专利名称：脂质生产菌的育种方法及其利用的制作方法
技术领域：
本发明涉及脂质生产菌的育种方法及其利用，特别涉及在被孢霉(Mortierella)属脂质生产菌中利用转化抑制基因表达从而进行脂质生产菌育种的方法及其利用。
背景技术：
一直以来，利用微生物代谢生产有用化合物的技术(广义的发酵技术)不断被开发并得到实际应用。具体而言，例如，可列举能够利用代谢大量生产脂质的脂质生产菌。作为代表性脂质生产菌，可列举高山被孢霉(Mortierellaalpina)等被孢霉属菌类。众所周知，上述被孢霉属菌类生产以花生四烯酸为主的多不饱和脂肪酸(PUFA)，是工业上非常有用的菌类(例如，参考专利文献1)。
人们对包括上述脂质生产菌等微生物在内的各种有用生物进行育种，即，将有用生物的遗传性状改良成更令人满意的性状(品种改良)。特别是在发酵技术中，从提高微生物的化合物生产效率、降低该化合物的制造成本等观点出发，育种非常重要。
育种方法基本上包括制备含有遗传性变异的群体的工序(方便起见，称为群体制备工序)和从该群体中筛选出表现期望性状的品种的工序(方便起见，称为筛选工序)。无论是群体制备工序还是筛选工序，均可根据所要育种的有用生物的种类，采用各种各样的方法，在上述脂质生产菌等微生物的群体制备工序中，主要利用(1)突变处理法和(2)转化法。
(1)突变处理法利用突变处理进行群体制备工序时，用各种各样的方法使微生物产生突变从而制备群体，但突变本身会随机产生多种类型。因此，在之后的筛选工序中即使能获得表现目的性状的品种(株)，也可能使与目的性状相关的基因以外的其他基因产生预料之外的损伤。例如上述脂质生产菌，虽然所生产的脂质的种类改变，但有可能出现增殖和孢子形成能力等下降等。因此，在利用突变处理制备群体的工序中，不一定能获得生产性良好的菌株。
而且在该方法中，如上所述，在形成所得到的群体的个体中，随机产生多种突变。因此，在之后的筛选工序中，当没有合适的筛选方法来获得表现目的性状的突变体(株)时，需对形成上述群体的全部个体的突变种类进行分析，这需要耗费庞大的劳力。
(2)转化法与此相对，利用转化进行群体制备工序时，以所要育种的有用生物为宿主，为了获得目的性状，通过导入必须的DNA片段(转化)，得到转化体的群体。即，制备只控制与目的吻合的特定基因表达的群体。因此，在之后的筛选工序中，只要从得到的转化体中筛选出更令人满意的品种(株)即可，筛选变得容易，还可以避免上述其他基因产生预料之外的损伤。因此，可明显减少育种上花费的劳力。
如上所述，在育种的群体制备工序中，优选转化法。例如，已有诸多关于被孢霉属菌类所属的丝状菌的转化方法的技术报道。
具体而言，(a)非专利文献1～3等中公开了利用颗粒轰击法转化钩巢曲霉(Aspergillus nidulans)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)等丝状菌的技术。在这些技术中，用尿嘧啶缺陷性菌株作为转化的宿主株，同时采用与尿嘧啶缺陷性菌株互补的基因作为标记基因，选择转化株。
另外，(b)作为上述高山被孢霉(M.alpina)的转化方法，已知有非专利文献4中公开的技术。在该技术中，将孢子原生质体化，利用电穿孔法将基因导入细胞内。而且，用来自大肠杆菌的潮霉素B抗性基因(hpt)作为标记基因筛选转化体。这样，可以筛选出转化体，即在含有潮霉素的培养基中能生长的菌株。
另外，将有用生物的遗传性状改良成更令人满意的性状时，有时降低特定基因的功能，或使特定基因的功能缺失。此时，虽然利用上述(1)的突变处理法也可以获得特定基因的功能降低或缺失的突变株，但该突变处理法存在上述不利效果。因此，人们希望开发出这样的育种技术，即利用上述(2)的转化法，更简便切实地培育特定基因的功能降低或特定基因的功能缺失的突变株。
这里，作为获得上述特定基因的功能降低或特定基因的功能缺失的突变株的技术，已知有抑制特定基因表达的技术。众所周知，这些技术有例如RNAi法、利用同源重组使染色体上的基因缺失的方法、共抑制法、反义技术等。特别是同源重组法，已知其效果稳定，而RNAi法是近年来为人所知的方法，已在多种生物中有报道，其效果也非常好。
日本特公平7-34752(公告日平成7(1995)年4月19日、公开公报日本特开昭63-4489
公开日昭和63(1988)年2月25日)[非专利文献1]Fungaro M.H.et al.Fems microbial Lett.，25，293-297，1995[非专利文献2]Herzog R.W.et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.，45，333-337，1996[非专利文献3]Armaleo，D.et al.Curr.Genet.，17，97-103，1990[非专利文献4]Mackenzie D.A.et al.Appl.Environ.Microbiol.，66，4655-4661，2000发明内容但是，没有任何关于在脂质生产菌被孢霉属菌类中抑制特定基因表达的基因表达抑制方法的报道。
另外，例如上述RNAi法，已报道在多种生物中抑制基因表达，但在特定生物中RNAi法是否有效，须实际试验后才清楚。例如，没有关于在脂质生产菌被孢霉属菌类中RNAi法有效这样的报道。
PUFA的大多数是必须脂肪酸，因参与生物体内复杂的生理功能，近年来成为备受关注的重要营养素。于是，人们渴求更高效地生产PUFA的发酵技术，为此，高效且有效地进行可靠性更高的脂质生产菌被孢霉属菌类育种的技术成为必需。
鉴于上述课题完成了本发明，本发明的目的在于提供，抑制特定基因的表达从而有效且高效地进行被孢霉属脂质生产菌育种的育种方法及其利用。
本发明人对上述课题进行了潜心研究，利用RNAi法，获得MAELO基因或Δ12脂肪酸去饱和酶基因的表达受抑制的被孢霉属突变株，对其进行功能解析后，发现该突变株分别是超长链饱和脂肪酸比例减少的菌株，或是生产Mead acid的菌株，从而完成了本发明。
即，本发明作为产业上有用的方法或物质，包含下述1)～15)的发明。
1)被孢霉(Mortierella)属脂质生产菌的育种方法，其包含抑制所述脂质生产菌中特定基因表达的表达抑制工序。
2)根据1)所述的脂质生产菌的育种方法，所述表达抑制工序包含利用RNAi法抑制特定基因表达的RNAi工序。
3)根据2)所述的脂质生产菌的育种方法，所述RNAi工序包含在所述脂质生产菌中导入重组表达载体的转化工序，该重组表达载体表达与所述特定基因具有的碱基序列的全部或部分对应的双链RNA。
4)根据3)所述的脂质生产菌的育种方法，所述RNAi工序还包含构建所述重组表达载体的表达载体构建工序。
5)根据3)或4)所述的脂质生产菌的育种方法，在所述转化工序中，采用电穿孔法或颗粒轰击法。
6)根据1)～5)任意一项所述的脂质生产菌的育种方法，所述脂质生产菌是高山被孢霉(Mortierella alpina)。
7)根据1)～6)任意一项所述的脂质生产菌的育种方法，所述特定基因是脂质代谢基因。
8)根据7)所述的脂质生产菌的育种方法，所述脂质代谢基因是脂肪酸代谢基因。
9)根据8)所述的脂质生产菌的育种方法，所述脂肪酸代谢基因是编码脂肪酸碳链延长酶或脂肪酸去饱和酶的基因。
10)根据9)所述的脂质生产菌的育种方法，所述编码脂肪酸碳链延长酶的基因是GLELO基因或MAELO基因。
11)根据9)所述的脂质生产菌的育种方法，所述编码脂肪酸去饱和酶的基因是编码下述脂肪酸去饱和酶中一种酶的基因Δ5脂肪酸去饱和酶、Δ6脂肪酸去饱和酶、Δ8脂肪酸去饱和酶、Δ9脂肪酸去饱和酶、Δ12脂肪酸去饱和酶、Δ15脂肪酸去饱和酶、Δ17脂肪酸去饱和酶、ω3脂肪酸去饱和酶。
12)育种工具盒(kit)，用于实施上述1)～11)任意一项所述的脂质生产菌的育种方法。
13)根据12)所述的育种工具盒，其包含下述(a)～(d)中至少一种物质(a)重组表达载体，其表达与所述特定基因具有的碱基序列的全部或部分对应的双链RNA；(b)用于构建(a)重组表达载体的试剂类；(c)用于将(a)重组表达载体导入脂质生产菌的试剂类；(d)用于培养脂质生产菌和/或导入了(a)重组表达载体的转化株的试剂类。
14)脂质生产菌，其通过上述1)～13)任意一项所述的脂质生产菌的育种方法或育种工具盒获得。
15)脂质生产方法，其由上述14)所述的脂质生产菌生产含有PUFA的脂质。
具体实施例方式
下面，说明本发明的一个实施方式，但本发明不限于此。
本发明提供，通过实施抑制特定基因特别是参与脂质代谢基因的表达的表达抑制工序从而培育具有期望性状的脂质生产菌的育种方法和该育种方法的利用方法。
下面，分别对作为本发明对象的被孢霉属菌类、本发明所涉及的育种方法及其利用进行详细说明。
被孢霉属菌类作为本发明育种方法对象的被孢霉属菌类，不受特殊限制，可以是归类于被孢霉属的各种丝状菌。被孢霉属被分为Mortierella和Micromucor两个亚属。Mortierella亚属的菌类均生产花生四烯酸等碳原子数为20的脂肪酸，而Micromucor亚属只生产碳原子数18以下的脂肪酸。作为本发明对象的被孢霉属菌类，可以是上述两个亚属中的任何一种。
作为被孢霉属菌类，具体已知有M.alpina、M.elongata、M.exigua、M.hygrophila、M.isabellina、M.turficola、M.gamsii、M.cogitans、M.capitata、M.vinacea等，当然不限于这些。其中，本发明可优选采用作为脂质生产菌而被广泛使用的高山被孢霉(M.alpina)。已知M.alpina在菌体内积累以花生四烯酸(ARA)为主的PUFA，其不仅用于PUFA的生物合成研究，还广泛用于PUFA的工业生产。
对包含上述M.alpina的被孢霉属菌类的获得方法，无特殊限制，可以从财团法人发酵研究所和ATCC(American Type Culture Collection)等微生物等寄存机构获得。或者，如果是进行了专利申请的菌株，可以从独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄存中心获得。另外，还可以使用通过公知的筛选方法从自然环境中获得的被孢霉属未知菌株。
本发明所涉及的脂质生产菌的育种方法本发明所涉及的育种方法，只要是包含上述表达抑制工序的育种方法即可，对其他的工序、材料、条件等无特殊限制。这里所谓的“表达抑制工序”，只要是抑制脂质生产菌中特定基因表达的工序即可，其具体方法等可以利用以往公知的方法，无特殊限制。例如，可以使用通过同源重组使染色体上的基因缺失的方法、共抑制法、反义技术、RNAi法等。其中，特别优选RNAi法，因其方法简便、效果优良等。
即，表达抑制工序优选包含利用RNAi法抑制特定基因表达的RNAi工序。具体而言，在脂质生产菌被孢霉属菌类中，导入引起RNAi的DNA片段，使双链RNA表达，抑制特定基因的表达，进行具有期望性状的脂质生产菌的育种。
进而，本RNAi工序优选包含转化工序、表达载体构建工序。当然，本发明所涉及的脂质生产菌的育种方法还可以包含其他工序。下面，对表达抑制工序中包含的各个工序进行详细说明。
RNAi工序在本发明中进行的RNAi工序，只要是利用RNAi法抑制脂质生产菌中特定基因表达的工序即可，对其他的具体方法、条件、材料等无特殊限制。
这里所谓的“RNAi法”指利用RNAi现象抑制基因表达的方法。“RNAi现象”指当细胞内存在双链RNA(下面，有时称为dsRNA)时，与该RNA杂交的mRNA的降解被促进，结果抑制与该mRNA对应的基因的表达。
即，本RNAi工序只要是在脂质生产菌的细胞内导入dsRNA的工序即可，该dsRNA与对想要抑制表达的任意基因的全部或部分进行编码的碱基序列互补。对导入的RNA的碱基序列、链长等无特殊限制，可以适宜地设定以能够抑制目标基因的表达。此时，可优选利用以往公知的RNAi法。
另外，对将RNA导入脂质生产菌的方法也无特殊限制，可以利用以往公知的RNAi法。作为向细胞导入dsRNA的方法的具体例子，如下述实施例所示，向细胞中导入对引起RNAi的RNA进行编码的质粒DNA(重组表达载体)，使其在细胞内表达，抑制基因。此外还可以列举核糖体法、电穿孔法、微量注射法等。即，本RNAi工序优选包含下述表达载体构建工序、转化工序。
表达载体构建工序在本发明中进行的表达载体构建工序，只要是在被孢霉属菌类(脂质生产菌)中表达与想要抑制表达的规定基因具有的碱基序列的全部或部分对应的双链RNA的重组表达载体的构建工序即可。即，只要是在被孢霉属菌类中使引起RNAi的双链RNA表达的、在启动子的控制下连接有相应序列的DNA的重组表达载体的构建工序即可，无特殊限制。即，通过启动子使编码上述双链RNA的基因表达的重组表达载体的构建工序。
作为“想要抑制表达的基因”，可以是被孢霉属菌类(脂质生产菌)具有的任意基因，其种类可根据目的适宜地选择。关于该想要抑制表达的基因，在下述[2-1-2]栏的转化工序中说明。
作为实施RNAi的重组表达载体的构建方法，可采用以往公知的方法，无特殊限制。例如，可列举下述方法为了使想要抑制表达的基因的正义链和反义链被转录，使通过接头序列等连接的基因盒在宿主细胞内体内转录，通过生成在分子内形成双链的RNA(inverted repeat RNA)，从而抑制与该RNA相应的宿主基因的表达。采用该方法，可以连续地在细胞内产生RNAi，结果可以进一步持续地抑制靶基因的表达。另外，接头序列可有可无，但优选具有接头序列。
具体而言，例如制备这样的结构(RNAi质粒)在宿主细胞内可表达的启动子下游，按顺序插入任意基因的反向cDNA、接头序列、该任意基因的正向cDNA。然后，将该RNAi质粒导入脂质生产菌，通过体内转录，可以生成在分子内形成双链的inverted repeat RNA。
另外，被整合到上述RNAi质粒的反义链的基因和正义链的基因的排列顺序、方向等，只要是在宿主内体内转录生成的RNA作为inverted repeat RNA在分子内形成双链的顺序、方向等即可，不受特殊限制。
另外，所涉及的双链RNA的碱基序列的链长，只要是能高效引起RNAi的链长即可，无特殊限制。而且，当采用与基因的一部分对应的双链RNA时，关于选择哪一部分，可根据其目的适宜地选择。
另外，上述启动子，只要是在被孢霉属菌类(脂质生产菌)中能使编码上述双链RNA的基因有效表达的启动子即可，无特殊限制，可优选使用公知的启动子。例如采用hisH4.1启动子，当然不限于此。
作为上述重组表达载体基体的载体，可采用以往公知的各种载体。例如，可以使用质粒、噬菌体、或黏粒等，可根据导入的宿主细胞(被孢霉属菌类)和导入方法等适宜地选择。具体而言，例如，可列举pBR322、pBR325、pUC系、pBluescript系、pBI系的载体等。
上述重组表达载体，除了含有上述启动子和上述编码双链RNA的基因外，还可以含有其他DNA片段。对该其他DNA片段无特殊限制，可以是终止子、选择标记、增强子、提高翻译效率的碱基序列等。
终止子只要具有转录终止部位的功能即可，无特殊限制，可以是公知的终止子。在上述重组表达载体中，在合适的位置上插入终止子，被导入细胞后，可以防止合成不需要的长转录产物。例如采用trpC终止子，当然不限于此。
作为上述选择标记，例如，可采用与营养缺陷性互补的基因或抗药性基因。上述与营养缺陷性互补的基因的具体例子有与亮氨酸、组氨酸、蛋氨酸、精氨酸、色氨酸、赖氨酸等氨基酸缺陷性互补的基因；与尿嘧啶、腺嘌呤等核酸碱基缺陷性互补的基因；与维生素缺陷性互补的基因等。这样，通过选择在缺失上述特定营养素的培养基(不含特定营养素的培养基)中生长的转化株，即可容易地筛选出导入了上述重组表达载体的转化株。另外，所述抗药性基因的具体例子有针对氨苄青霉素、潮霉素、博莱霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素等的抗药性基因。这样，通过选择在含有上述抗生素的培养基中生长的转化株，即可容易地筛选出导入了上述重组表达载体的转化株。
另外，增强子只要是一条脱氧核糖核酸(DNA)链上的、即在顺式位置上的、促进邻近基因转录起始的DNA上的碱基序列部分即可。例如，可将猴病毒simianvirus 40(SV 40)复制起始位点附近存在的72碱基的重复序列作为增强子利用。除此以外，还可以采用以往公知的增强子序列。若采用上述增强子，即使只有启动子区域时目标基因的表达较弱的情况下，也能提高转录活性。如上所述，根据其目的和导入的细胞等的种类，可在上述重组表达载体中插入各种各样的DNA片段。
对上述重组表达载体的构建方法无特殊限制，可以在所选的合适的基体即载体中，按照规定的顺序导入上述启动子、上述编码双链RNA的基因、以及根据需要导入的其他DNA片段。例如，可以将上述编码双链RNA的基因与启动子(根据需要可以是增强子、终止子等)连接构建表达盒，将其导入载体。
表达盒的构建，例如，使各DNA片段的切割位点为互补的突出末端，用连接酶使其反应，从而可以规定该DNA片段的顺序。另外，当表达盒中含有终止子时，可以从上游开始，依次为上述启动子、上述编码双链RNA的基因、终止子的顺序。而当表达盒中含有增强子时，可以从上游开始，依次为上述启动子、增强子、上述编码双链RNA的基因的顺序。此外，对用于构建重组表达载体的试剂类即限制酶和连接酶等的种类，无特殊限制，选择合适的市售品使用即可。
另外，对上述重组表达载体的扩增(增殖)方法(生产方法)无特殊限制，可采用以往公知的方法。通常以大肠杆菌为宿主，使其在该大肠杆菌内增殖即可。此时，可以根据载体的种类，选择理想的大肠杆菌种类。
转化工序在本发明中进行的转化工序，只要是在上述脂质生产菌中导入重组表达载体即可，该重组表达载体表达与上述特定基因具有的碱基序列的全部或部分对应的双链RNA。对其他的具体工序、条件、材料等无特殊限制。即，只要是将在上述表达载体构建工序中构建的重组表达载体导入上述脂质生产菌(转化)的工序即可。
另外，通过实施本工序，在上述脂质生产菌中，可以大量表达与想要抑制表达的目标基因的全部或部分对应的双链RNA。因此，在被转化的脂质生产菌中，引起RNAi，该目标基因的表达被高效抑制。
作为上述“想要抑制表达的基因”，可以是上述被孢霉属菌类(脂质生产菌)具有的任意基因，其种类可根据目的适宜地选择。例如，因被孢霉属菌类作为脂质生产菌使用的情况较多，所以优选利用RNAi抑制脂质代谢基因(参与脂质代谢的基因)的表达。在脂质代谢基因中，更优选脂肪酸代谢基因，特别优选编码脂肪酸碳链延长酶或脂肪酸去饱和酶的基因。这里，作为编码“脂肪酸碳链延长酶”的基因，例如，可列举GLELO基因(GB accession No.AF206662)和MAELO基因(GB accession No.AF268031)。另外，作为编码“脂肪酸去饱和酶”的基因，例如，可列举Δ5脂肪酸去饱和酶基因(GB accession No.AY464949、AF067654、AF054824)、Δ6脂肪酸去饱和酶基因(GB accession No.AB070557、AB070556、AB070555、AF307940、AF110510、AB020032)、Δ8脂肪酸去饱和酶基因、Δ9脂肪酸去饱和酶基因(GB accession No.AJ278339、AF085500、Y18554、Y18553、AB015612、ABO15611)、Δ12脂肪酸去饱和酶基因(GB accession No.AF417244、AF110509、AB020033、Eur.J.Biochem.261，812-820(1999))、Δ15脂肪酸去饱和酶基因、Δ17脂肪酸去饱和酶基因、ω3脂肪酸去饱和酶基因等。因为抑制上述参与脂质代谢的基因的表达，即可增加或减少目标脂质的生产量。而且，还可以改变所生产的脂质的种类或改变脂质的组成。
作为上述参与脂质代谢的基因，例如，在下述实施例中使用MAELO基因、Δ12脂肪酸去饱和酶基因。
已知MAELO基因具有作用于γ-亚麻酸(GLA，18:0n-6)生成二均-γ-亚麻酸(DGLA，20:3n-6)的活性，尽管活性微弱(参考日本特表2002-523098号公报)。但是，作为对上述反应作出主要贡献的基因，已分离出GLELO基因。因此，考虑MAELO基因具有其他功能。另一方面，GenBank的注释为催化饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的碳链延长反应。但尚不清楚在被孢霉属菌类(脂质生产菌)特别是高山被孢霉(M.alpina)中MAELO基因所具有的功能。因此，需要解析M.alpina中的MAELO基因的功能。
于是，如下述实施例所示，本发明人利用酵母解析M.alpina中MAELO基因的功能。其结果提示，MAELO基因催化超长链饱和脂肪酸的碳链延长反应。进而，本发明人又在M.alpina中利用RNAi法抑制MAELO基因的表达，结果获得了超长链饱和脂肪酸在脂质中所占比例减少的菌株。这些结果首次表明，M.alpina中的MAELO基因参与超长链饱和脂肪酸的生物合成体系。
另外，Δ12脂肪酸去饱和酶基因是催化油酸(18:1)转变成亚油酸(18:2)反应的酶的编码基因。因此，如下述实施例所示，利用RNAi法抑制本基因表达，即可获得Mead acid等ω9系脂肪酸的比例上升的菌株(突变株)。
另外，即使没有特定的“想要抑制表达的基因”，也可以采用本发明。例如，只知道功能未知的EST的碱基序列时，构建编码与该EST对应的双链RNA的表达载体，用该表达载体得到转化株，通过该转化株的功能解析，可以解析具有上述EST的基因的功能。这样，利用本发明所涉及的育种方法，可以推断功能未知的基因的功能。
另外，对本发明转化工序中使用的转化方法(基因导入方法)也无特殊限制，可以优选采用电穿孔法、颗粒轰击法等以往公知的方法。例如被孢霉属菌类，当采用电穿孔法时，优选先将菌体原生质体化。另外，作为上述颗粒轰击法的具体例子之一，可列举基因枪法，当然不限于此。在下述实施例中，采用颗粒轰击法进行转化。
其他工序、其他方法关于本发明所涉及的育种方法，可以包含上述转化工序和上述重组表达载体构建工序，还可以包含其他工序。具体而言，可列举从转化后的脂质生产菌群中筛选出合适的转化株的筛选工序等。
对筛选方法无特殊限制，在转化株培养·育成后，可以将规定的遗传性状作为指标进行筛选。即，对筛选工序的具体方法无特殊限制，可以根据育种的目的，设定能够筛选出具有令人满意性状的转化株的条件，用公知的方法筛选令人满意的转化株。例如，可以采用以往公知的营养缺陷性标记或抗药性标记进行筛选。
另外，本发明的主旨在于提供，抑制被孢霉属菌类(脂质生产菌)中规定基因的表达从而培育出具有期望性状的新菌株的育种方法，而不在于本专利申请书中具体所述的各个转化操作、培养操作以及筛选操作。因此，必须注意的是，采用了上述各操作以外的其他操作的育种方法也属于本发明的范围。
本发明的利用[3-1]脂质生产菌(新品种)如上所述，本发明所涉及的脂质生产菌的育种方法，抑制特定基因的表达，获得具有更令人满意性状的品种。因此，以被孢霉属脂质生产菌为原种，能够高效且有效地生产新品种(新菌株)。被孢霉属菌类作为脂质生产菌广为人知，其还包含M.alpina这样可靠性高的菌类，因此，例如，能容易且高效地生产脂质生产性更高的菌株。
另外，采用本发明所涉及的育种方法，能抑制进行转化的脂质生产菌中任意基因的表达。因此，在本发明中，能抑制原种被孢霉属菌类中特定基因的表达，能获得脂质生产量增加、可生产的脂质的种类改变、组成改变等的转化株(转化体)即新菌株。即，本发明包含用上述育种方法制备的脂质生产菌。
此外，在本发明中，从原种被孢霉属菌类中获取适当的DNA片段(cDNA片段、EST等)，利用编码与其对应的双链RNA的表达载体，引起RNAi，从而可以获得该DNA片段全长基因的表达受到抑制的转化株。通过对该转化株进行功能解析，能推断功能未知的基因的功能。即，本发明可用于功能未知基因的功能推断方法中。
如上所述，用本发明的育种方法得到的转化株非常有用，这些用本发明的育种方法得到的转化株也属于本发明。除此以外，作为本发明的利用，例如，可列举用于实施本发明的育种工具盒。下面，对该育种工具盒进行说明。
育种工具盒本发明所涉及的育种工具盒，只要是用于实施上述[2]栏中所述的育种方法的育种工具盒即可，对其中包含的具体构成、材料、仪器等无特殊限制。具体而言，只要包含用于实施上述育种方法的各个工序的物质即可。
例如，为了实施上述转化工序，可列举(a)重组表达载体，其表达与上述特定基因具有的碱基序列的全部或部分对应的双链RNA。另外，为了实施上述表达载体构建工序，可列举(b)用于构建(a)重组表达载体的试剂类。此外，为了实施转化工序，可列举(c)用于将(a)重组表达载体导入脂质生产菌的试剂类。而且，还可以包含(d)用于培养脂质生产菌和/或导入了(a)重组表达载体的转化株的试剂类。
本专利申请书中所谓的“试剂类”，包含各种试剂和实验器具、仪器等。例如，作为转化用的试剂类，可以利用以往公知的试剂，对其具体构成无特殊限制，例如，可列举与转化的种类相适应的酶、缓冲液等。此外，根据需要可以附加微量离心管等实验器材，也可以包含感受态细胞制作用试剂、微量恒温仪等仪器。除这些之外，例如，还可以列举用于实施表达载体构建工序的各种材料(作为基体的载体、限制酶等)、各种试剂、实验器具、检测仪器等。
采用上述构成的育种工具盒，可以简便且切实地实施本发明所涉及的育种方法。另外，本发明的育种工具盒，是用于实施本发明所涉及的育种方法的育种工具盒，因此，用本发明的育种工具盒得到的脂质生产菌新品种自然也包含在本发明中。
脂质生产方法、以及用该生产方法得到的脂质本发明所涉及的脂质生产方法，只要是由上述[3-1]栏中所述的脂质生产菌生产含有PUFA的脂质的方法即可。例如，通过培养上述脂质生产菌，能够简便地生产含有PUFA的脂质。
下面，对被孢霉属菌类所生产的脂质进行说明。
被孢霉属菌类所生产的有用产物之一为含有PUFA的脂质，已知PUFA生产性高的野生株除大量生成以花生四烯酸为主的ω6系PUFA外，还生成副产物超长链饱和脂肪酸(VLSA)(Higashiyama K.et al.J.Am.Oil Chem.Soc.，75，1501-1505，1998)。这里所谓的ω6系PUFA指，碳原子数18以上且具有2个以上双键、从未端甲基碳原子开始数的第6位碳原子上存在末端甲基侧第一个双键的脂肪酸。作为被孢霉属菌类中含有的主要ω6系PUFA，可列举亚油酸、γ-亚麻酸、二均-γ-亚麻酸、花生四烯酸等。
另外，这里所谓的VLSA指，碳原子数20以上且不含双键的饱和脂肪酸。作为被孢霉属菌类中含有的主要VLSA，可列举二十烷酸(花生酸)、二十二烷酸(山嵛酸)、二十四烷酸(木蜡酸)、二十六烷酸(蜡酸)等。这些VLSA由ω6系PUFA的前体即硬脂酸生物合成，因此，如果将以花生四烯酸为主的ω6系PUFA的生物合成路径作为中心，则VLSA生物合成路径可认为是其副路径。
另外，饱和脂肪酸与相同碳原子数的不饱和脂肪酸相比，其熔点明显高。以碳原子数为18的脂肪酸为例进行比较，饱和脂肪酸硬脂酸的熔点为69.6℃，与此相对，单不饱和脂肪酸油酸的熔点为13.4℃，双不饱和脂肪酸亚油酸的熔点为-5.2℃。而且，碳链越长熔点越高，因此VLSA的熔点非常高。二十二烷酸(山嵛酸)、二十四烷酸(木蜡酸)、二十六烷酸(蜡酸)的熔点分别为79.9℃、84.2℃、87.7℃。甘油三酯等脂质的熔点受构成脂肪酸的熔点的影响最大，因此，含有大量VLSA的油脂的熔点通常较高，常温下为固体，低温保管时因析出而浑浊或结块。作为分离除去固体脂形成液体油的方法，一般采用冬化法(winterizing)、乳化分提法(emulsification fractionation)等工艺(《油脂·油料手册》幸书房(1988)P261)。在被孢霉属菌类所生产的油脂中，含有数个百分比的VLSA，虽然根据培养条件不同而有所变动。
但是，将上述脂质用于食用时，大多数情况下优选即使低温条件也呈稳定的透明度高的液状。为了得到这样的脂质，虽然利用上述冬化法、乳化分提法等可以分离除去固体脂，但因工艺复杂，所以制造所需时间和成本增加。
又因为进入脂质生物合成的副路径即VLSA生物合成路径，所以存在目的PUFA的生产性难以提高的问题。
另外，由PUFA生产性高的野生株所生成的PUFA，几乎都是以花生四烯酸为主的ω6系PUFA。已知用突变处理获得了各种各样突变株，也已知有许多所生成的PUFA的种类被改变的突变株。通过对这些突变株进行解析得知，例如，通过使Δ12去饱和酶活性缺失或下降，积累Mead acid，通过使Δ5去饱和酶活性缺失或下降，积累二均-γ-亚麻酸。
如上所述，利用突变处理可以改变PUFA的种类，但不能获得在生产PUFA的野生株具有的基因中与目的性状相关的基因以外的基因不受损伤的菌株。
但是，通过采用本发明所涉及的脂质生产方法，可以解决上述问题。即，采用本发明所涉及的脂质生产方法，通过减少易形成固体脂的含有VLSA的脂质的量，不需要进行冬化法、乳化分提法等花时间和成本的工艺，即可制造适于食用的液体油。
另外，由于抑制进入副路径即VLSA生物合成路径，从而可以提高目的PUFA的生产性。而且，还可以获得与目的性状相关的基因以外的基因不受损伤的PUFA生产株。
另外，本发明还包含用上述脂质生产方法生产的脂质。所述脂质优选构成总脂肪酸中ω9系PUFA所占比例为8％以上的脂质，更优选8.8％以上，进一步优选9.4％以上。
另外，优选Mead acid的比例为1.3％以上的脂质，更优选1.6％以上。
此外，优选构成总脂肪酸中花生四烯酸所占比例为10％以上且超长链饱和脂肪酸的比例为0.1％以下的脂质。进一步优选花生四烯酸的比例为20％以上且超长链饱和脂肪酸的比例为0.1％以下的脂质。
即，本发明可以包含下述脂质。
·用上述脂质生产方法生产的脂质，构成该脂质的总脂肪酸中ω9系PUFA所占的比例为8％以上。
·用上述脂质生产方法生产的脂质，构成该脂质的总脂肪酸中Mead acid所占的比例为1.3％以上。
·用上述脂质生产方法生产的脂质，构成该脂质的总脂肪酸中花生四烯酸所占的比例为10％以上，且构成该脂质的总脂肪酸中超长链饱和脂肪酸所占的比例为0.1％以下。
下面，列举实施例，更详细地说明本发明的实施方式。当然，本发明不限于下述实施例，细节上可以有各种形态。而且，本发明不限于上述实施方式，在权利要求项所示的范围内，可以有各种变更，将各种已公开的技术手段适宜组合所得的实施方式也包含在本发明的技术范围内。
(实施例A)MAELO基因的功能解析按照下述方法，制备用于使MAELO基因在酵母中表达的质粒。
将M.alpina在GY培养基(2％葡萄糖、1％酵母提取物、pH调至6.0)中培养5日，用RNeasy plant mini kit(QIAGEN)提取总RNA。用SuperScriptFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)、oligo-dT引物，对1μg总RNA进行逆转录反应，合成cDNA。合成的cDNA中，以1μg为模板，用引物MAELO-H1和引物MAELO-S1和Ex Taq(TAKARABIO)进行PCR。将得到的PCR产物用限制酶HindIII和限制酶SpeI酶解，将约950bp的DNA片段连接于经限制酶HindIII和限制酶XbaI酶解后的载体pYES2(Invitrogen)，构建质粒pY2MEL。
MAELO-H15’-gcaagcttatggccgccgcaatcttggac-3’(序列号15)MAELO-S15’-gcactagtttagatgtgcttgctgttggag-3’(序列号16)利用质粒pY2MEL，转化S.cerevisiae INVSc1株，筛选出在不含尿嘧啶的平板(葡萄糖2％、Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate(Difco公司制)0.17％、硫酸铵0.5％、组氨酸20mg/l、亮氨酸60mg/l、色氨酸40mg/l、细菌琼脂(Bacto agar)2％)上生长的菌株，作为转化株。将1接种环转化株植菌到含有棉子糖2％、Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids andAmmonium Sulfate(Difco公司制)0.17％、硫酸铵0.5％、表面活性剂NP-40 1％、组氨酸20mg/l、亮氨酸60mg/l、色氨酸40mg/l、硬脂酸(18:0)0.05％的培养基中，振荡培养6小时。接着，为了诱导质粒pY2MEL上连接于GAL1启动子下游的MAELO基因的表达，加入2％(W/V)半乳糖，然后于28℃振荡培养42小时。通过离心分离收集菌体，冷冻干燥后，利用盐酸甲醇法，将菌体内的脂肪酸残基甲酯化后，用己烷提取，将馏去己烷后得到的脂肪酸甲酯用气相色谱法分析。单位培养液中超长链饱和脂肪酸的生成量如表1所示。
如上述表1所示，与作为对照的pYES2导入株相比，pY2MEL导入株中超长链饱和脂肪酸22:0、24:0、26:0增加。该结果提示，MAELO基因具有超长链饱和脂肪酸的碳链延长活性。
(实施例B)MAELO基因的表达抑制株的育种按照下述方法，构建使与MAELO基因的一部分对应的双链RNA过度表达的质粒。
将质粒pBluescriptIISK+用限制酶SpeI和BamHI酶解，用DNA blunting Kit(TAKARABIO)将末端平滑化后，通过自连，构建质粒pBluescriptIISK+(BamHI-)。接着，以质粒pD4(文献D.A.Mackenzie et al.Appl.Environ.Microbiol.，66，4655-4664，2000)为模板，用引物HisProFX和引物TrpCRX，用LA Taq(TAKARABIO)进行PCR。反应条件为，以94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 2分钟为1个循环，进行30个循环。将被扩增的DNA片段用限制酶EcoRI酶解，将得到的DNA片段插入质粒pBluescriptIISK+(BamHI-)的EcoRI位点，构建质粒pBlueHpt。
HisProFX；5’-tacgaattcaagcgaaagagagattatgaa-3’(序列号1)TrpCRX；5’-gaagaattccctctaaacaagtgtacctgt-3’(序列号2)将M.alpina在GY液体培养基(2％葡萄糖、1％酵母提取物、pH调至6.0)中于28℃培养5日，按照文献(E.Sakuradani et al.Eur J.Biochem.，260，208-216，1999)记载的方法，从得到的菌体中制备基因组DNA。
以M.alpina的基因组DNA为模板，用引物MAELORNAi1-1和引物MAELORNAi3-1，用LA Taq(TAKARABIO)进行PCR。反应条件为，以94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟为1个循环，进行30个循环。将这样扩增得到的约0.9kb的DNA片段TA克隆到载体pTBlueT-Vector(TAKARABIO)中。确定碱基序列后，用限制酶NcoI和BamHI酶解，将得到的约0.9kb的DNA片段插入质粒pBlueHpt的NcoI-BamHI位点，构建质粒pBlueMEi3。
MAELORNAi1-1；5’-ctggatcctatggccgccgcaatcttggaca-3’(序列号3)MAELORNAi3-1；5’-aaccatggtcatccctaggtggaagtaatg-3’(序列号4)以M.alpina的基因组DNA为模板，用引物MAELORNAi1和引物MAELORNAi5，用LA Taq(TAKARABIO)，进行PCR。反应条件为，以94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟为1个循环，进行30个循环。将这样扩增得到的约0.7kb的DNA片段TA克隆到载体pTBlueT-Vector(TAKARABIO)中。确定碱基序列后，用限制酶NcoI和BlnI酶解，将得到的约0.7kb的DNA片段插入质粒pBlueMEi3的NcoI-BlnI位点，构建质粒pBlueMEi5。
MAELORNAi1；5’-ttggatccatggccgccgcaatcttggaca-3’(序列号5)MAERORNAi5；5’-tgatctcctaggtggaacactgatagccac-3’(序列号6)将质粒pBlueMEi5经限制酶EcoRI酶解得到的约3.3kb的片段插入质粒pDura5的EcoRI位点，构建质粒pDura5MEi51。
以M.alpina的基因组DNA为模板，用引物MAELORNAi1-1和引物MAELORNAi2，用LA Taq(TAKARABIO)，进行PCR。PCR以94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟为1个循环，进行30个循环的反应。将这样扩增得到的约0.7kb的DNA片段TA克隆到载体pT7Blue T-Vector(TAKARABIO)中。确定碱基序列后，用限制酶NcoI和BamHI酶解，将得到的约0.7kb的DNA片段插入质粒pBlueHpt的NcoI-BamHI位点，构建质粒pBlueMEi2。
MAELORNAi2；5’-tgccatggggaaatatgccctaggccatgc-3’(序列号17)接着，以M.alpina的基因组DNA为模板，用引物MAELORNAi1和引物MAELORNAi4，用LA Taq(TAKARABIO)，进行PCR。PCR以94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟为1个循环，进行30个循环的反应。将这样扩增得到的约0.5kb的DNA片段TA克隆到载体pT7Blue T-Vector(TAKARABIO)中。确定碱基序列后，用限制酶NcoI和BlnI酶解，将得到的约0.5kb的DNA片段插入质粒pBlueMEi2的NcoI-BlnI位点，构建质粒pBlueMEi4。
MAELORNAi4；5’-cacttacctaggggcttcttcttgagg-3’(序列号18)将质粒pBlueMEi4经限制酶EcoRI酶解后得到的约2.9kb的片段插入质粒pDura5的EcoRI位点，构建质粒pDura5Mei41。质粒pDura5Mei51可以使与约700bp的MAELO基因对应的双链RNA过度表达，质粒pDura5Mei41可以使与约500bp的MAELO基因对应的双链RNA过度表达。
利用质粒pDura5MEi51或质粒pDura5Mei41，以M.alpinaΔura-1株(Δura5)为宿主，利用颗粒轰击法进行转化。选择转化株时，采用SC琼脂培养基(Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate(Difco公司制)5.0g、(NH4)2SO41.7g、葡萄糖20g、腺嘌呤20mg、酪氨酸30mg、蛋氨酸1.0mg、精氨酸2.0mg、组氨酸2.0mg、赖氨酸4.0mg、色氨酸4.0mg、苏氨酸5.0mg、异亮氨酸6.0mg、亮氨酸6.0mg、苯丙氨酸6.0mg、琼脂20g/l)。
将分别得到的数十株转化株继续植入GY培养基中，各筛选出2株稳定保留标记基因即ura5基因的菌株。另外，将利用pDura5Mei51得到的转化株记为#1和#2，将利用pDura5Mei41得到的转化株记为#3和#4。转化株#1和#2使与约700bp的MAELO基因对应的双链RNA表达，转化株#3和#4使与约500bp的MAELO基因对应的双链RNA表达。用PCR确定上述#1～#4转化株中是否已导入基因。即，利用各转化株，制备基因组DNA，以基因组DNA为模板，用以下所示的引物RDNA1及引物RDNA2和EX Taq(TAKARABIO)，进行PCR。此时的反应条件为，以94℃ 1分钟、54℃ 1分钟、72℃ 1分钟为1个循环，进行35个循环。其结果为，在作为宿主的Δura-1株中没有发现DNA片段的扩增，与此相对，在任一转化株#1～#4中均有约1.5kb的DNA片段的扩增。由此证实，在上述转化株#1～#4的18SrDNA区域与质粒pDura5MEi51或pDura5Mei41发生重组，DNA片段被导入。
引物RDNA1；5’-acaggtacacttgtttagag-3’(序列号7)引物RDNA2；5’-cgctgcgttcttcatcgatg-3’(序列号8)将上述转化株植菌到装有10ml GY液体培养基的试管中，于28℃振荡培养12日，过滤收集菌体。
取菌体的一部分，用RNeasy plant mini kit(QIAGEN)提取总RNA。用SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)，以6碱基随机引物为引物，对1μg总RNA进行逆转录反应，合成cDNA。合成的cDNA中，以1μl为模板，用引物MAELO-1和引物MAELO-2和EX Taq(TAKARABIO)进行PCR。此时的反应条件为，以94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟为1个循环，进行20个循环。
引物MAELO-1；5’-agtccatcgactccttcgtcttcca-3’(序列号9)引物MAELO-2；5’-cggtgtcagccaactcccagtactt-3’(序列号10)将得到的PCR产物进行电泳，比较约340bp片段条带的荧光强度。其结果为，在作为宿主的Δura-1株中证实有明显的条带，与此相对，在任一转化株#1～#4中均没有发现条带。由此证实，在转化株#1～#4中，MAELO基因的mRNA表达被抑制。将剩余的菌体干燥，利用盐酸甲醇法，将菌体内的脂肪酸残基甲酯化后，用己烷提取，将馏去己烷后得到的脂肪酸甲酯用气相色谱法分析。其结果如下述表2所示。
其结果如上述表2所示，转化株中超长链饱和脂肪酸的比例明显降低。具体而言，#1、#2中超长链饱和脂肪酸的生成几乎完全被抑制，#3、#4中超长链饱和脂肪酸的生成一部分被抑制。
(实施例C)Δ12脂肪酸去饱和酶基因的表达抑制株的育种为了使与Δ12脂肪酸去饱和酶基因的一部分对应的双链RNA过度表达，构建以下载体。
以质粒pMOD10(Eur.J.Biochem.261，812-820(1999))为模板，用引物Δ12-1和引物Δ12-2以及LA Taq(TAKARABIO)进行PCR，扩增约670bp的DNA片段。此时的反应条件为，以94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟为1个循环，进行30个循环。
引物Δ12-1；5’-gcggatccatggcacctcccaacacta-3’(序列号11)引物Δ12-2；5’-agaggccttcataataaggtacgcaggc-3’(序列号12)将扩增得到的DNA片段用限制酶BamHI以及StuI酶解，与质粒pMOD10经BamHI以及MscI酶解得到的约3.7kb的片段用ligation high(东洋纺)连接，得到质粒pBΔ12RNAi。接着，将质粒pBΔ12RNAi用限制酶EcoRI酶解，用DNAblunting kit(TAKARABIO)将末端平滑化后，用限制酶BamHI酶解，得到约1.1kb的片段。另一方面，将质粒pBlueHpt用限制酶NcoI酶解，用DNA blunting kit(TAKARABIO)将末端平滑化后，用限制酶BamHI酶解，得到约4.7kb的DNA片段。将上述两个片段用ligation high(东洋纺)连接，得到质粒pBlueΔ12RNAi。将其经限制酶EcoRI酶解得到的2.8kb的DNA片段插入质粒pDura5的EcoRI位点，得到质粒pDura5Δ12RNAi。
利用质粒pDura5Δ12RNAi，将M.alpinaΔura-1株用颗粒轰击法转化。转化株的选择在SC琼脂培养基中进行，将可以生长的菌株作为转化株。将得到的数十株转化株继续植入GY培养基中，选择稳定地保留标记基因即ura5基因的菌株。以按照上述方法筛选的菌株中的3株(转化株#5～#7)为对象，按照与上述实施例B同样的方法，确定导入的质粒pDura5Δ12RNAi是否通过与染色体上18SrDNA区域重组而被插入染色体。在装有转化株SC液体培养基500ml的烧瓶中，于28℃培养5日。另外，培养作为对照的宿主Δura-1株时，在SC液体培养基中加入尿嘧啶(50mg/l)。
利用得到的菌体的一部分，按照与上述实施例B同样的方法合成cDNA，用引物Δ12-3和引物Δ12-4和Ex Taq(TAKARABIO)进行PCR。此时的反应条件为，以94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟为1个循环，进行20个循环。
引物Δ12-3；5’-ttgctattgatctgacctgggcctc-3’(序列号13)引物Δ12-4；5’-tgggaacaaagacctggtccttgg-3’(序列号14)将得到的PCR产物进行电泳，比较约310bp片段条带的荧光强度。其结果为，在作为宿主的Δura-1株中发现明显的条带，与此相对，在任一转化株#5～#7中没有发现条带。由此证实，在转化株#5～#7中，Δ12脂肪酸去饱和酶基因的mRNA的表达被抑制。
另外，按照与上述实施例B同样的方法，进行菌体的脂肪酸分析。其结果如下述表3所示。
表3表明，在转化株中，ω6系PUFA的比例降低，ω9系PUFA的比例明显增加。特别是Mead acid，在Δura-1株中完全不存在，而在转化株中大量积累。即，通过抑制Δ12脂肪酸去饱和酶基因的表达，可以使其具有生产以Mead acid为主的ω9系PUFA的生产能力。
采用本发明所涉及的脂质生产菌的育种方法，可以获得特定基因的表达被抑制的被孢霉属脂质生产菌的突变株。即，以被孢霉属脂质生产菌为原种，可以高效且有效地生产具有期望性状的新品种(新菌株)。
另外，本发明还因为能自身克隆，所以从原种被孢霉属菌中获得合适的DNA片段，通过实施RNAi法，可以抑制特定基因的表达，可以获得脂质生产量增加、可生产的脂质的种类改变、脂质组成改变等转化株(转化体)即新菌株。
被孢霉属菌类作为脂质生产菌广为人知，其还包含M.alpina这样可靠性高的菌类。因此，采用本发明，例如，可以容易且高效地生产脂质生产性更高的菌株、脂质组成改变的菌株、特定脂质的生产提高的菌株等。
如上所述，本发明所涉及的脂质生产菌的育种方法，可以高效且有效地进行被孢霉属脂质生产菌的育种。因此，本发明可以在利用被孢霉属菌类的各种发酵技术相关产业和利用该发酵技术的食品产业、医药品产业等中应用。
序列表序列表(SEQUENCE LISTING)<110>三得利公司(SUNTORY LIMITED)<120>脂质生产菌的育种方法及其利用(CULTIVATION METHOD OF LIPID PRODUCING FUNGI AND USE OF SUCH A METHOD)<130>P160307<150>JP 2004-107512<151>2004-3-31<160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述HisProFX(Description of Artificial SequenceHisProFX)<400>1tacgaattca agcgaaagag agattatgaa 30
<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述TrpCRX(Description of Artificial SequenceTrpCRX)<400>2gaagaattcc ctctaaacaa gtgtacctgt 30<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述MAELORNAi1-1(Description of Artificial SequenceMAELORNAi1-1)<400>3ctggatccta tggccgccgc aatcttggac a 31<210>4
<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述MAELORNAi3(Description of Artificial SequenceMAELORNAi3)<400>4aaccatggtc atccctaggt ggaagtaatg 30<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述MAELORNAil(Description of Artificial SequenceMAELORNAi1)<400>5ttggatccat ggccgccgca atcttggaca 30<210>6<211>30<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述MAELORNAi5(Description of Artificial SequenceMAELORNAi5)<400>6tgatctccta ggtggaacac tgatagccac 30<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述RDNA1(Description of Artificial SequenceRDNA1)<400>7acaggtacac ttgtttagag20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人工序列的描述RDNA2(Description of Artificial SequenceRDNA2)<400>8cgctgcgttc ttcatcgatg20<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述MAELO-1(Description of Artificial SequenceMAELO-1)<400>9agtccatcga ctccttcgtc ttcca 25<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述MAELO-2
(Description of Artificial SequenceMAELO-2)<400>10cggtgtcagc caactcccag tactt 25<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述d12-1(Description of Artificial Sequenced12-1)<400>11gcggatccat ggcacctccc aacacta27<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述d12-2(Description of Artificial Sequenced12-2)
<400>12agaggccttc ataataaggt acgcaggc 28<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述d12-3(Description of Artificial Sequenced12-3)<400>13ttgctattga tctgacctgg gcctc 25<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述d12-4(Description of Artificial Sequenced12-4)<400>14tgggaacaaa gacctggtcc ttgg 24
<210>15<211>29<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述引物MAELO-H1(Description of Artificial SequencePrimerMAELO-H1)<400>15gcaagcttat ggccgccgca atcttggac 29<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述引物MAELO-S1(Description of Artificial SequencePrimerMAELO-S1)<400>16gcactagttt agatgtgctt gctgttggag 30
<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述引物MAELORNAi3(Description of Artificial SequencePrimerMAELORNAi3)<400>17tgccatgggg aaatatgccc taggccatgc 30<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>人工序列的描述引物MAELORNAi4(Description of Artificial SequencePrimerMAELORNAi4)<400>18cacttaccta ggggcttctt cttgagg2权利要求
1.脂质生产菌的育种方法，其是被孢霉(Mortierella)属脂质生产菌的育种方法，其特征在于包含抑制所述脂质生产菌中特定基因表达的表达抑制工序。
2.根据权利要求1所述的脂质生产菌的育种方法，其特征在于所述表达抑制工序包含利用RNAi法抑制特定基因表达的RNAi工序。
3.根据权利要求2所述的脂质生产菌的育种方法，其特征在于所述RNAi工序包含在所述脂质生产菌中导入重组表达载体的转化工序，该重组表达载体表达与所述特定基因具有的碱基序列的全部或部分对应的双链RNA。
4.根据权利要求3所述的脂质生产菌的育种方法，其特征在于所述RNAi工序还包含构建所述重组表达载体的表达载体构建工序。
5.根据权利要求3或4所述的脂质生产菌的育种方法，其特征在于所述转化工序中采用电穿孔法或颗粒轰击法。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的脂质生产菌的育种方法，其特征在于所述脂质生产菌是高山被孢霉(Mortierella alpina)。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的脂质生产菌的育种方法，其特征在于所述特定基因是脂质代谢基因。
8.根据权利要求7所述的脂质生产菌的育种方法，其特征在于所述脂质代谢基因是脂肪酸代谢基因。
9.根据权利要求8所述的脂质生产菌的育种方法，其特征在于所述脂肪酸代谢基因是编码脂肪酸碳链延长酶或脂肪酸去饱和酶的基因。
10.根据权利要求9所述的脂质生产菌的育种方法，其特征在于所述编码脂肪酸碳链延长酶的基因是GLELO基因或MAELO基因。
11.根据权利要求9所述的脂质生产菌的育种方法，其特征在于所述编码脂肪酸去饱和酶的基因是编码下述脂肪酸去饱和酶中一种酶的基因Δ5脂肪酸去饱和酶、Δ6脂肪酸去饱和酶、Δ8脂肪酸去饱和酶、Δ9脂肪酸去饱和酶、Δ12脂肪酸去饱和酶、Δ15脂肪酸去饱和酶、Δ17脂肪酸去饱和酶、ω3脂肪酸去饱和酶。
12.育种工具盒，其是用于实施权利要求1～11任意一项所述的脂质生产菌育种方法的育种工具盒。
13.根据权利要求12所述的育种工具盒，其特征在于所述育种工具盒包含下述(a)～(d)中至少一种物质(a)重组表达载体，其表达与所述特定基因具有的碱基序列的全部或部分对应的双链RNA；(b)用于构建(a)重组表达载体的试剂类；(c)用于将(a)重组表达载体导入脂质生产菌的试剂类；(d)用于培养脂质生产菌和/或导入了(a)重组表达载体的转化株的试剂类。
14.脂质生产菌，其特征在于通过权利要求1～13任意一项所述的脂质生产菌的育种方法或育种工具盒获得。
15.脂质生产方法，其特征在于由权利要求14所述的脂质生产菌生产含有PUFA的脂质。
全文摘要
本发明是被孢霉(Mortierella)属脂质生产菌的育种方法。更具体而言，采用包含抑制上述脂质生产菌中特定基因表达的表达抑制工序的脂质生产菌育种方法，能够高效且有效地进行被孢霉属脂质生产菌的育种。
文档编号C12N1/15GK1946843SQ20058001061
公开日2007年4月11日 申请日期2005年3月28日 优先权日2004年3月31日
发明者落合美佐, 河岛洋, 清水昌, 樱谷英治 申请人:三得利株式会社