专利名称：发酵含有寡聚糖的糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵含有大量多糖材料的单糖的方法。
发酵方法在商业上被用来大量地生产有机分子如乙醇、柠檬酸和乳酸。在那些方法中，将碳水化合物向给料到可以将其代谢得到所需要的发酵产物的微生物。一起选择碳水化合物和微生物来使微生物可以有效地消解该碳水化合物以高产率地形成所需要的产物。为了优化产率和工艺参数或确保特定的碳水化合物被代谢，在这些方法中通常地使用基因设计的微生物变的越来越普遍。
淀粉是一种可以广泛获得的并且廉价的碳水化合物来源。它可以从很多种的植物来源，如谷物、小麦、水稻、大麦等中得到。许多微生物不能直接地代谢淀粉，或者代谢缓慢并且效率低。相应地，为了将淀粉分解成微生物能够容易地发酵的单糖，通常在将淀粉加入发酵过程中之前处理淀粉。
通常地，水解淀粉来形成主要地含有葡萄糖(即，右旋糖)的混合物。然而，完全水解成葡萄糖会增加大量的成本，所以大多数商业上可获得的葡萄糖产品倾向于含有少量的果糖和各种寡聚的多糖。不幸地，许多微生物不能代谢任何寡聚物，并且因此浪费了这些碳水化合物的价值。而且，这些寡聚物的存在使从发酵介质中回收所需要的发酵产物变得复杂。
所述的同时糖化和发酵(SSF)的方法是已知的，其中，将未水解的淀粉和酶给料在发酵过程中，该酶催化分解淀粉直到为单糖。生产单糖并且同时发酵得到所需要的产物。SSF方法存在一些缺点。在SSF方法中给料的淀粉一般地不是消过毒的。酶也不是消过毒的。于是，必须在发酵容器中进行消毒。这会消耗很多能源并且效率低。并且，当生产葡萄糖时，会使酶去活化并且降低总的生产速度。
相应地，一种使含有大量的寡聚糖的单糖原料能够有效地发酵的改进的方法是合乎需要的。
一方面，本发明是一种发酵的方法，它使含有30g/L或更少的单糖以及约1到约10g/L的一种或多种不可发酵的寡聚糖的发酵培养液在如下物质的存在下处于发酵的条件下(A)可以发酵单糖但不能发酵所述的不可发酵的寡聚糖的微生物和(B)有效量的至少一种活性酶，这种酶可以解聚至少一种所述的不可发酵的寡聚糖来形成可以被微生物发酵的单糖该发酵条件使得不可发酵的寡聚糖的解聚和单糖的发酵同时进行。
在第二个方面，本发明是一种在微生物的存在下使发酵基质发酵的方法，该方法包括(A)形成起始的发酵培养液，其包含(1)发酵基质，在该发酵基质中(a)重量为约75到约98％的是一种单糖，它能够由所述的微生物发酵为所需要的发酵产物；和(b)重量为约2到约25％的是一种或多种寡聚糖，该寡聚糖不能被所述的微生物发酵为所需要的发酵产物，其中的起始的发酵培养液含有至少30g/L的所述单糖；(B)在微生物存在下，发酵起始的发酵培养液，达到足以发酵单糖并且将发酵培养液中的单糖的浓度降低至低于约30g/L的状况；(C)然后向发酵培养液中加入有效量的至少一种活性酶，这种酶能使发酵培养液中的至少一种寡聚糖解聚来形成可以被所述的微生物发酵而形成所需要的发酵产物的单糖；(D)并且然后使发酵培养液处于足以同时解聚至少一种寡聚糖和发酵单糖而形成所需要的发酵产物的条件下。
第三方面，本发明是一种发酵的方法，它包括在不可发酵的葡萄糖寡聚物的解聚与葡萄糖和单糖的发酵同时进行的条件下，使含有至多30g/L的葡萄糖以及约1到约10g/L的不可发酵的葡萄糖寡聚物的发酵培养液在如下物质的存在下发酵(A)可以发酵葡萄糖但不能发酵所述的不可发酵的葡萄糖寡聚物的微生物和(B)有效量的至少一种活性酶，这种酶可以使至少一种所述的不可发酵的葡萄糖寡聚物解聚来形成可以被所述微生物发酵的单糖。
令人惊讶地发现，在存在显著浓度的单糖时，可以以很好的速度发生寡聚糖的酶促解聚。这可以使发酵和寡聚物的解聚同时地发生，而不会使酶明显地被钝化或重新形成1→6寡聚物。这种方法提供了一种有效的发酵方法，它使用相对廉价的碳水化合物原料并且以商业上合理的速度高产率地获得所需要的发酵产物。
“可发酵的单糖”是一种糖，它能够被本方法中所使用的微生物发酵来形成所需要的发酵产物。可发酵的单糖优选是戊糖或己糖。特别优选的己糖是葡萄糖。
“不可发酵的寡聚糖”是一种碳水化合物寡聚物，其中两个或更多个单糖单体通过醚键连接在一起。寡聚糖是“不可发酵的”，它的含义是不能被微生物发酵为所需要的发酵产物，或者在本方法所用的条件下，它的发酵的速度不超过微生物发酵可发酵单糖的速度的约5％。聚合度优选为约2到约10，特别地优选为约2到约5，最优选为约2到约3。对于寡聚己糖，那些具有1→4或1→6醚键的寡聚己糖是合适的，尽管优选那些具有1→4醚键的寡聚己糖。特别优选的不可发酵的寡聚糖包括葡萄糖的寡聚物如麦芽糖、麦芽三糖和异麦芽三糖(全都具有1→4醚键)、异麦芽糖(具有1→6键)和潘糖(具有1→4和1→6键)。
可商业上获得的淀粉水解产物含有约88-98重量％(基于碳水化合物)，特别地约90-96wt％的葡萄糖(可发酵单糖)和约1-20％(基于碳水化合物，特别地约1-9％的不能发酵的葡萄糖寡聚物。这种水解产物也可以包括少量的(重量至多为碳水化合物的约2％)果糖和其它的碳水化合物。这样的淀粉水解产物是用在本发明中的特别优选的发酵基质。
在本发明中，发酵和酶促的寡聚物解聚同时地发生。在这个过程中，向发酵培养液中加入活性酶使得可发酵单糖至多为约30g/L。单糖的浓度更高会降低酶解聚反应的效率，并且因此是不符合要求的。另外，在高浓度的单糖的存在下，一些酶将催化形成16多糖的寡聚物。单糖的浓度优选至多为约26g/L，并且更优选至多为约20g/L。
发酵培养液含有至多约10g/L，优选为约1到8g/L，并且更优选为约3-6g/L的不可发酵的寡聚糖。然后将发酵培养液处于这样的条件下其中可发酵的单糖被发酵，同时至少一种不可发酵的寡聚糖被解聚。也发酵了在解聚反应中生产的单糖(可以与起始的可发酵单糖相同或不同)。同时酶解聚和发酵提供了良好的产率和良好的发酵速度。
从含有较高浓度的可发酵单糖开始的发酵通常地是更经济的。因此本发明的优选实施例是这样的一种方法，其中起始发酵培养液含有超过30g/L(优选至少40g/L，更优选至少50g/L，特别优选至少55g/L)单糖的起始发酵培养液，直到将单糖的浓度降低至小于30g/L，优选小于26g/L并且更优选小于5g/L。接着加入酶，并且进行同时的发酵和寡聚物发酵。本发明的实施例允许你利用采用更高的起始浓度的原材料来得到更经济的优点。
这里可以使用能够解聚不可发酵的寡聚物的任何酶。选择所用酶的特定类型与发酵培养液中存在的特定的寡聚糖有关。特别重要的酶作用于寡聚糖的1→4醚键或1→6醚键(或两者)。用于解聚具有1→4键的寡聚物的优选的酶是α-葡糖苷酶(葡糖淀粉酶)。用于解聚具有1→6键的寡聚物的优选的酶是转葡糖苷酶。当存在两种类型的寡聚糖时，优选α-葡糖苷酶和转葡糖苷酶的混合物。这些酶是商业上可获得的，例如，Enzyme Biosystems(G-ZYME 99 SP(一种α-葡糖苷酶产品)和Genencor(转葡糖苷酶L-500)。在一些情况中，商业等级的α-葡糖苷酶并不是高度提纯的，并且它含有各种大量能够进攻1→4和/或1→6寡聚糖的键的酶。这些“粗”等级的α-葡糖苷酶属于酶的优选的类型。这种“粗”等级的一个例子是来自Genencor的GC702。
所用的酶的量在某种程度上取决于特定的酶、所需要的反应速度和存在的特定的寡聚多糖。一般地，所使用的酶的量足以提供约5-10,000μL酶/L发酵培养液。更优选的量是约10-1000μL/L并且甚至更优选的量是约25-500μL/L。
可以以工业发酵产物制备的化合物的实施例是乙醇、乳酸、柠檬酸、丙二酸、羟基丁酸和乙酸。
微生物是可以将可发酵单糖发酵来得到所需要的发酵产物的微生物。因此，选择所使用的特定的微生物和发酵基质有关，还与所需要的发酵产物有关。微生物可以是自然地产生的，或可以是突变或重组菌株。微生物的例子包括各种类型的杆菌、乳酸菌和酵母菌，其中包括野生型和突变或重组型。
用于生产乳酸的合适的微生物包括来自乳杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)和链球菌属(Streptococcus)的野生型细菌和根霉属(Rhizopus)的野生型真菌。另外，具有外源LDH基因的克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉森属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、Trichosporon或Yamadazyma的重组酵母菌变种是合适的。上述的重组酵母菌种在例如WO 99/14335、WO00/71738和WO 02/42471中被描述。
发酵培养液还含有水并且优选含有营养液，如蛋白质(或其它营养源)、维生素和盐，这些对细胞机能是必要的和所需要的。在发酵培养液中还可以存在其它组分，如缓冲剂、发酵产物(可以促进发酵的进度)和其它代谢产物。当发酵是酸时，为了保持使微生物作用良好的pH，通常用碱如氢氧化钙或碳酸钙来缓冲培养基流体。
选择条件使发酵和寡聚物的酶解聚同时地进行。虽然可能根据特定的微生物、酶和所需要的产物而改变条件，一般的条件包括温度为从约20℃，优选从约30℃到50℃，更优选到约45℃。通常地搅拌反应混合物。本方法可以间歇地、半连续地或连续性地进行。
优选继续本方法直到大量的发酵基质被转化为经济上可行的所需要的发酵产物。然而，应当承认，在很多情况下，试图发酵100％的基质并不是成本有效的。优选使用该方法使至少50％，更优选至少60％，特别地优选至少75％的不可发酵的寡聚物被转化为可发酵的单糖并且发酵成所需要的产品。不可发酵的寡聚物的最终浓度优选低于约3g/L，更优选低于约2g/L，并且特别地优选低于1g/L。可发酵单糖的最终浓度优选低于1g/L，特别地优选低于0.1g/L。
从发酵培养液中回收发酵产物。实施的方式取决于特定的产品。可是，通常地，一般通过过滤步骤从液相中分离微生物，并且通过例如蒸馏、萃取、结晶、膜分离、渗透、反向渗透或其它合适的技术来回收产物。
制备了约4000L的水溶液培养基，它含有足以提供153g葡萄糖/千克培养基流体的95％的葡萄糖糖浆。该95％的葡萄糖糖浆含有如下面的表1中列出的各种寡聚物物质。发酵培养液包括促进微生物生长和活性的营养包。
在45℃用浓度为约4g细胞/L的细菌发酵培养液来生产乳酸。需要添加石灰使培养基流体的pH保持在约6.2。生产乳酸(以钙盐的形式)的速度是约1.6g/kg/小时。继续发酵直到在培养基流体中葡萄糖的浓度被降低到小于7g/L。加入400μL/L的α-葡糖苷酶和25μL/L的转葡糖苷酶。取一个培养基流体的样品，并且分析葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖、潘糖和异麦芽三糖，结果如下
表1
加入酶时，乳酸的浓度为121g/kg。在加入酶之后，在如前面的条件下继续发酵。以几个时间间隔取一个培养基的样品并且如前面那样分析糖。结果如下表2
表2中的数据表明在加入酶之后所有五种被追踪的寡聚糖实质上被解聚。通过葡萄糖水平显示同时的发酵，在整个过程中葡萄糖水平一直在下降，即使当寡聚物被解聚而产生额外的葡萄糖时。在本实施例中，全部基质的浓度从153g/L降低至低于0.1g/L。最终乳酸的浓度为126g/kg培养基。
以更小规模进行另一种发酵，其使用约1.9L的与在表1中所描述的相似的发酵培养液，除了起始葡萄糖的浓度是约125g/L外。在如实施例1所描述的条件下，进行发酵约35个小时，此时将葡萄糖浓度降低至26g/L。在这时取样品并且分析糖。接着加入400μL/L的α-葡糖苷酶，并且在相同的条件下继续发酵。在加入酶之后的3、8、27个小时时提取样品，结果显示在表3中。
表3
表3中的数据显示在这些条件下，发酵和多糖的酶解聚同时地进行。在本实施例中，带有1→4醚键的寡聚物以高产率被转化为单糖。在本实施例中，由于α-葡糖苷酶并没有有效地促进异麦芽糖中存在的1→6醚键的水解，因此异麦芽糖并没有明显地被解聚。
权利要求
1.一种发酵的方法，它使含有30g/L或更少的单糖以及约1到约25g/L的一种或多种不可发酵的寡聚糖的发酵培养液在如下物质的存在下处于发酵的条件下(A)可以发酵单糖但不能发酵所述的不可发酵的寡聚糖的微生物和(B)有效量的至少一种活性酶，这种酶可以解聚至少一种所述的不可发酵的寡聚糖来形成可以被微生物发酵的单糖该发酵条件使得不可发酵的寡聚糖的解聚和单糖的发酵同时。
2.一种在微生物的存在下使发酵基质发酵的方法，该方法包括(A)形成起始的发酵培养液，其包含(1)发酵基质，在该发酵基质中(a)重量为约75到约98％的是一种单糖，它能够由所述微生物发酵的所需要的发酵产物；和(b)重量为约2到约25％的是一种或多种寡聚糖，该寡聚糖不能被所述的微生物发酵为所需要的发酵产物，其中所述的起始的发酵培养液含有至少30g/L的所述单糖；(B)在微生物存在下，发酵起始的发酵培养液，达到足以发酵单糖并且将发酵培养液中的单糖的浓度降低至低于约30g/L的状况；(C)然后向发酵培养液中加入有效量的至少一种活性酶，这种酶能使发酵培养液中的至少一种寡聚糖解聚来形成可以被所述的微生物发酵而形成所需要的发酵产物的单糖；(D)并且然后使发酵培养液处于足以同时解聚至少一种寡聚糖和发酵单糖而形成所需要的发酵产物的条件下。
3.一种发酵的方法，它包括在不可发酵的葡萄糖寡聚物的解聚与葡萄糖和单糖的发酵同时进行的条件下，使含有至多30g/L的葡萄糖以及约1到约26g/L的不可发酵的葡萄糖寡聚物的发酵培养液在如下物质的存在下发酵(A)可以发酵葡萄糖但不能发酵所述的不可发酵的葡萄糖寡聚物的微生物和(B)有效量的至少一种活性酶，这种酶可以使至少一种所述的不可发酵的葡萄糖寡聚物解聚来形成可以被所述微生物发酵的单糖。
全文摘要
在特定的酶的存在下发酵含有不可发酵的寡聚物的糖混合物，该酶在发酵的过程中同时地解聚该寡聚物。
文档编号C12P19/02GK101076596SQ200580016229
公开日2007年11月21日 申请日期2005年3月16日 优先权日2004年3月31日
发明者D·R·比科姆, J·L·科斯达德, D·H·里德, B·J·鲁斯 申请人:自然工作有限责任公司