专利名称：生物催化制造(甲基)丙烯酰胆碱或(甲基)丙烯酸2－(n,n－二甲氨基)乙酯的制作方法
发明概述本发明涉及合成丙烯酸和/或甲基丙烯酸的胆碱酯和/或2-(N，N-二甲氨基)乙醇(＝DMAE)酯的生物催化方法，即丙烯酰胆碱、甲基丙烯酰胆碱(methacrylylcholine)、丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯(下文为DMAEA)和/或甲基丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯(下文为DMAEMA)的制造方法或过程，其包括在具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂存在的情况下胆碱和/或2-(N，N-二甲氨基)乙醇(下文为DMAE)与丙烯酰辅酶A(acrylyl-CoA)和/或甲基丙烯酰辅酶A反应，其中优选在能量提供物质以及具有S-乙酰辅酶A合成酶活性(乙酰辅酶A合成酶活性)的生物催化剂存在的情况下通过丙烯酸盐和/或甲基丙烯酸盐与辅酶A反应，或通过利用微生物例如从糖类例如经乳酸代谢产生的丙烯酸盐或甲基丙烯酸盐反应，形成丙烯酰辅酶A和/或甲基丙烯酰辅酶A；涉及(尤其是转化的，即基因修饰的)具有胆碱乙酰转移酶活性并优选另外具有乙酰辅酶A合成酶活性的生物及其在所述过程或方法中的用途；涉及为了制造一个或多个上述胆碱酯或DMAE酯，具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂在实现(甲基)丙烯酰部分从(甲基)丙烯酰辅酶A到胆碱和/或DMAE的转移中的用途；以及涉及如下所述进一步的用途、生物、过程和方法。
背景技术：
微生物或生物催化介导的生物量(例如纤维素或淀粉)的转化以提供技术原材料，是一种重要的矿物燃料替代法，并由于未来矿物燃料的耗尽变得越来越重要。重要的是在手边拥有尽可能多的生物催化反应以使用生物或生物催化方法生产它们。
丙烯酰胆碱，其在工业上更普遍被称为qDMAEA，丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯的季盐，和甲基丙烯酰胆碱，以及DMAEA或DMAEMA，是(甲基)丙烯酸的单体，其在聚合物的制造上有着广泛应用。特别是水溶性均聚物或与其他可聚合单体例如(甲基)丙烯酰胺或N-乙烯吡咯烷酮或丙烯酸羟乙酯等的共聚物被用于此类聚合物的制造。这些聚合物在许多应用中有着用途，特别是在水处理中作为絮凝剂使用；但也有着其他用途，例如作为增稠剂，在造纸工业的粘合剂中作为助留剂，在用核酸，例如DNA转染微生物中作为分散剂或作为助剂，等。
胆碱(2-羟乙基三甲铵(2-hydroxyethyltrimethylammonium))是一种季铵醇(quaternary amino alcohol)，其广泛地存在于活的生物内作为某些类型磷脂的成分以及存在于神经递质乙酰胆碱中。它也是日常饮食的一部分，因为它包含于多种食物中。
DMAE[2-(N，N-二甲氨基)乙醇]同样广泛地存在于活的生物内并且是例如磷脂酰乙醇胺生物合成的前体。
丙烯酸和甲基丙烯酸是单体，被广泛用于制造聚合物，或者是通常的酸的盐的均聚物，例如丙烯酸钠或丙烯酸铵，或者是与其他可聚合单体例如丙烯酰胺等的共聚物。这些合成的聚合物被用于多种应用，包括用于水处理的絮凝剂；用于造纸、纺织和皮革工业的涂层、涂饰剂和粘合剂；以及在超吸收剂(superabsorbent)和分散剂等的生产中用于制造油漆、抛光剂和粘合剂。
1980年Dalal等(Biosources Digest vo.2p 89to 97)阐述了丙烯酸的代谢合成。作者报告在埃氏巨球形菌(Megasphera elsdenii)的乳酸盐厌氧脱水中丙烯酰辅酶A被假定为中间体并且在丙酸梭菌(Clostridium propionicum)中它发生在β-羟基丙酰辅酶A(β-hydroxypropionly CoA)脱水作用之后。他们还提出利用丙酸梭菌的静息细胞用丙酸盐作为底物可以观察到丙烯酸盐积累。方案I给出了丙烯酰辅酶A合成的代谢方案。
方案I在丙酸梭菌中涉及丙烯酰AoA的代谢途径(同样参见于Dalal等，出处同上)
最近，一些生物合成丙烯酸盐和丙烯酸酯的方法得到阐述，例如在WO 02/042418 A2或WO 02/42471 A2中，也参见关于丙烯酸合成的WO 00/71738。
这些文件无一阐述了制造丙烯酸或(甲基丙烯酸)2-(N，N-二甲氨基)乙酯或胆碱丙烯酸盐(cholinylacrylates)或-甲基丙烯酸盐(上文和下文中的丙烯酰胆碱或甲基丙烯酰胆碱)的可能性，而且它们通常要求丙烯酰辅酶A水解酶和脂肪酶活性的组合以首先从丙烯酰辅酶A中产生游离的丙烯酸盐，随后通过例如脂肪酶转化为脂族醇的酯。
另一方面，EP 0 250 325和WO 00/43348阐述了丙烯酰胆碱合成的化学过程，其从例如丙烯酸2-二甲氨基乙酯和氯代甲烷开始，而JP 9255640和JP 6279371描述的化学合成方法或者从与硫酸反应的丙烯腈开始，经硫酸丙烯酰胺作为中间体并随后与胆碱盐酸盐反应，或者例如在酸催化剂存在的情况下丙烯酸与胆碱盐酸盐在甲苯中反应。
然而，为了提供同样可以利用可再生生物量的综合的生物合成方法的最终步骤，生物催化反应，而不是这些化学反应，将更令人满意。
丙烯酸和甲基丙烯酸是S-乙酰辅酶A合成酶(S-乙酰辅酶A合成酶、乙酸硫激酶或乙酸辅酶A连接酶)(EC 6.2.1.1)的已知底物，然而，发现的产物大体上似乎不相当于酰基辅酶A硫酯——相反，经迈克尔加成(Michael addition)双键和通过酸的羰基形成硫羟酸酯发生了辅酶A的两个等价物的结合，因此发现形成了双加合物(参见例如Patel和Walt，Anal.Biochem.170，355-60(1988))。双加合物有下式 与这个背景相反，提供合成(甲基)丙烯酰胆碱和/或DMAE(M)A的生物方法将高度令人满意，这种生物方法是简单的和/或当前的化学方法的真正替代方法，并且也为综合形成一种更普遍的生物技术方法，例如最终利用可再生资源，奠定了基础。
发明概述令人惊讶地，现在已经发现在具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂存在的情况下通过胆碱与丙烯酰辅酶A或甲基丙烯酰辅酶A反应可能直接从S-(甲基)丙烯酰辅酶A((甲基)丙烯酰辅酶A)获得(甲基)丙烯酰胆碱。另外或可选择地，利用相同类型的生物催化剂使DMAE与丙烯酰辅酶A和/或甲基丙烯酰辅酶A反应可以获得DMAEA和/或DMAEMA。
在具有乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂的帮助下，利用甲基丙烯酸和/或丙烯酸以及辅酶A甚至可能合成前体(甲基)丙烯酰辅酶A，因为显示条件是可利用的，在所述条件下在体外已经利用具有乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂，例如通过最优化反应物的浓度，特别是相对于彼此而言，(甲基)丙烯酸的羧基基团与辅酶A的硫醇基团的反应优先于向双键的加成，因此可以形成比双键加合物或双加合物相对多的硫酯。在这点上特别优选的是下面更详细描述的补料分批方法。
体外条件允许合成(甲基)丙烯酰辅酶A这个令人惊讶的新发现构成了同样在体外或通过体外和体内的步骤相组合合成(甲基)丙烯酰胆碱和/或DMAE(M)A的基础。
这构成了合成(甲基)丙烯酰胆碱和/或DMAE(M)A的生物合成途径的基础，其大大地消除了对石油化学原料的依赖，例如也通过在体内或在体外合成(甲基)丙烯酰辅酶A与在体外合成(甲基)丙烯酰胆碱和/或DMAE(M)A的组合或两步骤均在体内合成(甲基)丙烯酰胆碱和/或DMAE(M)A。
发明详述本发明，在第一个方面，涉及丙烯酰胆碱(非常优选)、甲基丙烯酰胆碱(优选)、丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯和/或甲基丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯的制造过程或方法，所述过程包括在具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂存在的情况下使胆碱(优选)和/或2-(N，N-二甲氨基)乙醇与丙烯酰辅酶A和/或甲基丙烯酰辅酶A反应。取决于原材料，获得相应的产物。
在进一步的方面，本发明涉及基因修饰生物(GMO)，其用一个或多个(优选重组的)核酸转化，所述核酸包含一个或多个编码并允许具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂表达的片段。
在另一个方面，本发明涉及上一段中提及的GMO在制造丙烯酰胆碱(非常优选)、甲基丙烯酰胆碱(优选)、DMAEA和/或DMAEMA中的用途，其包括向所述微生物的培养物施用一个或多个适当的来自生物量的原材料以及优选也施用胆碱和/或DMAE，并且分离所得到的产物丙烯酰胆碱(非常优选)、甲基丙烯酰胆碱(优选)、DMAEA和/或DMAEMA。
本发明还涉及具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂在实现(甲基)丙烯酰部分从(甲基)丙烯酰辅酶A到胆碱(优选地)和/或DMAE的转移中的(体外和/或体内)用途，以制造(甲基)丙烯酰胆碱(优选地)和/或DMAE(M)A。
本发明同样进一步涉及具有S-乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂在制造丙烯酰辅酶A(尤其是有发生在体外的相应反应步骤)中的用途，其中伴随低水平的双加合物形成。
通过下列反应方案表示构成本发明基础的反应方案II
在方案II中，原材料胆碱(作为盐)和/或盐形式的DMAE以及(甲基)丙烯酰胆碱和/或DMAE(M)A盐产物的阴离子可以是在各自反应系统中耐受的任何阴离子，例如有机酸的阴离子，例如磺酸盐，如甲磺酸盐或甲苯磺酸盐，或羧酸盐，如柠檬酸盐或乙酸盐，或尤其是无机酸，例如硫酸盐，卤化物，如氯化物或溴化物，硝酸盐，磷酸盐等。
优选地，按照下列方案III，通过具有S-乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂，由丙烯酸或甲基丙烯酸和/或其盐，在下文中一般称为丙烯酸盐和/或甲基丙烯酸盐，在体外或在体内合成丙烯酰-或甲基丙烯酰辅酶A
方案III 和上述文献形成相反，如果(体外)反应条件经过适当改良，则可以得到非常令人惊讶的大量的(甲基)丙烯酰辅酶A而不是双加合物。
因此结果是反应可以产生更多的期望的(甲基)丙烯酰辅酶A，如果(甲基)丙烯酸盐和辅酶A的摩尔比是(甲基)丙烯酸盐以摩尔过量的方式使用的话，例如超过2倍摩尔过量、更优选超过4倍摩尔过量，再更优选超过10倍，例如(甲基)丙烯酸盐大约15倍摩尔过量于辅酶A；例如，(甲基)丙烯酸盐的浓度可以在50-300，例如120-280mM，而辅酶A的浓度为其小部分，优选如可从刚才提到的有利于(甲基)丙烯酸盐的优选摩尔过量比中推导出来的。
同样存在其他所需成分(例如Mg2+盐，如MgCl2；ATP(优选与(例如碱金属，如钠)(甲基)丙烯酸盐相比为亚理想配比的摩尔量，例如小于(甲基)丙烯酸盐摩尔量的1/5，如所述量的1/10)，当然还有生物催化剂，优选S-乙酰辅酶A合成酶，其以适当的活性存在，例如在ATP、乙酸盐和辅酶A存在的情况下在37℃为0.5-15单位/ml。同样优选存在缓冲物质，例如Tris缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷或其他允许适当的pH确定的缓冲物质，所述pH例如在5-9，例如6-8(如，pH大约为6.4-7.3)。这些包括任何合适的生物学兼容的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液等。
如果在反应过程中辅酶A不是突然添加而是更小批量添加(非常优选的补料分批方式)或连续添加，则所需(甲基)丙烯酰辅酶A产物超过双加合物的产量仍然提高，因而使得硫酯形成可以发生在进一步的辅酶A可能加成到其产物(甲基)丙烯酰辅酶A的双键之前。例如，在一个时间段内，例如，最高达3小时，辅酶A可以每隔一段时间以总最终量/浓度为1/20-1/3的量分批式添加，如1/10的总辅酶A分别在0、5分钟、10、15和20分钟使用，随后在80、95、110、120分钟145和155分钟后以这些间隔再次使用1/10。另外，同样可在适当时补充ATP，例如为了产生5mM浓度在t＝0时添加ATP，随后在25分钟后又添加ATP以产生5mM浓度并且在150分钟后再次添加以产生5mM ATP浓度。
需要时，同样可在适当的时间段后补充酶。
因此在每个单独的时间点将游离辅酶A的亚理想配比浓度优选保持在低于(甲基)丙烯酸盐初始浓度1∶100的比率，例如1∶150，例如2mM或更低，例如大约1mM或更低，并且更优选在每个时间点将ATP浓度同样保持在低于(甲基)丙烯酸盐初始浓度的1/20，例如低于10mM，例如等于或低于大约5mM。
本发明的一个有趣的变形涉及利用丙烯酸作为唯一的碳源(例如被同化为乳酸盐随后为丙酮酸盐，后者经三羧酸循环可以被利用)，其同样平行地供应给方案III中提供的反应。这个方法可以为丙烯酰胆碱和/或DMAEA合成提供尤其良好的条件。
在具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂存在的情况下，同样可能利用适当的来自生物量的原材料，代替提供丙烯酸盐或甲基丙烯酸盐，作为与胆碱和/或DMAE反应的前体。这些前体是生物过程的产物(包括但不限于废弃的生物量材料，例如能够被处理，例如被水解，以释放出适当的原材料的农业材料)并且经生化途径可以首先转化为(甲基)丙烯酰辅酶A。例子有糖类(例如来自废弃的生物量材料、淀粉、纤维素或其他多糖)、多元醇(例如来自脂肪)、有机酸(例如来自代谢或来自脂肪酸酯水解)、氨基酸等。如本文所述(甲基)丙烯酰辅酶A随后可以被转化为(甲基)丙烯酰胆碱和/或DMAE(M)A。由于生物量是可再生的，所以这个方法对于可持续发展和环境保护基本上是非常有利的。原则上和有利地是，从有生物量原材料的生化途径同样可能获得其他原材料、胆碱和/或二甲氨基乙醇。然而，由于实际原因，这些原材料可以被如此添加。
根据本发明其中可以供应前体以合成丙烯酰胆碱的某些可能的代谢反应途径和可能的连接点以及酶活性的实例示于上述的方案I以及下述的方案IV图IV 此处，大写字母A-N优选表示下列酶活性A烯醇丙酮酸磷酸羧激酶；B天冬氨酸转氨酶；C天冬氨酸脱羧酶；D辅酶A转移酶；Eβ-丙氨酰辅酶A脱氨酶；F乙酰辅酶A羧化酶；
G丙二酸单酰辅酶A还原酶；H3-羟基丙酰辅酶A脱水酶(＝丙烯酰辅酶A脱水酶)I(乙酰)辅酶A合成酶或(乙酰)辅酶A转移酶(它可以是酶复合物例如WO 02/042418中的OS17的一部分)；K丙酰辅酶A还原酶(它可以是酶复合物例如WO 02/042418中的OS17的一部分)；L辅酶A合成酶或辅酶A转移酶；M乳酰辅酶A脱水酶；N具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂。
为了合成甲基丙烯酰胆碱，例如，可能利用异丁酸或其代谢前体代替方案IV中的丙酸作为连接点或作为原材料。
其他离析物是可能的，例如利用由于使用旋卷分枝杆菌(Mycobacterium convolutum)或遗传材料作为生物催化剂和由此得到的生物催化剂而可能的将丙烯氧化为丙烯酸盐的途径，分别通过例如赤红球菌(Rhodococeus ruber)或紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)利用细菌腈水解酶或腈水合酶与酰胺酶活性组合将烯丙醇氧化为丙烯酸盐(例如利用荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)或珊瑚诺卡氏菌(Nocardia coralline)或遗传材料作为生物催化剂和由此得到的生物催化剂)或丙烯腈或甲基丙烯腈。
相应的途径和酶活性可以是构成生物的天然核酸和遗传装备的部分的核酸基因表达(包括转录和翻译和可能的翻译后修饰)的结果，这些生物尤其是植物(或植物组织)或更优选微生物(尤其是单细胞生物)，最尤其是原核生物，例如细菌，或(至少在它们生活周期的部分内)单细胞真核生物，例如真菌，如酵母，或它们可以是此类细胞转化的产物(对于引入的外源性核酸它们随即变成“宿主细胞”，即基因修饰生物(GMO))，所述细胞包含来自其他生物(例如动物，如啮齿动物，或人类)的“外源性”核酸或其类似物，其带有所需的编码和能够表达相应生物催化剂活性的片段，优选带有重组核酸，例如带有载体(如质粒、粘粒、病毒性或病毒来源的载体等)，其中，除了一个或多个(甲基)丙烯酰胆碱和/或DMAE(M)A或其前体合成所需的生物催化剂活性的编码片段之外，所述核酸或其类似物可以包含一个或多个阻遏物、激活物、启动子和/或转运蛋白序列或其他序列，这些其他序列对于在细胞内或跨过细胞膜整合、维持、转运、翻译后修饰和尤其是编码的多肽的表达及其活性以及允许进行选择的任选的遗传标记(例如半乳糖苷酶或抗生素抗性编码序列)是必需或有用的，尤其是携带一个或多个相应的酶活性生物合成所需的遗传信息成分的重组核酸构建体。
WO 02/042418中给出了或者从中可以推导出可能的多肽和基础的遗传信息/核酸的实例，这些多肽和遗传信息/核酸可以用于获得直接在它们的亲本生物中或在不同的宿主细胞的转化中有用的酶活性，且所附的参考文献还收录了尤其是相应的核酸和氨基酸序列以及其中获得它们或其类似物的方法。在基因技术，尤其是分离、重组、表达、转化等中有用的方法是本领域的技术人员已知的，并且能够，例如，作为基础或利用公开于下述文献中的知识、方法和试剂Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Press，1989或Gassen等，“GentechnischeMethoden-Eine Sammlung von Arbeitsanleitungen für dasmolekularbiologische Labor”，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg 1999，F.M.Asubel(Hg.)“Short Protocols in MolecularBiology”，3rd ed.，New York，Wiley 1997；或Asubel等“CurrentProtocols in Molecular Biology”，Vol.1-3，Greene PublishingAssociates and Wiley-Interscience，New York，1987。
作为实例，一个迄今未知的被分离的具有在本发明中有用的生物催化活性的酶(例如胆碱乙酰转移酶或S-乙酰辅酶A合成酶)可以被部分测序，例如，利用选择性内切蛋白酶来选择性消化，例如内切蛋白酶Lys-C、内切蛋白酶Glu-C、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶或优选胰岛素(从碱性氨基酸精氨酸或赖氨酸的C-末端切割)，并且，分离后，例如在凝胶上进行电泳或通过层析(如HPLC)，测定所得到的肽的末端序列，例如，通过外肽酶，例如羧肽酶，如羧肽酶A、B或P)。优选胰蛋白酶消化，随后进行MS/MS分析(TOF)。由此所得的序列可以被用于例如发现相应的编码核酸(如RNA或尤其是DNA)序列或它们的非编码反链(counter strand)，反链随后可用于设计引物以(例如通过与基因组或部分(例如限制性内切核酸酶)消化的DNA杂交)寻找编码相应酶的较长的DNA片段(或来自双链DNA中的配对链的相应非编码序列)，随后可以把这些片段拼凑起来(例如通过基因步移)以形成一个完整的编码核酸；或来自cDNA库。通过上一段所提到的参考文献中描述的方法的组合，可能分离编码具有所需活性之一的多肽的DNA。
可选择地，已经公开的编码相应生物催化活性的序列的合成的或分离的DNA(例如cDNA)可以被利用并且整合进入载体，所述生物催化活性例如酶，例如胆碱乙酰转移酶或S-乙酰辅酶A合成酶活性，或转运蛋白，例如胆碱和/或DMAE转运蛋白。
术语“核酸”是指多核苷酸，尤其是DNA。提到重组核酸时，这是意指特定的适当载体形式的核酸，以及在转化后的宿主细胞中由此得到的产物(例如由于整合到也包括质粒等的基因组中以及伴随的改变、重组或类似事件)。在宿主生物转化中有用的重组核酸有，例如，载体(例如质粒、粘粒、病毒性或病毒来源的载体等)，包含相应的生物催化剂活性表达所需的编码序列。
一般而言，“重组体”，在关于核酸或尤其DNA的上下文中任何地方使用时，优选具有它的通常含义，例如包括(1)在其所引入或尤其表达的生物内非天然存在的序列，或(2)通过人工组合两个另外单独的较短序列制成的序列(例如通过将编码序列插入到质粒或其他载体中)。人工组合可以通过化学合成和/或优选通过分离的核酸片段的人为处理来完成，例如通过基因工程技术，如部分消化，例如用内切核酸酶、连接、剪接等。“重组体”也用于描述被人为处理但包含相同的调节序列和编码区的核酸分子，这些调节序列和编码区是在从中分离核酸的生物内发现的。
本发明还尤其涉及利用基因修饰生物(GMO)生物合成丙烯酰胆碱、甲基丙烯酰胆碱、DMAEA和DMAEMA中的任何一个或多个的途径以及相应的GMO，优选基因修饰的(优选(至少在其部分生命周期内)单细胞微生物(尤其是原核生物，最优选细菌，或真菌，最优选酵母，但也可以采用昆虫细胞，例如利用杆状病毒表达系统)，其(已经是天然形式或用一个或多个适当的核酸转化后)包括a)核酸(尤其是DNA)，其来自原核生物，优选细菌；或次优选真核生物，例如酵母、其他昆虫、真菌或植物细胞、真菌或植物组织或植物；其中的每一个都能够使GMO生物催化地将生物量原材料(优选如上所定义的，例如多元醇或糖类例如葡萄糖)优选转化为乳酸并进一步转化为(甲基)丙烯酰辅酶A；b)组合一个或多个(优选重组的)核酸(尤其是DNA)，其来自高等生物(优选动物，更优选例如在神经肌肉接头具有胆碱乙酰转移酶活性的生物)，例如昆虫或尤其是脊椎动物，尤其是哺乳动物、组织或细胞，其核酸编码并表达所需生物催化活性(尤其是酶)并且使GMO能够实现(甲基)丙烯酰辅酶A和胆碱盐，例如胆碱盐酸盐，和/或DMAE或其盐之间的生物催化反应。在生长培养基中可以为GMO提供胆碱盐或DMAE，或其盐。可选择地，它同样可以由适当的来自生物量的原材料生物合成产生。
有利地，GMO，如果不是已经表现出此类活性，同样可以被另外修饰以使DMAE和/或胆碱能够进入细胞和/或在需要时允许产物DMAEA、DMAEMA、丙烯酰胆碱和/或甲基丙烯酰胆碱离开细胞。来自微生物，尤其是原核生物或单细胞真核生物或植物的活性或重组遗传材料与高等生物，尤其是在上一段中所述的动物，优选哺乳动物，例如啮齿动物或人类的活性或重组遗传材料的结合的这个概念的实施方案，例如从动物细胞，例如所得的GMO获取编码胆碱乙酰转移酶并优选另外编码DMAE或对于优选合成胆碱酯编码更优选的胆碱转运蛋白的遗传材料及其在(甲基)丙烯酰胆碱制造中的用途和/或利用这些GMO制造(甲基)丙烯酰胆碱的过程或方法，是本发明特别优选的变形，尤其是包含编码除已经存在或同样重组整合至所述GMO的其他所需活性之外的所需活性的重组核酸的此类GMO在DMAE(M)A和/或优选(甲基)丙烯酰胆碱制造方法中的用途。本发明还涉及制造相应的GMO，尤其是单细胞生物，尤其是原核生物，例如细菌，例如大肠杆菌(E.coli)，或真菌或单细胞真核生物，例如酵母，其包含一个或多个编码在这一段a)和b)下所述活性的核酸的组合。优选的是转化的原核生物，尤其是细菌，或转化的真菌，优选酵母，其包含一个或多个(天然或重组的)核酸，所述核酸编码并特别是允许来自原核生物或较低等的真核生物例如真菌，如酵母的胆碱S-乙酰转移酶活性的表达，以及一个(优选重组的)核酸，所述核酸编码并允许动物，尤其是啮齿动物，例如大鼠，或人类(例如来自人类胎盘)的胆碱乙酰转移酶活性的表达。
产物DMAE(M)A和/或优选(甲基)丙烯酰胆碱在细胞(例如上一段中提及的GMO)中生产时可以直接从上清液(同样在透化细胞的情况下)分离，或(如果不易离开细胞)在细胞透化处理后(其同样可以允许原材料的进入，尤其是胆碱盐或游离的和/或盐形式的DMAE)分离，例如用适当的表面活性剂或孔蛋白(例如来自哺乳动物补体系统)，或在(例如化学的或机械的)细胞膜破坏后分离，例如，利用一种或多种采用匀浆器、搅拌器、超声波破坏等的方法。在破坏的情况下剩余细胞可以用于进一步生产，例如如果只有部分培养物被用于破坏的话，持续反应是可能的，但优选分批式生产，而在其他情况下此过程可以或者以持续的或者以分批式的方式进行，其中产物从悬浮液中被分离出来。
在任何情况下产物(DMAEA、DMAEMA、丙烯酰胆碱和/或甲基丙烯酰胆碱)的分离，同样包括在体外合成的情况下，可以通过标准方法进行，例如利用层析(尤其是包括阳离子交换层析的步骤)、电透析、溶剂洗涤、萃取、分配(partitioning)等，或此类方法的结合。可选择地，可能可以原位聚合DMAE(M)A和/或(甲基)丙烯酰胆碱，或者作为均聚物或者外加其他可聚合的单体，例如丙烯酰胺、苯乙烯等，而无需预先纯化。
同样可能减少或(在相应的生物催化活性不是利用此类活性的活细胞存活所必需时)去除某些生物催化剂的活性，例如通过使用一种或多种方法，例如基因破坏、反义核酸、突变、敲除法或适当的可逆的或不可逆的抑制剂的施用等，以允许所需产物或中间体，例如丙烯酰辅酶A或甲基丙烯酰辅酶A的积累，这通过阻断导致远离这些产物的代谢途径而不是用于其合成且优选进一步反应为DMAE(M)A和/或特别是(甲基)丙烯酰胆碱的途径(例如由方案IV中显示的酶活性E、H、K或M催化的或引导的一个或多个反应)来实现。这可用于达到一个较高的DMAE(M)A和/或(甲基)丙烯酰胆碱合成所需的前体，例如(甲基)丙烯酰辅酶A的可用性(浓度)。
尽管在特定的情况下体外和体内反应的区别的边界可能显得模糊，但这些表达优选定义如下“体外”，在这个公开内容中使用时，优选指相应的过程在不再存活(即，不再显示所有生命迹象，即运动性、繁殖、代谢、有或无可突变性的遗传以及兴奋性)的细胞或细胞组分(直到纯化的酶)中或在无细胞系统，例如酶溶液中进行。
“体内”是指过程发生在活的基本上完整的生物或细胞(其显示上一段所定义的生命特征)存在时或优选主要发生在所述生物或细胞内。术语“基本上完整的”同样意指包括具有透化膜的生物或细胞，例如通过表面活性剂或孔蛋白等，只要上一段中定义的生命特征仍然存在。
在利用(至少基本上)完整的，例如(尤其是转化的，从而得到GMO)细胞或生物时，这是尤其有用的，如果该细胞或生物含有DMAE或尤其是胆碱转运蛋白(尤其是整合到它们各自的细胞膜，如作为膜蛋白的转运蛋白)的话，所述转运蛋白允许DMAE或(在优选的胆碱酯合成中)胆碱容易通过细胞膜。某些适当的胆碱转运蛋白形式的胆碱转运蛋白实例有氨基酸/胆碱转运蛋白、胆碱通透酶、胆碱钠同向转运活性，例如来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1的铜绿假单胞菌胆碱转运蛋白BetT，或哺乳动物胆碱转运蛋白，例如人蛋白Q9GZV3高亲和力胆碱转运蛋白，其基因结构参见例如EMBL Genbank中由Wieland等在http//harvester.embl.de/harvester/Q9GZV3.htm或Apparsundaram等，Biochem.Biophys.Res.Commun.276，862-7(2000)或Okuda等，FEBS Lett.484，92-7(2000)提供的序列，或鼠胆碱转运蛋白，例如鼠密胆碱-3-敏感的胆碱转运蛋白，其依照Apparsundaram等，Biochem.Soc.Trans.29，711-6，2001克隆，或鼠Slc5a7、rattus Cht1；昆虫胆碱转运蛋白，例如果蝇CG7708；蠕虫，例如秀丽隐杆线虫(C.elegans)cho-1；或微生物胆碱转运蛋白，例如高亲和力胆碱转运蛋白、其来源于大肠杆菌、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、Oceanobacillus iheyensis、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)或百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)，来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，参见序列http//66.93.129.133/transporter/wb/downloads/tree/faa/BCCT.faa，或来源于淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，参见http//www.stdgen.lanl.gov/cgi-bin/gene_id_search.cgi？dbname＝ngon&gene_id＝NG0529。在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，胆碱通过一个单独的高亲和力转运蛋白Hnm1p进入细胞。缺失HNM1基因的hnm1Δ细胞仍可存活(参见例如Zufferey等，Reexamining the Role of Transporter-Like(Ctlp)Proteins in Choline Transport，Neurochemical Research29(2)，461-467(2004))。啤酒糖酵母中的胆碱转运蛋白的进一步描述由Hosaka等，J.Bacteriol.143(1)，176-181(1980)提供。流感嗜血菌转运蛋白的描述由Fan等在“Multiple Mechanisms for CholineTransport and Utilization in Haemophilus influenzae”，Mol.Biol.50(2)，537-548(2003)中提供。Canovas等在“Osmoprotectants inHalomonas elongateHigh Affinity Betaine Transport System andCholine-Betaine Pathway”，J.Bacteriol.178(24)，7221-7226(1996)中阐述了胆碱转运进入伸长盐单胞菌(Halomonas elongate)细胞以有利于该生物的渗透保护(osmoprotection)。大肠杆菌中的胆碱H+同向转运蛋白，命名为BetK aka B0314，是已知的，而EP 1 236 739描述了被鉴定为59914和59921的胆碱转运蛋白及其用途。这些活性是，如果不是已经存在，优选通过含适当核酸的各自微生物的转化整合的，所述核酸包含一个或多个编码并表达负责所述转运蛋白活性的多肽和蛋白的片段。
在需要时，同样存在产物(DMAEA、DMAEMA、丙烯酰胆碱和/或甲基丙烯酰胆碱)的转运蛋白分子，其或者已经是所采用的生物的自然装备的部分或者是基因重组和转化的结果。
可选择地，可以利用具有透化的细胞膜(例如通过如上所述的表面活性剂或孔蛋白)的细胞，或可以组合透化和转运蛋白的存在。
如果基本上完整的生物或细胞作为生物催化剂使用，例如在发酵过程中，则需要添加较低(通常指仅仅最小量的或没有)的辅因子，从而这是本发明特别优选的实施方案(尽管有时需要提供营养物，包括在所述辅因子的生物合成中有用的前体或维生素)。原因之一是细胞能够再循环并且有时甚至能够自身合成所需辅因子(例如ATP、NAD(P)+、NAD(P)H、FAD、FADH、辅酶A)。
然而，生物/细胞通常对高浓度的有机底物反应非常敏感(底物或产物抑制、溶剂钝化)。因此，在必须使用特殊溶剂时或者底物或产物可能导致反应速度或产量降低时，部分纯化系统的使用也是有利的，这形成本发明的不同的实施方案。对于部分纯化，将细胞破坏，且在需要时去除细胞碎片并获得无细胞提取物。
选择这样的优选的发酵时间以达到关于所需生物催化剂(例如胆碱乙酰转移酶)活性的最佳条件。例如，当细胞密度达到足够的值时，停止培养。用已知方式分离培养肉汤，例如通过离心，并用常规方式分解沉淀的细胞，例如通过与精制的特殊材料如玻璃珠一起振荡，通过超声波处理，利用匀浆器、搅拌器或弗氏压碎器等。不能溶解的细胞成分以及，如果使用了，特殊材料例如玻璃珠等，被任选去除，例如，通过离心或过滤，而无颗粒和细胞碎片的残余物被当作生物催化剂活性的来源(粗提取物)使用。根据本发明，作为包含生物催化剂活性的粗提取物的残余物可以直接应用于方法中。然而，有利地，为了去除核酸(粘性溶液)以及其他杂质或干扰成分(例如抑制剂或干扰酶活性等)，对粗提取物实施进一步纯化以获得在本发明中有用的更纯化(更浓缩的)形式的生物催化活性。优选地，对细胞粗提取物实施一个或多个同样地本领域已知的纯化步骤，以便从提取物中去除干扰成分。
术语“纯化的”是指优选“以至少部分纯化的形式”(＝“以浓缩的形式”)或者，更优选地，在更严格意义上纯化，即，以实际上分离的形式(例如在分离的蛋白的情况下，例如胆碱乙酰转移酶或S-乙酰辅酶A合成酶)，尤其是与其他存在的寡肽或多肽相比按重量计纯度超过50，最尤其是超过95％)。
进一步，本发明涉及所述的生物在生产一个或多个所需的生物催化剂，尤其是具有胆碱乙酰转移酶或可选择地或另外具有S-乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂中的用途，其(此处与本公开内容中所有其他提及生物的地方一样)可以优选为上文提及的GMO，例如(优选转化的)植物或植物部分或植物组织或昆虫细胞或尤其是微生物，尤其是细胞，更尤其是适用于各自重组遗传材料的宿主细胞(例如细菌，如大肠杆菌、乳克鲁维氏酵母(K.lactis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)、丙酸梭菌、运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)或凝结芽胞杆菌(Bacilluscoagulans)，适用于极端(例如温度和/或pH)条件的例子有古细菌(archebacteriae)，酵母或其他真菌，例如啤酒糖酵母、克鲁维氏酵母属物种(Kluyveromyces spp.)、毕赤氏酵母属物种(Pichia spp.)、汉逊氏酵母属物种(Hansenulo spp.)、假丝酵母属物种(Candidaspp.)、丝孢酵母属物种(Trichosporon spp.)或Yamadazyma spp.)，其用适当的核酸转化，所述生物催化剂随后可在根据本发明合成DMAEA、DMAEMA和/或尤其是丙烯酰胆碱和/或甲基丙烯酰胆碱的制造方法(体外、体内或组合的)中使用。
除非已经在上文或进一步在下文中另外指出，本发明说明书中使用的进一步的一般术语、符号和名称优选具有下列含义(其中更具体的定义在每个单独的情形中或组合地可以用于替代较普遍的术语以定义本发明更优选的实施方案，关于已经在上文中给出的一般术语、符号和名称及其解释或优选含义同样如此)术语“生物催化剂”，例如在“有(＝具有)胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂”或“有(＝具有)S-乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂”中，用于本文时，涉及具有各自的(例如胆碱乙酰转移酶或S-乙酰辅酶A合成酶)活性的生物催化剂，尤其是酶，最优选多肽，其具有所述活性，例如最尤其是来源于大鼠的胆碱乙酰转移酶，如下文所述，或S-乙酰辅酶A合成酶(乙酰辅酶A合成酶)，如下文所述。如果没有另外说明，所有这些术语都不仅包括本发明多肽的自然发生的、“真实的”序列，这是本发明优选的实施方案，而且还包括所有的突变、变异及其抑制各自的(例如胆碱乙酰转移酶)活性的片段，优选具有其所来源的天然的(亲本)酶至少10％的相对活性。
“具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂”尤其指相应的生物催化剂，优选酶，在用于测定胆碱乙酰转移酶活性的标准测定系统中是有活性的，所述胆碱乙酰转移酶催化乙酰辅酶A与胆碱反应成乙酰胆碱和游离的辅酶A。一个适当的测试系统是Berry和Whittaker，Biochem.J.73，447-458(1959)采用的。在本发明此处或在至少一个后续测定中有用的生物催化剂有利地显示了超过每mg蛋白0.01纳摩尔/分钟的活性，更优选每mg蛋白0.1纳摩尔/分钟，再更优选每mg蛋白0.4纳摩尔/分钟。其他测定酶活性的方法(这些方法同样适用于膜结合或相关的酶的情况下，例如，测量匀浆物)是已知的，例如利用14C标记的乙酰辅酶A，参见例如Fonnum，F.，Biochem.J.115，465-79(1969)或Fonnum，F.，J.Neurochem.24，407(1975)，或Rylett等J.Neurochem.45，611-20(1993)，例如测定在40μl反应混合物中37℃的初始反应速度，所述反应混合物含有5-1200μM[1-14C]乙酰辅酶A(Amersham)、0.1-3.5mM胆碱、0.2-10ng具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂、50mM磷酸钠(pH 7.4)、250mM NaCl、1mM EDTA和0.5mg/ml BSA(参见Ohno等，Proc.Natl.Acad.SciUSA98(4)，2017-22(2001))。在一个优选的示例性方法中，为了测试用于合成目的的生物催化剂的有效性，例如首先利用其天然底物乙酸盐来测定待测的生物催化剂的胆碱乙酰转移酶活性。随后在pH 7.46的缓冲液(1.1mM Na2HPO4/0.7mM NaH2PO4)中制备7mM胆碱盐酸盐溶液。胆碱溶液(3ml)在37℃温育15分钟。添加乙酰辅酶A(2mg，2.5微摩尔)和0.1ml pH 7.4胆碱乙酰转移酶或待测的生物催化剂(例如对于乙酸盐具有例如大约5.5-20纳摩尔/分钟的活性)并随时间推移测量吸光度。反应完成时，将反应混合物冷冻保存直至利用离子层析(IC)进行分析。在Dionex DX-300仪器上进行IC分析，所述仪器具有IonPac CS12A柱、90％的20mM甲磺酸/10％的90％(v/v)乙腈水溶液的流动相和电导率检测(CSRS autosuppressionexternal water mode阳离子再生系统)。435分钟后，可以发现0.10mM的乙酰胆碱以及具有假定的初始活性为20纳摩尔/分钟的酶。在这些条件下具有足够活性的生物催化剂应该，在这个测试系统中，有利地提供超过0.02mM的乙酰胆碱。更优选地，在任何采用的具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂的乙酰辅酶A活性测试系统中，该生物催化剂在本发明的过程或方法中特别有用，关于甲基丙稀酰辅酶A或优选丙稀酰辅酶A的活性应该超过10％，再更优选超过50％。具有胆碱乙酰转移酶活性的酶的实例为来源于智人，或其他脊椎动物，例如小鼠或尤其是大鼠，或更普遍的是来源于其他后生生物的酶。此处同样包括重组的胆碱乙酰转移酶，例如有利地重组的大鼠胆碱乙酰转移酶AG220，其来源于Chemicon International Inc.，Temecula，California，等。
“具有乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂”尤其指相应的生物催化剂，优选酶，在用于测定乙酰辅酶A合成酶活性的标准测定系统中是有活性的。例如，下列监控AMP形成的偶联酶测试可以用于测定乙酰辅酶A合成酶的活性测定由ATP(2.5mg，5×10-3mmol)、辅酶A(0.46mg，6×10-4mmol)、MgCl2(4mg，2×10-2mmol)、磷酸烯醇丙酮酸(0.19mg，9.4×10-4mmol)、KCl(1.2×10-4mmol)、NADP(0.25mg，3.6×10-4mmol)、乙酸(10-1to 10-4mmol)、乙酰辅酶A合成酶或待测的生物催化剂(优选以大约0.5单位的活性)、丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶(1单位)、肌激酶(1单位)组成，并用Tris缓冲液(0.25M，pH 7.2)将总体积补充至1ml。通过观察由于NADH氧化为NAD+在340nm吸光度的降低来监控反应。通过Linewaever-Burk和Eadie-Hofstee作图计算出Vmax和结合常数。其他测定方法是可能的，例如利用经苹果酸脱氢酶和柠檬酸合成酶与NAD+的还原偶联的乙酰辅酶A的形成，例如，如Cai等，J.Bacteriol.182，2113-8(2000)或Charles等，Genetics 146，9877-82(1997)所述。特别优选的是由Sigma采用的检测胆碱乙酰转移酶活性的方法，它是对Berg，P.，J.Biol.Chem.222，991-1013(1956)所描述方法的改良此处，用羟胺将形成的乙酰辅酶A转化成乙酰-NHOH。乙酰NHOH随后与FeCl3溶液混合以产生褐色的产物，随后在546nm、1cm光程测量所述产物吸光度。简言之，反应混合物(每小瓶1.10ml)的最终测定浓度是136mM磷酸钾、4mM氯化镁、9.1mM ATP、45mM氟化钾、9.1mM乙酸钾、9.1mM还原型谷胱苷肽、0.35mM辅酶A、182mM羟胺以及0.02-0.04单位S-乙酰辅酶A合成酶，后者在37℃剩余溶液平衡后以0.1ml的体积添加。pH为7.5。添加酶后，将混合物立即混合并温育20分钟。之后，添加2ml的370mM FeCl3/3.3％三氯乙酸溶液，随后混合并转化和转移至测量杯中。在空白样品中，没有乙酰辅酶A。优选地，在本发明前述的测定系统中有用的具有S-乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂具有的活性为每mg蛋白超过0.0005单位，更优选为每mg蛋白0.001至，例如，15单位，1单位被定义为37℃和pH 7.5时每分钟由乙酸盐、ATP和辅酶A形成1.0微摩尔S-乙酰辅酶A的生物催化剂的量。为了测试制备规模的辅酶A合成酶的活性，反应(例如在7ml规模)可在10.8mM磷酸钠/1.4mM氢氧化钠缓冲液中起始和进行如下制备7.4mM的乙酸钠和0.75mM辅酶A溶液并在37℃温育15分钟。添加S-乙酰辅酶A合成酶，其或者来自Sigma，产品目录编号A 1765，来源于面包酵母，或者是待测的生物催化剂(例如0.2mg)以及28.4mg ATP。混合物(pH大约为7.36)随后在石英杯中37℃温育并随时间推移测量混合物在232nm的吸光度。例如，在本测定中发现初始活性大约为每分钟形成1-600纳摩尔乙酰辅酶A或更多。如实施例中所述可以有利地显示用于(甲基)丙稀酰辅酶A制备类型的优选活性(作用如同(甲基)丙烯酰辅酶A合成酶活性)。优选地，在至少一个用于测定具有乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂形成乙酰辅酶A活性的测试系统中，该生物催化剂在根据本发明的过程或方法中特别有效，在丙烯酸盐或甲基丙烯酸盐存在的情况下形成甲基丙烯酰辅酶A或优选丙烯酰辅酶A的S-乙酰辅酶A合成酶的活性应该超过10％，再更优选超过50％。具有乙酰辅酶A合成酶活性的酶的实例为来源于酵母，例如面包酵母(例如从Sigma或Roche可得到)，来源于细菌，例如肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)，来源于高等动物，例如牛的心脏或鸽子的肝脏，或植物的乙酰辅酶A合成酶。
提到酸时，这是意指包括游离酸及其盐两者，或其混合物，例如金属盐或铵盐等。在本公开内容中酸通常是指以相应阴离子的形式，例如为丙烯酸盐或乙酸盐。
“(甲基)丙烯酰”指丙烯酰和/或甲基丙烯酰。本发明优选涉及制造甲基丙烯酰胆碱或尤其是丙烯酰胆碱(后者也可称为丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯的N-甲基化季盐)以及相应的前体，例如甲基丙烯酰辅酶A或尤其是丙烯酰辅酶A。
DMAE(M)A指丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯和/或甲基丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯。
本公开内容中提到胆碱、丙烯酰胆碱或甲基丙烯酰胆碱时，这是意指包括游离的“”离子(带有正电荷的氮)或带有相反离子的完全的盐形式，或适当时两者。
DMAE以及DMAE(M)A可以以游离形式和/或(酸加成)盐形式存在，提及DMAE、2-(N，N-二甲氨基)乙醇、DMAE(M)A或丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯或甲基丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯时包括其任何一种或两种形式。
例如，盐可以是方案II中提及的带有阴离子的盐，那些相应酸的酸加成盐。
本发明进一步优选的实施方案在本发明进一步优选的实施方案中，本发明涉及DMAEA、DMAEMA、丙烯酰胆碱(非常优选)和/或甲基丙烯酰胆碱(优选)的制造过程或方法，其包括在具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂存在的情况下DMEA和/或胆碱(优选)与丙烯酰辅酶A和/或甲基丙烯酰辅酶A在体外发生反应。可选择地，相应的过程或方法优选发生在体内。同样，相应的过程或方法优选部分发生在体外，部分发生在体内(例如其中首先在体内形成(甲基)丙烯酰辅酶A，随后(例如细胞破坏后)在体外在胆碱乙酰转移酶活性存在的情况下(甲基)丙烯酰辅酶A被用于合成DMEA(M)A和/或(甲基)丙烯酰胆碱，从而形成了本发明优选的实施方案。
本发明另一个优选的实施方案涉及所述过程或方法，其中具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂在生物内，尤其是(更优选至少在其部分生命周期内为单细胞)微生物，优选如上定义的GMO。在再一个进一步的实施方案中，所述生物是完整的(尤其是如上定义至少存活的)，在另一个实施方案中生物是破坏的或透化的。
再一优选的实施方案涉及上述任何过程或方法，其中具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂以至少部分纯化的形式存在。
在本发明的再一优选的实施方案中，上述过程或方法其中在能量提供物质，尤其是ATP，以及具有S-乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂存在的情况下通过使辅酶A与丙烯酸盐和/或甲基丙烯酸盐反应获得丙烯酰辅酶A和/或甲基丙烯酰辅酶A。优选地，两个反应发生在单罐内，优选在至少部分重叠的时间段内，最优选同时。可选择地，优选发生单罐反应，从而由具有S-乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂催化的反应首先发生并且利用具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂使可得到的产物((甲基)丙烯酰辅酶A)随后通过与游离的和/或盐形式的DMAE和/或(优选)胆碱盐反应而转化为DMAEA、DMAEMA、丙烯酰胆碱(非常优选)和/或甲基丙烯酰胆碱(优选)。
更优选的是上述和下述的所有过程和方法，其中生物催化剂是酶，尤其是多肽，其具有各自的活性。
再更优选的是上述和下述的任何过程或方法，其中(甲基)丙烯酰辅酶A由代谢产生，尤其是来自一个或多个来自生物量的原材料(尤其是如上所述)。
非常优选的是上述或下述的任何过程或方法，其中甲基丙烯酰辅酶A和/或(优选)丙烯酰辅酶A的产生代谢地发生(例如来自游离的甲基丙烯酸盐和/或丙烯酸盐或经其他代谢前体，例如乳酰辅酶A)，并且在胆碱和/或DMAE和/或盐形式的DMAE存在的情况下，或在每种情况下用于其生物合成的原材料来自生物量，利用具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂，通过优选在基因修饰生物(GMO)中进行向产物的转化，所述生物只要必要或需要，被修饰至含有所需生物催化活性，尤其是胆碱乙酰转移酶活性以及，需要时，转运蛋白。优选地，这个过程发生在体内。
关于用一个或多个核酸转化的GMO，所述核酸包含一个或多个编码并允许具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂表达的片段，本发明优选涉及此类GMO，其为昆虫，昆虫组织或优选昆虫组织；植物或植物组织；或优选(至少在其部分生命周期内为单细胞)微生物，尤其是原核的或真菌微生物，最优选细菌或酵母，其中包含一个或多个编码具有胆碱乙酰转移酶活性的片段的核酸是重组核酸。
更优选的是GMO，其进一步包含(优选重组的)核酸，所述核酸包含一个或多个编码一个或多个转运蛋白的片段，所述转运蛋白适于转运一种或多种用于生物催化DMAE(M)A(包括游离形式和/或其盐)和/或优选(甲基)丙烯酰胆碱合成的原材料进入所述微生物和/或转运DMAE(M)A和/或优选(甲基)丙烯酰胆碱离开所述微生物，所述转运蛋白尤其是DMAE和/或尤其是胆碱转运蛋白，更尤其是如上更详细定义的一种转运蛋白。
再更优选的是在上面任何一段所描述的GMO，其中进一步存在一个或多个核酸，所述核酸包含一个或多个编码具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂的片段，一个或多个(在一个优选的实施方案中也为重组的，在另一个实施方案中为内源的)核酸，所述核酸包含一个或多个编码并允许S-乙酰辅酶A合成酶表达的片段。
本发明尤其涉及为了合成丙烯酰-或甲基丙烯酰辅酶A以及DMAEA、DMAEMA、丙烯酰-或甲基丙烯酰胆碱的目的在实施例和/或其中所述的过程和反应条件中提及的酶的用途。
实施例下列实施例用于阐明本发明而不限制于其范围内。H-辅酶A指游离形式的辅酶A(具有SH基团)，辅酶A相应的基团通过-S-结合而没有氢。
实施例1在胆碱乙酰转移酶和S-乙酰辅酶A合成酶存在的情况下在体外合成丙烯酰胆碱a)补料分批制备丙烯酰辅酶A由丙烯酸盐和H-辅酶A在3.5ml体积中制备丙烯酰辅酶A的起始反应混合物在3.3g/100ml TRIZMA氢氯化物(三(羟甲基)氨基甲烷氢氯化物，Sigma)和0.49g/100ml TRIZMA碱中进行反应(37℃ pH 7.12)。反应混合物的其他成分如下
添加S-乙酰辅酶A合成酶(乙酸硫激酶来源于面包酵母，Sigma，Saint Louis，Missouri，美国；产品目录编号1765)(1.9mg/ml)。利用补料分批的方式即逐步地添加(给料)H-辅酶A，在5、10、15和20分钟后添加15μl等分试样的H-辅酶A，从而使H-辅酶A浓度每次升高1mM，并在25分钟后进一步添加5mM ATP。通过HPLC(使用仪器Agilent Technologies HP1090L带有HP1100可变波长UV检测器以及Chemstation(rev.A.06.01)数据系统；柱Luna C18来自Phenomenex，25cm×4.6mm内径，珠直径5μm(No.92)；流动相A25mM甲酸铵(pH 7.0)，B甲醇；梯度5％B 0分钟，随后到30％B 20分钟；流速1ml/分钟(大约130巴)，烘箱温度40℃，检测器UV于210nm；注射体积5μl，运行时间28分钟；在下列保留时间发现峰ATP在大约3.710分钟，辅酶A在大约10.554分钟，乙酰辅酶A在大约14.457分钟，丙烯酰辅酶A在大约17.500分钟，双加合物在大约15.993分钟)分析样品的H-辅酶A。当检测不到H-辅酶A时，80、95、110和120分钟后进一步添加15μl等分试样的H-辅酶A，从而将H-辅酶A浓度又每次升高1mM。145和155分钟后进一步添加15μl等分试样的H-辅酶A，并在150分钟后添加足够的ATP以将浓度升高5mM。
150分钟后添加了足够的H-辅酶A，这在没有反应发生时，将使反应混合物的浓度升高至10mM。到此时反应混合物中积累了浓度为1.52mM的丙烯酰辅酶A和0.47mM的双加合物并且利用上述HPLC法检测不到辅酶A。组合的丙烯酰辅酶A和双加合物混合物中丙烯酰辅酶A的相对量为76.5％。通过LC/MS使用内径为2.0mm的柱，流速为0.2ml/分钟，利用Finnigan LCQ质谱仪以电雾化电离方式确认丙烯酰辅酶A和双加合物的存在。
b)补料分批制备丙烯酰胆碱将1.6ml上述反应混合物的样品添加到22.4mg胆碱盐酸盐(100mM)中。反应混合物在37℃短暂温育并且通过添加4μl的2M NaOH将反应混合物的pH从pH 6.44调整为pH 7.25。取出0.3ml反应混合物的样品并添加40μl胆碱乙酰转移酶(重组的大鼠胆碱乙酰转移酶AG220批号2103 1042，Chemicon International Inc.，Temecula，California)。1.75小时和3小时后取样(0.5ml)。在带有数据系统软件AI-450 v3.3的Dionex DX-300离子层析仪上利用离子层析直接分析样品，其中使用带有IonPac CG12A Guard柱(4×50mm)的DionexIonPac CS12A阳离子交换柱(4×250mm)，流动相(v/v)90％的20mM甲基磺酸水溶液/10％的90％(v/v)乙腈水溶液，检测系统(抑制的电导率检测，阳离子自身再生抑制器(CSRS-Ultra)处于autosuppression external water wode，Dionex Corporation，Sunnyvale，California/美国)。
当反应混合物与胆碱乙酰转移酶一起温育1.75小时时，出现了一个峰(保留时间大约11-11.5分钟)，利用所述离子层析鉴别所述峰为丙烯酰胆碱。来自这个峰的丙烯酰胆碱估计浓度为0.14mM。因此估计的摩尔得率(基于起始的丙烯酰辅酶A)为35％。
权利要求
1.丙烯酰胆碱、甲基丙烯酰胆碱、丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯(DMAEA)和/或甲基丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯(DMAEMA)的制造方法，所述方法包括在具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂存在的情况下使胆碱和/或2-(N，N-二甲氨基)乙醇与丙烯酰辅酶A和/或甲基丙烯酰辅酶A反应。
2.根据权利要求1的方法，其在体外进行。
3.根据权利要求1的方法，其在体内进行。
4.根据权利要求1的方法，其部分在体内且部分在体外进行。
5.根据权利要求1的方法，其中所述生物催化剂在生物内，尤其是(更优选至少在其部分生命周期内为单细胞)微生物。
6.根据权利要求5的方法，其中所述生物是完整的。
7.根据权利要求5的方法，其中所述生物是破坏的。
8.特别根据权利要求1、2、4或7的方法，其中具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂以至少部分纯化的形式存在。
9.根据权利要求1-8中任何一项的方法，其中在能量提供物质，尤其是ATP，以及具有S-乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂存在的情况下，通过使辅酶A与丙烯酸盐和/或甲基丙烯酸盐反应获得丙烯酰辅酶A和/或甲基丙烯酰辅酶A。
10.根据权利要求9的方法，其中由具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂催化的反应和由具有S-乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂催化的反应发生在单罐内，优选在至少部分重叠的时间段内，最优选在相同的时间段内。
11.根据权利要求10的单罐方法，其中由具有S-乙酰辅酶A合成酶活性的生物催化剂催化的反应首先发生，而可得的产物利用具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂随后转化为丙烯酰-和/或甲基丙烯酰胆碱。
12.根据权利要求1-11中任何一项的方法，其中所述生物催化剂是酶，尤其是具有各自活性的多肽。
13.根据权利要求1-12中任何一项的方法，其中(甲基)丙烯酰辅酶A前体由代谢产生，尤其是来自一个或多个来自生物量的前体。
14.根据权利要求1-13中任何一项的方法，其中甲基丙烯酰辅酶A和/或(优选)丙烯酰辅酶A由代谢产生，并且在胆碱和/或DMAE和/或盐形式的DMAE存在的情况下，或在每种情况下用于其生物合成的原材料来自生物量，利用具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂，通过优选在基因修饰生物(GMO)中进行向产物的转化，所述生物只要必需或需要，被修饰至包含所需的生物催化活性以及，如果需要，转运蛋白。
15.基因修饰生物(GMO)，其用一个或多个核酸转化，所述核酸包含一个或多个编码并允许具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂表达的片段。
16.根据权利要求15的GMO，其是昆虫、昆虫组织或昆虫细胞；植物或植物组织；或优选(至少在其部分生命周期内为单细胞)微生物，尤其是原核的或真菌微生物，最优选细菌或酵母，其中包含一个或多个编码具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂的片段的核酸是重组核酸。
17.根据权利要求15或16中任何一项的GMO，其进一步包含(优选重组的)核酸，所述核酸包含一个或多个编码一个或多个转运蛋白的片段，所述转运蛋白适于转运一种或多种用于生物催化DMAE(M)A(包括游离形式和/或其盐)和/或优选(甲基)丙烯酰胆碱合成的原材料进入所述微生物和/或转运DMAE(M)A和/或优选(甲基)丙烯酰胆碱离开所述微生物。
18.根据权利要求17的GMO，其中转运作为(甲基)丙烯酰胆碱原材料的胆碱的转运蛋白是胆碱转运蛋白。
19.根据权利要求15-18中任何一项的GMO，其中进一步存在一个或多个核酸，所述核酸包含一个或多个编码具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂的片段，一个或多个核酸，所述核酸包含一个或多个编码并允许S-乙酰辅酶A合成酶表达的片段。
20.根据权利要求15-19中任何一项的GMO在制造DMAEA、DMAEMA、丙烯酰胆碱和/或甲基丙烯酰胆碱中的用途，其包括向所述微生物的培养物施用一个或多个适当的来自生物量的原材料以及分离所得到的产物。
21.具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂在实现甲基丙烯酰和/或丙烯酰部分从甲基丙烯酰和/或丙烯酰辅酶A到2-(N，N-二甲氨基)乙醇，或其盐，和/或胆碱的转移中的体外和或体内用途。
全文摘要
合成丙烯酸和/或甲基丙烯酸的2－(N，N－二甲氨基)乙醇酯和/或胆碱酯的生物催化方法，即丙烯酰胆碱和/或甲基丙烯酰胆碱的制造方法或过程，其包括在具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂存在的情况下，使2－(N，N－二甲氨基)乙醇和/或胆碱与丙烯酰辅酶A和/或甲基丙烯酰辅酶A反应，其中优选在能量提供物质以及具有S－乙酰辅酶A合成酶活性(乙酰辅酶A合成酶活性)的生物催化剂存在的情况下，通过使丙烯酸盐和/或甲基丙烯酸盐与辅酶A反应形成丙烯酰辅酶A和/或甲基丙烯酰辅酶A；涉及(特别是转化的，即基因修饰的)具有胆碱乙酰转移酶的活性并优选另外具有乙酰辅酶A合成酶活性的生物及其在所述过程或方法中的用途；涉及为了制造(甲基)丙烯酸2－(N，N－二甲氨基)乙酯和/或(甲基)丙烯酰胆碱，具有胆碱乙酰转移酶活性的生物催化剂在实现(甲基)丙烯酰部分从(甲基)丙烯酰辅酶A到2－(N，N－二甲氨基)乙醇和/或胆碱的转移中的用途；以及涉及如说明书中所述进一步的用途、生物、过程和方法。
文档编号C12P13/00GK1934262SQ200580008738
公开日2007年3月21日 申请日期2005年3月9日 优先权日2004年3月19日
发明者J·休斯, K·C·赛姆斯 申请人:西巴特殊化学水处理有限公司