu Asn Asp Val Lys145 150 155 160Asn Glu Tyr Phe Ala Tyr Ile Ala Ser Lys Thr Tyr Ala Glu Lys Ala165 170 175Ala Arg Asp Phe Val Lys Glu His Lys Val Asn Phe Lys Leu Ala Thr180185 190Val Asn Pro Pro Tyr Val Leu Gly Pro Gln Leu Phe Asp Phe Ser Val195 200 205Gly Pro Val Leu Asn Thr Ser Asn Gln Leu Ile Thr Asp Ala Thr Lys210 215 220Ile Asp Lys Asn Ser Thr Lys Pro Glu Leu Gly Thr Pro Ala Leu Ala225 230 235 240Val Asp Val Arg Asp Val Ala Ala Phe His Val Leu Pro Leu Glu Asp245 250 255Asp Lys Val Ala Ser Glu Arg Leu Phe Ile Val Ala Gly Pro Ala Val260 265 270Val Gln Thr Phe Leu Asn Ile Ile Asn Glu Asn Ile Pro G1u Leu Lys275 280 285Gly Lys Val Ala Leu Gly Asp Pro Ala Ser Glu Lys Glu Leu Ile Glu290 295 300Lys His Thr Asp Lys Tyr Asp Leu Thr Asn Leu His Asn Val Ile Gly305 310 315 320Lys Tyr Asp Phe Ile Pro Val Glu Lys Ser Val Val Asp Val Leu Glu325 330 335Gln Tyr Tyr Lys Ile Asn Lys Ile Asp340 345
<210>2<211>1038<212>DNA<213>Issatchenkia scutulata<400>2atgtcgaaca aaacagttct agtcaccggg gctaccggtt ttattgcact acacatcatt 60gataatttat tgtctaaggg ttattccgtt attggtacag ctagatccca atctaaatat 120caaccaatcc ttgatgcttt caagaaaaaa taccctgatg caaatttgac ttttgaagtt 180gtccctgaca tctccactga aaacgcattc gatgatgttt tgaagaagca tccagaaatt 240actgctgtcc ttcacacagc atctccattc tcttttggtt tgaacaagga tctgaaggaa 300gcatatttga agcctgccgt tgatggtact ttgaatattc tcaaggcaat tgagaagtat 360gcaccacagg ttactaaagt tgttatcaca tcttcttatg ctgcaattat gacaggtaat 420ccaagtcatg tccacaccag tgaaacctgg aacccaatta attgggaaaa cgatgtgaag 480aatgaatact ttgcatatat tgcctccaag acgtatgctg aaaaagctgc gagagatttt 540gtcaaggagc ataaggtcaa tttcaagtta gcaactgtta acccaccata cgttctgggt 600ccacaattat ttgacttctc agttggtcca gtcttgaaca cttccaacca attgatcacg 660gatgcgacta aaattgataa gaactctact aagccggaat taggtacacc agctttagca 720gtcgatgtta gagatgttgc tgcgttccat gttttaccat tggaagatga taaagttgca 780agtgaaagat tatttattgt tgctggtcca gcagttgttc aaacattctt aaacatcatc 840aacgagaaca ttccagaact taaaggtaag gttgccctag gagatccagc ttcagagaag 900gagttgattg aaaagcacac agataagtat gatttgacaa atcttcacaa cgttattggt 960aaatatgatt tcattccagt tgaaaagtcc gttgtcgacg tcttagaaca atattacaaa 1020atcaataaaa ttgattag 1038<210>3<211>344<212>PRT<213>啤酒糖酵母
<400>3Met Ser Asn Thr Val Leu Val Ser Gly Ala Ser Gly Phe Ile Ala Leu1 5 10 15His Ile Leu Ser Gln Leu Leu Lys Gln Asp Tyr Lys Val Ile Gly Thr20 25 30Val Arg Ser His Glu Lys Glu Ala Lys Leu Leu Arg Gln Phe Gln His35 40 45Asn Pro Asn Leu Thr Leu Glu Ile Val Pro Asp Ile Ser His Pro Asn50 55 60Ala Phe Asp Lys Val Leu Gln Lys Arg Gly Arg Glu Ile Arg Tyr Val65 70 75 80Leu His Thr Ala Ser Pro Phe His Tyr Asp Thr Thr Glu Tyr Glu Lys85 90 95Asp Leu Leu Ile Pro Ala Leu Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Asn Ser100 105 110Ile Lys Lys Tyr Ala Ala Asp Thr Val Glu Arg Val Val Val Thr Ser115 120 125Ser Cys Thr Ala Ile Ile Thr Leu Ala Lys Met Asp Asp Pro Ser Val130 135 140Val Phe Thr Glu Glu Ser Trp Asn Glu Ala Thr Trp Glu Ser Cys Gln145 150 155 160Ile Asp Gly Ile Asn Ala Tyr Phe Ala Ser Lys Lys Phe Ala Glu Lys165 170 175Ala Ala Trp Glu Phe Thr Lys Glu Asn Glu Asp His Ile Lys Phe Lys180 185 190Leu Thr Thr Val Asn Pro Ser Leu Leu Phe Gly Pro Gln Leu Phe Asp195 200 205
Glu Asp Val His Gly His Leu Asn Thr Ser Cys Glu Met Ile Asn Gly210 215 220Leu Ile His Thr Pro Val Asn Ala Ser Val Pro Asp Phe His Ser Ile225 230 235 240Phe Ile Asp Val Arg Asp Val Ala Leu Ala His Leu Tyr Ala Phe Gln245 250 255Lys Glu Asn Thr Ala Gly Lys Arg Leu Val Val Thr Asn Gly Lys Phe260 265 270Gly Asn Gln Asp Ile Leu Asp Ile Leu Asn Glu Asp Phe Pro Gln Leu275 280 285Arg Gly Leu Ile Pro Leu Gly Lys Pro Gly Thr Gly Asp Gln Val Ile290 295 300Asp Arg Gly Ser Thr Thr Asp Asn Ser Ala Thr Arg Lys Ile Leu Gly305 310 315 320Phe Glu Phe Arg Ser Leu His Glu Ser Val His Asp Thr Ala Ala Gln325 330 335Ile Leu Lys Lys Glu Asn Arg Leu340<210>4<211>18<212>PRT<213>Issatchenkia scutulata<400>4Arg Asn Lys Thr Val Leu Val Thr Gly Ala Thr Gly Phe Ile Ala Leu1 5 10 15Asp Ile<210>5
<211>15<212>PRT<213>Issatchenkia scutulata<400>5Val Val Ile Thr Ser Ser Tyr Ala Ala Ile Met Thr Gly Asn Pro1 5 10 15<210>6<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>n；肌苷<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>n；肌苷<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>n；肌苷<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)
<223>n；肌苷<400>6acnggnttya thgcnytnga yat 23<210>7<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>n；肌苷<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n；肌苷<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n；肌苷<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>n；肌苷<400>7ggrttnccng tcatdatngc ngcrta26<210>8<211>341
<2l2>DNA<213>Issatchenkia scutulata<400>8cattgataat ttattgtcta agggttattc cgttattggt acagctagat cccaatctaa 60atatcaacca atccttgatg ctttcaagaa aaaataccct gatgcaaatt tgacttttga 120agttgtccct gacatctcca ctgaaaacgc attcgatgat gttttgaaga agcatccaga 180aattactgct gtccttcaca cagcatctcc attctctttt ggtttgaaca aggatctgaa 240ggaagcatat ttgaagcctg ccgttgatgg tactttgaat attctcaagg caattgagaa 300gtatgcacca caggttacta aagttgttat cacatcttctt 341<210>9<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>9agggttattc cgttattggt acagctag 28<210>10<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>10gagaatggag atgctgtgtg aaggacagcag 31<210>11<211>1212
<212>DNA<213>Issatchenkia scutulata<220>
<221>CDS<222>(55)..(1092)<223>
<400>11tcatgacctg tccactgata gcatcatacc aaacatattc agtatattgt aaca atg57Met1tcg aac aaa aca gtt cta gtc acc ggg gct acc ggt ttt att gca cta 105Ser Asn Lys Thr Val Leu Val Thr Gly Ala Thr Gly Phe Ile Ala Leu5 10 15cac atc att gat aat tta ttg tct aag ggt tat tcc gtt att ggt aca 153His Ile Ile Asp Asn Leu Leu Ser Lys Gly Tyr Ser Val Ile Gly Thr20 25 30gct aga tcc caa tct aaa tat caa cca atc ctt gat gct ttc aag aaa 201Ala Arg Ser Gln Ser Lys Tyr Gln Pro Ile Leu Asp Ala Phe Lys Lys35 40 45aaa tac cct gat gca aat ttg act ttt gaa gtt gtc cct gac atc tcc 249Lys Tyr Pro Asp Ala Asn Leu Thr Phe Glu Val Val Pro Asp Ile Ser50 55 60 65act gaa aac gca ttc gat gat gtt ttg aag aag cat cca gaa att act 297Thr Glu Asn Ala Phe Asp Asp Val Leu Lys Lys His Pro Glu Ile Thr70 75 80gct gtc ctt cac aca gca tct cca ttc tct ttt ggt ttg aac aag gat 345Ala Val Leu His Thr Ala Ser Pro Phe Ser Phe Gly Leu Asn Lys Asp
85 90 95ctg aag gaa gca tat ttg aag cct gcc gtt gat ggt act ttg aat att 393Leu Lys Glu Ala Tyr Leu Lys Pro Ala Val Asp Gly Thr Leu Asn Ile100 105 110ctc aag gca att gag aag tat gca cca cag gtt act aaa gtt gtt atc 441Leu Lys Ala Ile Glu Lys Tyr Ala Pro Gln Val Thr Lys Val Val Ile115 120 125aca tct tct tat gct gca att atg aca ggt aat cca agt cat gtc cac 489Thr Ser Ser Tyr Ala Ala Ile Met Thr Gly Asn Pro Ser His Val His130 135 140 145acc agt gaa acc tgg aac cca att aat tgg gaa aac gat gtg aag aat 537Thr Ser Glu Thr Trp Asn Pro Ile Asn Trp Glu Asn Asp Val Lys Asn150 155 160gaa tac ttt gca tat att gcc tcc aag acg tat gct gaa aaa gct gcg 585Glu Tyr Phe Ala Tyr Ile Ala Ser Lys Thr Tyr Ala Glu Lys Ala Ala165 170 175aga gat ttt gtc aag gag cat aag gtc aat ttc aag tta gca act gtt 633Arg Asp Phe Val Lys Glu His Lys Val Asn Phe Lys Leu Ala Thr Val180 185 190aac cca cca tac gtt ctg ggt cca caa tta ttt gac ttc tca gtt ggt 681Asn Pro Pro Tyr Val Leu Gly Pro Gln Leu Phe Asp Phe Ser Val Gly195 200 205cca gtc ttg aac act tcc aac caa ttg atc acg gat gcg act aaa att 729Pro Val Leu Asn Thr Ser Asn Gln Leu Ile Thr Asp Ala Thr Lys Ile210 215 220 225gat aag aac tct act aag ccg gaa tta ggt aca cca gct tta gca gtc 777Asp Lys Asn Ser Thr Lys Pro Glu Leu Gly Thr Pro Ala Leu Ala Val
230 235 240gat gtt aga gat gtt gct gcg ttc cat gtt tta cca ttg gaa gat gat825Asp Val Arg Asp Val Ala Ala Phe His Val Leu Pro Leu Glu Asp Asp245 250 255aaa gtt gca agt gaa aga tta ttt att gtt gct ggt cca gca gtt gtt873Lys Val Ala Ser Glu Arg Leu Phe Ile Val Ala Gly Pro Ala Val Val260 265 270caa aca ttc tta aac atc atc aac gag aac att cca gaa ctt aaa ggt921Gln Thr Phe Leu Asa Ile Ile Asn Glu Asa Ile Pro Glu Leu Lys Gly275 280 285aag gtt gcc cta gga gat cca gct tca gag aag gag ttg att gaa aag969Lys Val A1a Leu Gly Asp Pro Ala Ser Glu Lys Glu Lau Ile Glu Lys290 295 300 305cac aca gat aag tat gat ttg aca aat ctt cac aac gtt att ggt aaa 1017His Thr Asp Lys Tyr Asp Leu Thr Asn Leu His Asn Val Ile Gly Lys310 315 320tat gat ttc att cca gtt gaa aag tcc gtt gtc gac gtc tta gaa caa 1065Tyr Asp Phe Ile Pro Val Glu Lys Ser Val Val Asp Val Leu Glu Gln325 330 335tat tac aaa atc aat aaa att gat tag tttatataga aaattttata 1112Tyr Tyr Lys Ile Asn Lys Ile Asp340 345gctaaaggcc gaatcaactt ctttcttcct cttcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1172aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1212<210>12<211>35<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>12cggaattcat gtcgaacaaa acagttctag tcacc 35<210>13<211>38<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>13gctctagatt aatcaatttt attgattttg taatattg38
权利要求
1.制备(S)-2-戊醇的方法，该方法是使由微生物或转化细胞、该微生物或细胞处理物、该微生物或细胞培养液、和/或从该微生物或细胞得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与2-戊酮作用，制备(S)-2-戊醇的方法，其特征在于该微生物或转化细胞在其未经溶剂前处理的活菌体与2-戊酮作用时，可生成95％e.e.或以上光学纯度的(S)-2-戊醇，且其产率为1mg(S)-2-戊醇/g干菌体重量/小时或以上。
2.制备(S)-2-己醇的方法，该方法是使由微生物或转化细胞、该微生物或细胞处理物、该微生物或细胞培养液、和/或从该微生物或细胞得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与2-己酮作用，制备(S)-2-己醇的方法，其特征在于该微生物或转化细胞在其未经溶剂前处理的活菌体与2-己酮作用时，可生成95％e.e.或以上光学纯度的(S)-2-己醇，且其产率为1mg(S)-2-己醇/g干菌体重量/小时或以上。
3.高光学纯度的(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的制备方法，其特征在于使由选自酒香酵母属(Brettanomyces)、假丝酵母属(Candida)、Hortaea、伊氏酵母属(Issatchenkia)、路德酵母属(Lodderomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、短小杆菌属(Crutobacterium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、副球菌属(Paracoccus)、根瘤菌属(Rhizobium)、红球菌属(Rhodococcus)的微生物、该微生物处理物、该微生物培养液、和/或从该微生物得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与2-戊酮或2-己酮作用，生成(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇。
4.高光学纯度的(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的制备方法，其特征在于使表达下述DNA的转化细胞、该细胞处理物、该细胞培养液、和/或从该细胞得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与2-戊酮或2-己酮作用，生成(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇，其中，所述DNA编码由下述微生物得到的羰基还原酶，所述微生物选自酒香酵母属(Brettanomyces)、假丝酵母属(Candida)、Hortaea、伊氏酵母属(Issatchenkia)、路德酵母属(Lodderomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、短小杆菌属(Crutobacterium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、副球菌属(Paracoccus)、根瘤菌属(Rhizobium)、红球菌属(Rhodococcus)。
5.权利要求3或4的制备方法，其特征在于所述微生物是选自布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)、异酒香酵母(Breettanomyces anomalus)、无名假丝酵母(Candida famata)、克柔假丝酵母(Candida krusei)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、涎沫假丝酵母(Candida zeylanoides)、Hortaea werneckii、Issatchenkia scutulata、Lodderomyces elongisporus、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、Pichia besseyi、Pichia cactophila、Pichia segobiensis、斯巴达克毕赤酵母(Pichia spartinae)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、微小红酵母(Rhodotorula minuta)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)、多色节杆菌(Arthrobacterpolychromogenes)、节杆菌属某种(Arthrobacter sp.)、硫磺色节杆菌(Arthrobacter sulfurous)、Brevibacterium butanicum、萎蔫短小杆菌(Curtobacterium flaccumfaciens)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、解角质微杆菌(Microbacterium keratanolyticum)、天牛微杆菌(Microbacterium saperdae)、微杆菌属某种(Microbacteriumsp.)、砖红色微杆菌(Microbacterium testaceum)、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)、苍白杆菌属某种(Ochrobactrum sp.)、卵状假单胞杆菌(Pseudomonas ovalis)、脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、红球菌属某种(Rhodococcus sp.)、解烃棒杆菌(Corynebacterium hydrocarboclastum)的微生物。
6.高光学纯度的(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇的制备方法，其特征在于使表达下述(A)-(F)中任一项的DNA的转化细胞、该细胞处理物和/或该细胞培养液与2-戊酮或2-己酮作用，生成(S)-2-戊醇或(S)-2-己醇(A)编码具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白质的DNA；(B)编码下述蛋白质的DNA，所述蛋白质具有在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中1至多个氨基酸缺失、添加或取代后所得的氨基酸序列、并且具有还原羰基、合成光学活性醇的能力；(C)编码下述蛋白质的DNA，所述蛋白质具有与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列有50％或以上的同源性的氨基酸序列、并且具有还原羰基、合成光学活性醇的能力；(D)具有SEQ ID NO.2所示碱基序列的DNA；(E)具有SEQ ID NO.2所示碱基序列中1至多个碱基缺失、添加或取代后所得的碱基序列、并且具有编码下述蛋白质的碱基序列的DNA，所述蛋白质具有还原羰基、合成光学活性醇的能力；(F)具有与SEQ ID NO.2所示碱基序列或其互补序列在严格条件下杂交的碱基序列，并且具有编码下述蛋白质的碱基序列的DNA，所述蛋白质具有还原羰基、合成光学活性醇的能力。
7.下述通式(5)所示的(R)或(S)-3-甲基羧酸的制备方法，其特征在于 在高极性溶剂和/或促进脱羧作用的添加剂存在下，使下述通式(1)所示的具有光学活性的(R)或(S)-1-甲基烷基丙二酸脱羧， 其中，式(1)中，R1表示碳原子数为3-5的烷基，*表示不对称碳原子；式(5)中，R1与前述含义相同，*表示不对称碳原子。
8.下述通式(1)所示的(R)或(S)-1-甲基烷基丙二酸的制备方法，其特征在于 使下述通式(2)所示的光学活性醇与磺酰化剂反应，得到下述通式(3)所示的光学活性化合物， 然后在碱存在下，与通式(9)所示的碳亲核体反应，制成下述通式(4)所示的光学活性化合物，然后进行水解， 其中，式(1)中，R1表示碳原子数为3-5的烷基，*表示不对称碳原子；式(2)中，R1与前述含义相同，*表示不对称碳原子；式(3)中，R1与前述含义相同，X表示磺酰基氧基，*表示不对称碳原子；式(9)中，R2和R3各自独立地表示酯基、羧基或氰基，其中R2和R3可一起形成环状结构；式(4)中，R1、R2和R3与前述含义相同，*表示不对称碳原子。
9.下述通式(1)表示的、光学纯度为90％ee或以上的(R)-1-甲基烷基丙二酸或(S)-1-甲基烷基丙二酸 式(1)中，R1表示碳原子数为3-5的烷基，*表示不对称碳原子。
10.权利要求9的(R)-1-甲基烷基丙二酸或(S)-1-甲基烷基丙二酸，其中R1为正丙基或正丁基。
11.通式(6)所示光学活性体的制备方法，该方法包括使下述微生物或转化细胞、该微生物或细胞处理物、该微生物或细胞培养液、和/或从该微生物或细胞得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与2-戊酮作用，变换成(S)-2-戊醇，再将所得的(S)-2-戊醇与磺酰化剂反应，变换成下述通式(6)所示的光学活性体， 其中，式(6)中，R4表示正丙基，X表示磺酰基氧基；所述微生物或转化细胞是包含具有与2-戊酮反应、生成(S)-2-戊醇的活性的羰基还原酶的微生物或转化细胞，其在未经溶剂前处理的活菌体与2-戊酮作用时，可生成95％e.e.或以上光学纯度的(S)-2-戊醇，且其产率为10mg(S)-2-戊醇/g干菌体重量/小时或以上。
12.通式(6)所示光学活性体的制备方法，该方法包括使下述微生物或转化细胞、该微生物或细胞处理物、该微生物或细胞培养液、和/或从该微生物或细胞得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与2-己酮作用，变换成(S)-2-己醇，再将所得的(S)-2-己醇与磺酰化剂反应，变换成下述通式(6)所示的光学活性体， 其中，式(6)中，R4表示正丁基，X表示磺酰基氧基；所述微生物或转化细胞是包含具有与2-己酮反应、生成(S)-2-己醇的活性的羰基还原酶的微生物或转化细胞，其在未经溶剂前处理的活菌体与2-己酮作用时，可生成95％e.e.或以上光学纯度的(S)-2-己醇，且其产率为10mg(S)-2-己醇/g干菌体重量/小时或以上。
13.权利要求11或12的方法，该方法还包括在碱存在下，使所得的通式(6)所示的光学活性体与通式(9)所示的碳亲核体反应，变换成下述通式(7)所示的光学活性化合物的步骤 式(9)中，R2和R3各自独立地表示酯基、羧基或氰基，其中R2和R3可一起形成环状结构； 式(7)中，R2和R3与前述含义相同，R4为正丙基或正丁基。
14.(R)-1-甲基丁基丙二酸或(R)-1-甲基戊基丙二酸的制备方法，其特征在于在碱存在下，使由权利要求11或12的方法得到的通式(6)所示的光学活性体与通式(9)所示的碳亲核体反应，变换成下述通式(7)所示的光学活性化合物， 再将所得光学活性化合物水解，变换成下述通式(8)所示的(R)-1-甲基丁基丙二酸或(R)-1-甲基戊基丙二酸， 其中，式(9)中，R2和R3各自独立地表示酯基、羧基或氰基，R2和R3可一起形成环状结构；式(7)中，R2和R3与前述含义相同，R4为正丙基或正丁基；式(8)中，R4与前述含义相同。
15.(R)-3-甲基己酸或(R)-3-甲基庚酸的制备方法，其特征在于在碱存在下，使由权利要求11或12的方法得到的通式(6)所示的光学活性体与通式(9)所示的碳亲核体反应，变换成下述通式(7)所示的光学活性化合物， 再将所得光学活性化合物水解，变换成下述通式(8)所示的(R)-1-甲基丁基丙二酸或(R)-1-甲基戊基丙二酸，然后再将所得(R)-1-甲基丁基丙二酸或(R)-1-甲基戊基丙二酸脱羧， 其中，式(9)中，R2和R3各自独立地表示酯基、羧基或氰基，R2和R3可一起形成环状结构；式(7)中，R2和R3与前述含义相同，R4为正丙基或正丁基；式(8)中，R4与前述含义相同。
全文摘要
本发明的目的在于提供可以以高光学纯度获得(S)－2－戊醇、(S)－2－己醇、1－甲基烷基丙二酸、以及3－甲基羧酸的低成本且高效的工业化制备方法。本发明提供使某种微生物或转化细胞、该微生物或细胞处理物、该微生物或细胞培养液、和/或由该微生物或细胞得到的羰基还原酶组分的粗纯化物或纯化物与2－戊酮或2－己酮作用，制备(S)－2－戊醇或(S)－2－己醇的方法。
文档编号C12P7/04GK1950508SQ200580011980
公开日2007年4月18日 申请日期2005年2月4日 优先权日2004年2月4日
发明者出来岛康方, 川端润, 平冈宏敏, 上田诚, 上原久俊 申请人:株式会社Api