酶的除去方法和使用该方法的磷脂的碱交换方法或水解方法

专利名称：酶的除去方法和使用该方法的磷脂的碱交换方法或水解方法
技术领域：
本发明涉及将磷脂的改性或合成磷脂的制造中使用的酶从反应液中分离·除去的方法、以及使用该方法的磷脂的碱交换方法(即碱交换方法)和磷脂的水解方法。
背景技术：
磷脂的水解或碱交换反应，通常在酶的存在下，在适当的溶剂中进行。在这些反应中，通常，通过加热等使酶失活，从而使反应停止。例如，在特开平2-273536号公报中，公开了利用脂肪酶或磷脂酶A2(以下称为PLA2)对磷脂酸衍生物进行处理，通过部分水解来制造溶血磷脂的方法。在该方法中，在适当的时间对反应混合物进行加热，使酶失活，将反应中止。在特开2001-186898号公报中，公开了使用磷脂酶D(以下称为PLD)在酰基甘油磷脂和丝氨酸之间进行磷脂酰基交换反应，制造磷脂酰丝氨酸的方法。在该方法中，在反应后，例如通过加热或醇变性(alcohol denaturation)等处理，使酶失活。在特开2003-319793号公报中，公开了使用PLD的酰基甘油磷脂的磷脂酰基交换反应。在该反应中，在上述交换反应后，通过加热等处理，使PLD失活。
但是，根据特开昭63-233750号公报，由于磷脂酶耐热性强，所以，例如，即使在95℃下进行30分钟左右加热处理也不会充分失活。由于磷脂酶没有充分失活，所以，例如，有可能产生与磷脂共存的油脂等被水解而产生异臭等品质上的问题。该文献进一步记载有在使加热温度为100℃以上、例如约120℃下使其失活时，存在容易引起磷脂或由磷脂酶的处理而产生的游离脂肪酸的劣化的问题。为了解决这样的问题，在特开昭63-233750号公报中公开了在用磷脂酶对含有磷脂的原料进行处理之后，用蛋白酶对该磷脂酶进行处理，接着加热该蛋白酶以使其失活的方法。
此外，在特开2003-93086号公报中，暗示了蛋白质、肽、酶等能够成为变态反应(allergy)的原因。在该公报中进一步记载有在特开昭63-233750号公报中记载的方法中，作为分解生成物的肽和蛋白酶以原样残留，会引起变态反应等，很明显会在安全上存在问题。为了解决这样的问题，在特开2003-93086号公报中，公开了用磷脂酶对含有磷脂的原料进行处理，接着用蛋白酶进行处理，接着除去蛋白质、肽和酶的方法。作为除去蛋白质等的方法，例示有使用助滤剂的过滤、使用吸附剂的处理等。据记载，使用完的吸附剂，可以通过使用助滤剂的过滤而除去。该方法能够除去蛋白质等，但是，需要反应后的过滤、吸附等处理，所以存在工序复杂化的问题。
此外，在特开2002-193982号公报中，公开了在酶反应液中添加极性有机溶剂，利用水提取从有机溶剂中的磷脂酰丝氨酸溶液中除去亲水性杂质、蛋白质和无机盐的方法。据记载，利用该方法，磷脂酰丝氨酸溶液中的PLD的活性可达到检出极限(0.1IU/g)以下，但对于该溶液中的蛋白含量，完全没有记载。

发明内容
本发明人在使用酶的磷脂的水解反应或碱交换反应中，使用上述的各种方法实际地对酶失活进行研究。但是，在任一种方法中，虽然酶活性下降，但是均无法得到满意的结果(参照以下的比较例1～7)。
因此，本发明人对从酶反应液中进一步有效地除去残留酶活性的方法反复进行潜心研究，结果发现，通过用含有无机金属盐的、水和有机溶剂的混合溶剂对利用酶反应后的液体(以下称为“酶反应液”)进行清洗，能够有效地除去酶反应液中残留的酶活性，并且能够减少蛋白含量，从而完成本发明。
本发明提供一种从磷脂的水解反应或碱交换反应中使用的酶反应液中除去酶的方法，该方法包括利用含有无机金属盐的、水和有机溶剂的混合溶剂对该酶反应液进行处理，将该酶除去的工序。
此外，本发明还提供一种磷脂的碱交换方法，该方法包括使磷脂与选自醇类、糖类和含有羟基的环状化合物中的具有醇式羟基的化合物，在能够将磷脂中的碱转移到该化合物中的酶的存在下发生反应，得到酶反应液的工序；和利用含有无机金属盐的、水和有机溶剂的混合溶剂对该酶反应液进行处理，将该酶除去的工序。
此外，本发明还提供一种磷脂的水解方法，该方法包括在水的存在下，使磷脂与能够将磷脂水解的酶进行反应，得到酶反应液的工序；和利用含有无机金属盐的、水和有机溶剂的混合溶剂对该酶反应液进行处理，将该酶除去的工序。
在一个实施方式中，上述无机金属盐是选自氯化钠、硫酸钠、氯化钾、氯化钙、和硫酸镁中的至少一种金属盐。
在另一实施方式中，上述有机溶剂是极性溶剂。
此外，在另一实施方式中，上述极性有机溶剂是选自丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、和甘油中的至少一种溶剂。
此外，在一个不同的实施方式中，上述混合溶剂含有30～70容量％的水和70～30容量％的有机溶剂，该混合溶剂中含有5～25质量/容量％的上述无机金属盐。
具体实施例方式
以下，首先，说明利用酶进行的磷脂的碱交换方法和水解方法，接着，说明从它们的酶反应液中除去酶的方法。
A.利用酶的磷脂的碱交换方法本发明的磷脂的碱交换方法，包括使磷脂与选自醇类、糖类、和具有羟基的环状化合物中的受体醇，在能够将磷脂的碱转移到该醇化合物中的酶的存在下进行反应，得到酶反应液的工序；和利用含有无机金属盐的、水和有机溶剂的混合溶剂对该酶反应液进行处理，将该酶除去的工序。在此，首先说明通过碱交换反应得到酶反应液的工序。
A-1原料磷脂作为本发明中使用的磷脂(原料磷脂)，没有特别的限制，可举出磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)、和磷脂酰甘油(PG)等。
作为原料磷脂，除了这样精制的化合物以外，还可使用含有它们的化合物的蛋黄磷脂、大豆磷脂、菜籽磷脂、鱼贝类磷脂等。例如，在蛋黄磷脂中，含有73.0％的PC、15.0％的PE、和0.6％的PI。此外，大豆磷脂中含有38.2％的PC、17.3％的PE、和16.0％的PI(均参照“新食品功能材料的开发”，太田明主编，CMC出版社，1996年)。因此，含有这些化合物的来自天然物质的磷脂，作为起始材料是有用的。
上述的蛋黄磷脂、大豆磷脂、菜籽磷脂、鱼贝类磷脂等，也可以不进行高度精制。例如，即使在将除了磷脂以外还含有蛋白质、脂质、多糖、盐等成分的粗提取物或粗精制物作为起始原料的情况下，只要以不阻碍酶反应的量含有这些成分，就可以作为原料磷脂使用。此外，通过化学作用或者酶作用合成的PC或PE等，也可以作为原料磷脂使用。
A-2具有醇式羟基的化合物本发明中使用的具有醇式羟基的化合物，在磷脂的碱交换中，被用作酰基甘油磷脂的磷脂酰基等碱部位的受体。作为具有醇式羟基的化合物，可举出醇类、糖类、和具有羟基的环状化合物等。
作为醇类，包括一元醇、多元醇(包括二元醇和三元醇，也指多元醇类)、含氮醇等。作为一元醇，可举出甲醇、乙醇、丙醇等；作为多元醇，可举出甘油、乙二醇、丙二醇等。抗坏血酸也被包含在醇类中。作为含氮醇，例如可举出丝氨酸等氨基酸、1-氨基-2丙醇等。
作为糖类，包括葡萄糖等单糖、以蔗糖等二糖为首的低聚糖、N-乙酰基-D-氨基葡萄糖等。此外，还可举出具有核糖或脱氧核糖等糖的腺苷、鸟苷、肌苷、黄苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷等核苷酸等。
作为具有羟基的环状化合物，例如可举出曲酸、熊果苷等。
A-3酶作为本发明的磷脂的碱交换方法中使用的酶，可举出PLD等。
作为PLD，可举出来自植物的PLD，例如来自甘蓝或花生的PLD。此外，可举出来自属于链霉菌(Streptomyces)属的微生物的PLD。其中，优选使用Streptomyces cinnamoneum生产的PLD。该微生物生产的PLD，分子量约54,000，最适pH约5～6，最适温度约40～60℃(Chiaki Ogmo等，J.Biol.Chem.，125卷，263-269页(1999))。
此外，使PLD的生产株的生产率提高后的变异株本身，和将从上述微生物分离出的PLD基因导入同种或不同种宿主中从而使PLD的生产率提高的重组微生物本身，以及来自它们的PLD，也可用于本发明。
A-4碱交换反应碱交换反应，通过使原料磷脂与具有醇式羟基的化合物(以下有时也称为受体醇)在具有碱交换活性的酶(PLD)的存在下发生反应而进行。
原料磷脂与受体醇的摩尔比，没有特别的限制，可以根据原料磷脂和受体醇的种类适当决定。通常，受体醇/原料磷脂(摩尔比)优选为0.001～200左右。例如，在PE的情况下，受体醇/PE(摩尔比)通常优选为0.01～100。
在碱交换反应中，酶的使用量没有特别的限制，可以根据原料磷脂、受体、和酶的种类来决定。例如，在PLD的情况下，对于1g的PE，可以使用20～8000单位的范围。其中，该酶活性的1单位，是以95％来自大豆的PC(磷脂提取物Phosphatide Extract，Soybean(Granules)Avanti Polar Lipid Inc.公司生产)作为基质，在基质浓度0.16％的40mM乙酸缓冲溶液(pH5.5、1mM的CaCl2、含有0.3％的Triton X-100)中、在37℃下进行反应时，1分钟释放1μmol胆碱的酶的量。
在碱交换反应中，可以使用水类溶剂、有机溶剂、和水类溶剂与有机溶剂的混合溶剂作为反应用溶剂。所谓反应用水类溶剂，是指水和/或水性的缓冲溶液。作为水，优选使用离子交换水、精制水、或蒸馏水，但也可以使用自来水。作为水性的缓冲溶液，例如，优选使用pH4～6的乙酸缓冲溶液、pH7～8的磷酸缓冲溶液等。作为反应用有机溶剂，可举出正庚烷、正己烷、石油醚等脂肪族烃；环戊烷、环己烷等环状脂肪族烃；二乙醚、四氢呋喃等醚类；乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯类；四氯化碳、氯仿等卤化烃类。反应用有机溶剂，可以单独使用，或者可以将2种以上混合使用。可以在这些反应用水类溶剂或反应用有机溶剂中，进一步并用促进碱交换反应的溶剂、例如丙酮等。
在反应中使用水类溶剂和有机溶剂的混合溶剂的情况下，混合比可以根据使用的有机溶剂的种类适当选择。混合比率没有特别的限制，通常，为了抑制作为副反应的磷脂的碱(磷脂酰基)的水解反应并有效地进行目标的碱(磷脂酰基)的交换反应，优选在反应体系内的水类溶剂的含量为10容量％以下进行。
上述酶反应中使用的磷脂的量，根据反应溶剂的容量，优选为1～50％(w/v)，更优选为5～30％(w/v)。磷脂的量超过50％(w/v)时，会有溶解有原料磷脂的溶液的粘度变高，导致反应效率降低的情况，相反，小于1％(w/v)时，一次处理能够得到的磷脂的量非常少，处理效率变差。
碱交换反应的温度，优选为10～70℃，更优选为25～50℃。反应所需时间，随着酶的量和反应温度而改变，大致为0.5～48小时。在本发明的方法中，考虑到磷脂的分散性，而且，考虑到反应用混合溶剂为水层和有机溶剂层的两相系统的情况下的混合性，优选适当进行搅拌、振动等分散方法。
通过上述反应，进行磷脂的碱交换，生产出与受体醇的种类对应的磷脂。例如，在使用甘油作为醇的情况下，生产出磷脂酰甘油(PG)，在使用丝氨酸作为醇的情况下，生产出磷脂酰丝氨酸(PS)。
接着，从该酶反应液中除去酶、精制反应生成物，对于除去酶的工序，将在“D.从酶反应液中除去酶的方法”中说明。
B.利用酶的磷脂的水解反应本发明的磷脂的水解方法，包括在水的存在下，使磷脂与能够将磷脂水解的酶进行反应，得到酶反应液的工序；和用含有无机金属盐的、水和有机溶剂的混合溶剂对该酶反应液进行处理，除去该酶的工序。在此，首先说明通过水解得到酶反应液的工序。
B-1原料磷脂水解中使用的原料磷脂可使用上述A-1中记载的磷脂。
B-2酶磷脂的水解中使用的酶，只要是能够将磷脂的脂肪酸部位和/或碱部位水解的酶即可，没有特别的限制。作为这样的酶，可举出脂肪酶、磷脂酶A1(以下称为PLA1)、PLA2、磷脂酶B(以下称为PLB)、磷脂酶C(以下称为PLC)、PLD、鞘磷脂酶等。
作为PLD，可使用上述A-3中记载的PLD。
作为PLA2，可举出来自动物的PLA2(例如，来自猪胰脏的PLA2)。此外，可举出来自微生物的PLA2(例如，来自属于链霉菌属的微生物的PLA2)等。
作为PLA1、PLB、PLC、和脂肪酶，可举出来自微生物的脂肪酶，例如来自属于曲霉菌属(Aspergillus)、链霉菌(Streptomyces)属等的微生物的磷脂酶和脂肪酶。
此外，使上述酶的生产株的生产率提高后的变异株本身，和将从上述微生物分离出的酶的基因导入同种或不同种宿主中从而使该种酶的生产率提高的重组微生物本身，以及来自它们的酶，也可用于本发明。
B-3水解反应水解反应通过使水解酶与原料磷脂在水的存在下发生作用而进行。对于磷脂的水解反应中的磷脂与水的摩尔比，没有特别的限制。相对于1摩尔的磷脂，适宜使用0.01～100倍摩尔的水。
在水解反应中，酶的使用量没有特别的限制，可以根据原料磷脂和酶的种类适当决定。例如，在PLD的情况下，与上述的A-4同样，例如，相对于1g的PE，可以使用20～8000单位的范围。
在PLA2的情况下，例如，相对于1g的PE，可以使用20～8000单位的范围。PLA2的1单位，是以来自大豆的糊状卵磷脂(P-3644Sigma PC含量40％)作为基质，在基质浓度1.25％的25mM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0、2.5mM的CaCl2、含有0.002％的Triton X-100)中、在37℃下进行反应时，1分钟释放1μmol脂肪酸的酶的量。
在脂肪酶的情况下，相对于1g的PE，可以使用20～50000单位的范围。脂肪酶的1单位，是以将橄榄油、2％PVA和MaIlvaive缓冲溶液(pH7.0)按照容量比2∶3∶1混合、乳化后的物质作为基质，相对于4ml基质，混合1ml脂肪酶稀释液，在37℃下反应60分钟时，释放出相当于1μmol油酸的酸的酶量。
作为水解反应中使用的反应溶剂，可以使用与上述A-4的碱交换反应中记载的物质相同的水类溶剂、或者水类溶剂与有机溶剂的混合溶剂。若考虑磷脂在水中的溶解性，则优选使用水类溶剂与有机溶剂的混合溶剂。此外，作为水类溶剂，优选使用pH7～9的Tris-HCl缓冲溶液等。
在使用水类溶剂与有机溶剂的混合溶剂的情况下，混合比可以根据使用的有机溶剂的种类适当选择。水类溶剂与有机溶剂的容量比没有特别的限制，从促进水解反应的方面考虑，优选使反应体系内的水类溶剂的含量为10容量％以上。
上述酶反应中使用的磷脂的量，根据反应溶剂的容量，优选为1～50％(w/v)，更优选为5～30％(w/v)。磷脂的量超过50％(w/v)时，会有溶解有原料磷脂的溶液的粘度变高，导致反应效率降低的情况，相反，小于1％(w/v)时，一次处理能够得到的磷脂的量非常少，处理效率变差。
水解反应的温度因使用的酶的物理化学性质而不同。例如，在使用来自动物的PLA2的情况下，优选为10～70℃、更优选25～50℃。反应所需时间，随着目标反应、酶的量和反应温度而改变，大致为0.5～48小时。在本发明的方法中，考虑到磷脂的分散性，而且，考虑到使用水类溶剂和有机溶剂的混合溶剂的情况下的水类溶剂和有机溶剂的混合性，优选适当进行搅拌、振动等分散方法。
通过上述反应，进行磷脂的水解，从磷脂酰胆碱(PC)生产出溶血磷脂酰胆碱(LPC)，从磷脂酰乙醇胺(PE)生产出溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)，或者从PC或PE生产出磷脂酸(PA)。
接着，从该酶反应液中除去酶、精制反应生成物，对于除去该酶的工序，将在以下的“D.从酶反应液中除去酶的方法”中说明。
C.酶除去前的酶反应液的处理上述A.碱交换方法或B.水解方法中得到的酶反应液，是(1)含有有机溶剂的体系或(2)水体系中的任一个。分别在各体系中，对酶除去前的酶反应液的处理，记载如下。
(1)含有有机溶剂的体系在酶反应液仅为有机溶剂的体系的情况下，可以直接进行酶除去。
在酶反应液为有机溶剂和水类溶剂的混合溶剂体系的情况下，有机溶剂和水类溶剂可以分离时，优选预先除去水类溶剂。但是，在机溶剂和水类溶剂不能较好地分离的情况下，或者有机溶剂和水类溶剂成为乳化状态的情况下，可以不除去水类溶剂而直接进行酶除去。
(2)水体系在酶反应液是水体系的情况下，优选添加提取用有机溶剂、进行溶剂分馏、除去分馏出的水类溶剂。在此，提取用有机溶剂可以使用作为上述A-4中记载的反应用有机溶剂而列举的有机溶剂。但是，在该情况下，在提取用有机溶剂与水类溶剂的分离较差时，或提取用有机溶剂与水类溶剂成为乳化状态时，也可以不除去水类溶剂而直接进行酶除去。
D.从酶反应液中除去酶的方法从上述C.中得到的酶反应液中除去酶的方法，包括用含有无机金属盐的、水和有机溶剂的混合溶剂(以下，简称为清洗用混合溶剂)，对酶反应液进行处理，将酶除去的工序。
上述C.中得到的酶反应液中，含有酶、原料磷脂、反应生成物、以及水类溶剂和/或有机溶剂。本发明的特征在于，通过使用含有无机金属盐的、水和有机溶剂的混合溶剂对这些酶反应液进行处理，将酶除去。
D-1.无机金属盐作为本发明中使用的无机金属盐，可举出一价金属的无机盐、二价金属的无机盐或多价金属的无机盐。
作为一价金属的无机盐，优选使用碱金属的无机盐、无机铵盐等。作为碱金属，优选使用钠(Na)、钾(K)、锂(Li)，最优选钠。作为与碱金属或氨形成盐的无机化合物，优选使用盐酸、硫酸、碳酸等。作为一价的无机金属盐，例如，优选使用氯化钠(NaCl)、硫酸钠(Na2SO4)、氯化钾(KCl)、硫酸钾(K2SO4)等。
作为二价或多价的无机金属盐，可使用碱土类金属等。优选使用镁(Mg)、钙(Ca)等，作为它们的无机金属盐，例如，可使用氯化镁(MgCl2)、硫酸镁(MgSO4)、氯化钙(CaCl2)、硫酸钙(CaSO4)等。
无机金属盐可以单独使用，或者可以将2种以上组合使用。
D-2清洗用有机溶剂在酶的除去中使用的有机溶剂(清洗用有机溶剂)，只要具有极性，就没有特别的限制。优选使用醇(尤其是低级醇)、丙酮等。作为低级醇，可使用碳原子数1～7的醇，尤其优选使用甲醇、乙醇、异丙醇和甘油。
有机溶剂可以单独使用，或者可以将2种以上组合使用。
D-3含有无机金属盐的、水和有机溶剂的混合溶剂(清洗用混合溶剂)通常，水和有机溶剂按照容量比1∶9～9∶1的比例、优选3∶7～7∶3的比例、更优选4∶6～6∶4的比例混合。
无机金属盐在该混合溶剂中含有3～25质量/容量％(以下记为w/v％)、优选5～20w/v％、更优选5～10w/v％此外，该清洗用混合溶剂的制作方法没有特别的限制。例如，可以预先调制适当浓度的无机金属盐水溶液、再与适当量的有机溶剂混合进行调制。或者，可以在水和有机溶剂的混合溶剂中添加适当量的无机金属盐。具体地说，例如，可举出丙酮与含有15w/v％的NaCl的水溶液的1∶1(v/v)混合溶液(含有7.5w/v％的NaCl的50v/v％丙酮-水混合溶剂)等。同样，可举出含有7.5w/v％的NaCl的50v/v％乙醇-水混合溶剂、含有7.5w/v％的NaCl的50v/v％异丙醇-水混合溶剂、含有7.5w/v％的NaCl的50v/v％甲醇-水混合溶剂等。不言而喻，这些仅是例示。
D-4酶反应液的处理所谓酶反应液的处理，是指利用清洗用混合溶剂对上述C.中得到的酶反应液进行清洗。在将该酶反应液与清洗用混合溶剂充分混合后，通过静置或离心分离，将清洗用混合溶剂分离、除去，由此进行清洗。
清洗用混合溶剂可以添加上述C.中得到的酶反应液的容积的1/10以上的比例。若考虑到处理效率，则使用的清洗用混合溶剂的量，优选为酶反应液的容积的3/10～3/1(v/v)，更优选为5/10～1/1(v/v)。
清洗后，回收含有磷脂的有机溶剂相。根据需要，可以利用清洗用混合溶剂反复进行处理。
利用清洗用混合溶剂对酶反应液进行的处理，除了上述那样在酶反应物中添加预先调制的混合溶剂的方法以外，也可以采用将无机金属盐、水、和有机溶剂按照上述规定的添加量直接添加到酶反应物中的方法。这些成分的添加顺序没有特别的限制。或者，可以在酶反应物中加入含有规定量的无机金属盐的水溶液和有机溶剂。即，只要最终酶反应物中含有上述规定量的混合溶剂即可。
此外，在酶反应液本身含有作为清洗用混合溶剂的组分的上述无机金属盐、水、或极性溶剂时，可以利用其作为清洗用混合溶剂的组成物。
在由该清洗得到的含有磷脂的有机溶剂相中含有作为清洗用溶剂组分的无机金属盐的情况下，通过进一步用水和极性有机溶剂的混合液进行清洗，能够容易地除去该无机金属盐。
E.反应生成物的回收利用本领域技术人员通常使用的方法，从上述D.中得到的含有磷脂的有机溶剂相中回收目标生成物。例如，可通过利用能够溶解反应生成物的有机溶剂进行提取、接着在减压下除去有机溶剂等方法进行回收，根据需要，可进行精制。得到的生成物，完全不含有反应中使用的酶，或者酶含量极低，所以可稳定地保存。
实施例以下，通过实施例进一步具体地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
<分析方法>
(反应的确认)在以下的调制例中，利用以下方法确认反应的进行。取一部分反应液，在减压下蒸馏除去全部溶剂，将干燥物溶解在氯仿∶乙腈＝7∶3的混合物中，利用下述条件的高速液相色谱法(以下称为HPLC法)检测生成物的PS和PA、LPA。
使用的柱GL Sciences制Unisil Q NH2(内径4.6mm×25cm)移动相乙腈∶甲醇∶10mM磷酸二氢铵＝619∶291∶90(v/v/v)流速1.3ml/min柱温度37℃检测UV205nm(酶活性的定义和测定方法)以下的调制例和研究例中使用的酶活性，分别如下述进行定义。此外，取一部分磷脂，在减压下蒸馏除去全部溶剂，利用下述方法测定得到的卵磷脂，以每1g卵磷脂的活性来表示残留酶活性。
磷脂酶D(PLD)以95％来自大豆的磷脂酰胆碱(PC)(磷脂提取物PhosphatideExtract，Soybean(Granules)，Avanti Polor Lipid Inc.生产)作为基质，在基质浓度0.16质量％的40mM乙酸缓冲溶液(pH5.5、1mM的CaCl2、含有0.3％的Triton X-100)中、在37℃下进行反应，测定酶活性，以1分钟释放1μmol胆碱的酶的量作为1U。
磷脂酶A2(PLA2)以来自大豆的糊状卵磷脂(P-3644 Sigma PC含量40％)作为基质，在基质浓度1.25wt％的25mM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0、2.5mM的CaCl2、含有0.002％的Triton X-100)中、在37℃下进行反应。以1分钟释放1μmol脂肪酸的酶的量作为1U。
脂肪酶以将橄榄油、2％PVA和McIlvaine缓冲溶液(pH7.0)按照容量比2∶3∶1混合·乳化后的物质作为基质，相对于4ml基质，混合1ml脂肪酶稀释液，在37℃下反应60分钟。以释放出相当于1μmol油酸的酸的酶量作为1U。
蛋白酶在5ml的0.6％乳酪蛋白(pH7.5、0.04M磷酸缓冲溶液)中加入1ml的酶溶液，在30℃下反应10分钟。以每分钟释放相当于1μg酪氨酸的Folin显色(Folin’s color)作为TCA可溶性成份的活性作为1U。
(残留蛋白质的定量)在减压下除去溶剂后，使磷脂馏分(fraction)溶解在氯仿中，进行离心分离，将蛋白质作为氯仿不溶物回收。回收的蛋白质再用氯仿清洗数次后，在减压下除去氯仿，供给蛋白质定量。蛋白质的定量使用Protein Quantification Kit-Wide range(Dojindo MolecularTechnologies，Inc.)以牛血清清蛋白作为标记物进行定量。
<反应液的调制>
(调制例1碱交换反应后的酶反应液的调制)将卵磷脂(SLP-PI粉末，辻制油生产)和丝氨酸溶解在己烷/丙酮/0.2M乙酸缓冲溶液(pH4.0)以78/14/8(容量比)的比例混合的两相系统的混合溶剂中，使得卵磷脂∶丝氨酸＝1∶7～1∶10(重量比)，添加PLD(PLD Nagase(Nagase ChemteX公司生产))，在30℃下一边搅拌一边反应5小时，生成磷脂酰丝氨酸(PS)。此外，反应的进行由上述的HPLC法确认。
反应结束后，静置，分离成有机溶剂相和水相两相，回收含有PS的有机溶剂。以下，将含有该PS的有机溶剂称为磷脂馏分I。
(调制例2水解反应后的酶反应液的调制-1)将卵磷脂(Ultralec PADM公司生产)以5～25％分散在0.2M乙酸缓冲溶液(pH5.5)中，添加PLD(PLD Nagase(Nagase ChemteX公司生产))，在50℃下一边搅拌一边反应16小时，生成磷脂酸(PA)。以下，将含有该PA的水类溶剂称为磷脂馏分II。此外，反应的进行由上述的HPLC法确认。
(调制例3水解反应后的酶反应液的调制-2)取上述调制例2中得到的磷脂馏分II的一部分，添加该磷脂馏分的2倍容量的庚烷/丙酮＝1∶2(v/v)的混合溶剂，搅拌后，除去水类溶剂，回收含有PA的有机溶剂相。以下，将含有该PA的水类溶剂称为磷脂馏分III。
(调制例4水解反应后的酶反应液的调制-3)在上述调制例3中得到的磷脂馏分III中，加入0.1M的Tris-HCl(pH8.0，含有40mM CaCl2)作为水类溶剂，添加PLA2(PLA2 Nagase(Nagase ChemteX公司生产))，在30℃下一边搅拌一边反应16小时，生成溶血磷脂酸(LPA)。此外，反应的进行由上述的HPLC法确认。反应结束后，静置，分离水类溶剂，回收含有LPA的有机溶剂相。以下，将含有该LPA的有机溶剂相称为磷脂馏分IV。
(调制例5水解反应后的酶反应液的调制-4)在上述调制例3中得到的磷脂馏分III中，加入0.1M的Tris-HCl(pH8.0，含有40mM CaCl2)作为水类溶剂，添加脂肪酶(LilipaseA-10(Nagase ChemteX公司生产))，在30℃下一边搅拌一边反应16小时，生成LPA。此外，反应的进行由上述的HPLC法确认。反应结束后，静置，分离水类溶剂，回收含有LPA的有机溶剂相。以下，将含有该LPA的有机溶剂相称为磷脂馏分V。
(调制例6蛋白酶处理后的酶反应液的调制)在含有生成物PA和酶PLD的磷脂馏分II中，以每1g卵磷脂20U添加蛋白酶(商品名Bioprase conc.(Nagase ChemteX公司生产))，在60℃下搅拌1小时后，回收含有PA的水类溶剂。以下，将含有该PA的水类溶剂称为磷脂馏分VI。
各磷脂馏分(I～VI)中的残留PLD活性和残留PLA2活性为每1g卵磷脂10～60U。以后，使用上述的磷脂馏分I～VI，实施以下的比较例和研究例。
<利用现有方法进行的酶失活的研究>
(比较例1利用加热处理进行的PLD除去的研究)将上述调制例1中得到的磷脂馏分I在表1记载的温度下进行15小时加热处理，测定PLD的残留活性。其中，PLD的残留活性利用上述的方法测定。将结果示于表1。
表1

从表1的结果可知，通过15小时的加热处理，PLD活性下降，但是，活性残留一半以上。由此可推测，PLD在卵磷脂存在下对热非常稳定。此外，通过加热，PS的酸值和过氧化物值上升，生成的PS被热分解。因此可知，加热处理不可能是PLD失活的有效手段。
(比较例2利用蛋白酶处理进行的PLD除去的研究-1)将表2记载的各种蛋白酶以每1g卵磷脂20U的比例加入磷脂馏分I中，在60℃下一边搅拌1小时一边进行反应，残留PLD活性利用上述的方法测定。将结果示于表2。
表2

从表2的结果可知，在有机溶剂中进行蛋白酶处理的情况下，PLD的活性几乎不降低。
(比较例3利用蛋白酶处理进行的PLD除去的研究-2)可以认为，由于上述比较例2的蛋白酶处理在有机溶剂中进行，所以，利用蛋白酶的PLD蛋白质的水解反应没有进行。因此，取一部分磷脂馏分I，在减压下除去有机溶剂后，使其分散在水中，再次进行利用蛋白酶的处理(蛋白酶的添加量每1g卵磷脂5U，60℃，1小时)。将结果示于表3。使用的蛋白酶的活性，利用上述的方法测定。
表3

在该条件的蛋白酶处理中，PLD失活大约一半左右，可知不能得到充分的PLD失活效果。
(比较例4利用丙酮处理进行的PLD除去的研究)在磷脂馏分I中添加丙酮，使PLD变性·凝集，过滤后，测定残留PLD活性。将结果示于表4。
表4

从表4的结果可知，通过丙酮处理，PLD活性稍微降低。增加丙酮的量时，PLD处于降低的趋势。但是，添加磷脂馏分I的容量的6/10量以上的丙酮时，由于原料卵磷脂沉淀，所以不优选。此外，通常酶本身对丙酮等有机溶剂的耐性低，但从该结果可推测，在卵磷脂的存在下，PLD的溶剂耐性提高。
(比较例5利用NaCl水溶液清洗进行的PLD除去的研究)用NaCl水溶液对磷脂馏分I进行清洗后，测定残留PLD活性。将NaCl水溶液的浓度和使用量、以及结果示于表5。所谓清洗是指在磷脂馏分I中加入NaCl水溶液后，进行搅拌使得充分混合后，通过离心分离或静置将水相分离并除去。在以下的研究例中，清洗也是进行同样的操作。
表5

接着，改变15％(w/v)NaCl水溶液(以下有时简称15％NaCl)的pH进行清洗，测定残留PLD活性。15％NaCl的使用量为磷脂馏分I的1/10(v/v)。将结果示于表6。
表6

进一步，在增加15％NaCl的清洗次数的情况下，测定残留PLD活性。使用量为磷脂馏分I的1/10(v/v)。将结果示于表7。
表7

从表5～7的结果可知，使用NaCl水溶液进行的清洗，能够使PLD活性降低至大约一半的量。但是，改变pH或增加清洗次数，未观察到显著的PLD除去效果。
(比较例6利用吸附剂进行的PLD除去的研究)在磷脂馏分I中加入吸附剂进行处理后，测定残留PLD活性。每1ml磷脂馏分I加入0.1g吸附剂，在室温下接触1小时，通过过滤除去吸附剂。此外，为了比较，也同时使用磷脂馏分I的1/10(v/v)量的15％(w/v)NaCl实施磷脂馏分I的清洗。将结果示于表8。此外，表8中的NaCl水溶液清洗+硫酸镁或NaCl水溶液清洗+活性白土，是指在用磷脂馏分I的1/10(v/v)量的15％(w/v)NaCl对磷脂馏分I进行清洗后，使用硫酸镁或活性白土进行吸附处理。
表8

从表8的结果可知，在吸附剂处理中，没有观察到PLD的活性显著降低，与15％NaCl清洗为相同程度。在活性白土处理中，PLD活性降低至大约25％左右，可认为比NaCl清洗更有效。但是，即使并用NaCl清洗和活性白土处理，也观察不到PLD的活性进一步降低。
(比较例7利用含水有机溶剂清洗进行的PLD除去的研究)使用表9记载的极性有机溶剂与水的混合溶剂对磷脂馏分I进行清洗后，测定PLD活性。清洗用的混合溶剂量为磷脂馏分I的6/10(v/v)。此外，为了比较，也同时使用磷脂馏分I的1/10(v/v)量的15％(w/v)NaCl实施磷脂馏分I的清洗。将结果示于表9。
表9

使用67％丙酮、67％异丙醇、67％乙醇和67％甲醇进行的处理，比NaCl处理有效果，但没有观察到PLD的活性充分降低。
如以上的比较例1～7的结果所示，确认现有的方法非常难以使PLD充分失活。因此，通过以下的研究例，说明为了解决该问题的新的酶活性除去方法。
<新方法的开发>
(研究例1清洗处理的组合)利用表10记载的溶剂的组合对磷脂馏分I进行清洗后，测定残留PLD活性。清洗用的溶剂量为磷脂馏分I的6/10(v/v)。将结果示于表10。
表10

从表10的结果可知，在使用将15％的NaCl水溶液与极性溶剂等量混合后的溶剂(含有7.5％NaCl的50％丙酮或异丙醇或乙醇或甲醇或甘油)进行清洗时，PLD达到检出限度以下。与此相对，在NaCl清洗后使用含水丙酮或含水乙醇进行清洗时，PLD活性只不过降低至33％～40％。从该结果可知，使用含有无机金属盐的、水与有机溶剂的混合溶剂进行的清洗，对PLD的除去有效。此外，PLD的检出限度为每1g卵磷脂0.01U。
(研究例2利用NaCl以外的金属盐进行的PLD的除去的研究)使用含有NaCl以外的金属盐的50％丙酮对磷脂馏分I进行清洗后，测定残留PLD活性。清洗用的溶剂量为磷脂馏分I的6/10(v/v)。将结果示于表11。
表11

表11的结果显示，使用Na2SO4、KCl、CaCl2和MgSO4代替NaCl作为无机金属盐，与NaCl同样，也能够除去PLD。
(研究例3；利用含有无机金属盐的含水极性溶剂进行的清洗的最优化)根据上述研究例的结果，对于极性溶剂浓度、无机金属盐浓度、和相对于磷脂馏分I的使用量，研究最佳的处理条件。在本研究中，使用丙酮作为极性溶剂，使用NaCl作为无机金属盐。将结果示于表12。
表12

※1清洗溶剂/磷脂馏分I的量(v/v)
在表12的结果中，随着清洗使用的混合溶剂的量增加，残留PLD活性降低。此外，在使用磷脂馏分I的容量的6/10(v/v)量的混合溶剂进行清洗时，NaCl浓度越高，残留酶的除去效率越好，在盐浓度相同的情况下，丙酮浓度高的，残留酶的除去效率好。
(研究例4残留蛋白质的确认)利用其容量的6/10(v/v)量的混合溶剂、即含有7.5％NaCl的50％丙酮对磷脂馏分I进行1～3次反复清洗后，测定磷脂馏分I中的残留蛋白质量。其中，蛋白质的定量使用上述记载的方法进行。将结果示于表13。
表13

如表13所示，可以确认，通过反复实施1～3次的利用含有无机金属盐的含水有机溶剂进行的清洗，蛋白质达到检出限度以下。这意味着，不仅防止由残留酶引起的磷脂变性，而且对减少变态反应性也是有用的。
如以上的研究例1～4的结果，新开发的利用含有无机金属盐的含水极性溶剂进行的清洗方法，能够有效地除去残留PLD活性，能够使蛋白质降低至检出限度以下，所以，确认对残留PLD活性的除去和精制是有效的方法。
<对水解反应和其它酶的应用>
(研究例5来自水解反应酶液的残留酶活性除去的研究)磷脂馏分II和III中含有生成物PA和酶PLD。磷脂馏分IV中含有生成物LPA与酶PLD和PLA2。磷脂馏分V中含有生成物PA与酶PLD和脂肪酶。磷脂馏分VI中含有生成物PA与PLD和蛋白酶。因此，对从这些磷脂的水解物精制生成物的方法、即除去生成物中残留的酶的方法进行研究。为了参考，也使用由碱交换反应得到的磷脂馏分I。
添加磷脂馏分I和III～V的6/10(V/V)量的含有15w/v％NaCl的50％丙酮，与上述研究例3同样地进行清洗处理。此外，磷脂馏分II和VI，由于是含有PA的水类溶剂，所以，分别添加磷脂馏分的容量的7.5％(w/v)NaCl与2倍量(v/v)的丙酮和等量(v/v)的庚烷并搅拌，进行与研究例3同样的处理，同时进行PA的提取和清洗。此外，PLD、PLA2、脂肪酶、和蛋白酶的各残留活性，利用上述的方法测定。将结果示于表14。
表14

表14的结果显示，所有的酶在所有反应形式(碱交换反应或水解反应)和所有的反应体系(使用有机溶剂的反应或水类反应)中，通过含有NaCl的含水丙酮的清洗处理，达到检出限度以下。此外，使用的酶的检出限度，每1g卵磷脂，PLD为0.01U、PLA2为20.1U、脂肪酶为1U、蛋白酶为1U。由此可知，来自由磷脂的水解反应得到的酶反应液的残留酶活性的除去或为了使这些酶失活而添加有蛋白酶的酶反应液，与碱交换酶反应液同样能够使用本发明的方法。特别地，对于磷脂馏分II和IV，PLD为检出限度以下，所以，表示能够同时进行从水溶液的提取和清洗，此外显示，分别添加构成清洗用混合溶剂的物质后进行混合也是有效的。这表明，在酶反应液中含有构成清晰用混合溶剂的有机溶剂、水或无机金属盐时，将它们作为清洗溶剂组分，添加需要量的有机溶剂、水和无机金属盐的不足部分并搅拌，进行与研究例3同样的处理，由此能够除去以PLD为首的磷脂的碱交换反应或水解反应中使用的酶或者除去用于使这些酶失活的酶的活性。
根据以上的研究结果，本发明的方法，与酶的种类无关，都可以利用。此外，本发明的方法能够应用于碱交换反应和水解反应，反应体系不论是含有有机溶剂的体系还是不含有机溶剂的体系(水类)，都能够应用。本发明的方法，由于能够从上述各种反应体系中除去含有酶的蛋白质等的杂质，所以，作为酶的除去方法和磷脂的精制方法，可认为是通用性高的方法。
产业上的可利用性根据本发明，在使用酶的磷脂的碱交换反应或水解反应中，可以不使用加热等方法而简单地除去酶反应液和反应生成物中含有的酶和蛋白质。因此，可容易地制造引起变态反应的可能性降低、维持为高品质、并且保存稳定性优异的各种磷脂。这样的高品质的磷脂可以用于以食品用途为首的各种产业领域。
权利要求
1.一种从磷脂的水解反应或碱交换反应中使用的酶反应液中除去酶的方法，其特征在于，包括利用含有无机金属盐的、水和有机溶剂的混合溶剂对该酶反应液进行处理，将该酶除去的工序。
2.一种磷脂的碱交换方法，其特征在于，包括使磷脂与选自醇类、糖类和含有羟基的环状化合物中的具有醇式羟基的化合物，在能够将磷脂中的碱转移到该化合物中的酶的存在下发生反应，得到酶反应液的工序；和利用含有无机金属盐的、水和有机溶剂的混合溶剂对该酶反应液进行处理，将该酶除去的工序。
3.一种磷脂的水解方法，其特征在于，包括在水的存在下，使磷脂与能够将磷脂水解的酶进行反应，得到酶反应液的工序；和利用含有无机金属盐的、水和有机溶剂的混合溶剂对该酶反应液进行处理，将该酶除去的工序。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于所述无机金属盐是选自氯化钠、硫酸钠、氯化钾、氯化钙、和硫酸镁中的至少一种金属盐。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于所述有机溶剂是极性溶剂。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述极性有机溶剂是选自丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、和甘油中的至少一种溶剂。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于所述混合溶剂含有30～70容量％的水和70～30容量％的有机溶剂，该混合溶剂中含有5～25质量/容量％的无机金属盐。
全文摘要
本发明提供一种从磷脂的水解反应或碱交换反应中使用的酶反应液中除去酶的方法。本发明的方法包括利用含有无机金属盐的、水和有机溶剂的混合溶剂对该酶反应液进行处理，将该酶除去的工序。根据本发明，可以不使用加热等方法而简单地除去反应生成物中含有的酶，所以，可容易地制造引起变态反应的可能性降低、维持为高品质、并且保存稳定性优异的各种磷脂。
文档编号C12N9/16GK1934263SQ20058000853
公开日2007年3月21日 申请日期2005年3月18日 优先权日2004年3月18日
发明者刘晓丽, 谷胁成幸 申请人:长濑化成株式会社