专利名称：制备表达苯甲醛脱氢酶的转化体及使用所述转化体制备2,6－萘二甲酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备转化体的方法，所述转化体携带编码来源于溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)KCTC 2888的苯甲醛脱氢酶的基因并表达所述酶，以及所述转化体在通过将2-甲酰基-6-萘甲酸(在下文中称为“FNA”)转化为2，6-萘二甲酸(在下文中称为“NDA”)以高纯度纯化粗萘二甲酸(在下文中称为“cNDA”)中的应用，所述粗萘二甲酸通过2，6-二甲基萘(在下文中称为“2，6-DMN”)的氧化得到，并伴生有FNA。
背景技术：
在诸如聚酯和聚酰胺的高性能聚合材料的制备中，萘二甲酸的二酯得到了广泛且有效的应用。2，6-萘二甲酸二甲酯(在下文中，称为“NDC”)是代表性的二酯。通过NDC与乙二醇缩合，制备了聚2，6-萘二甲酸乙二醇酯(在下文中，称为“PEN”)，一种这样的高性能聚酯。在强度和热性能方面，发现由PEN制成的纤维和薄膜优于聚对苯二甲酸乙二醇酯(在下文中，称为“PET”)。由于其优秀的物理性能，PEN被用于形成在磁记录带和电磁部件制备中使用的薄膜。此外，因为其对气体扩散的优良抵抗，特别是对二氧化碳、氧气和水蒸气扩散的抵抗，由PEN制成的膜可应用于制造食品容器、特别是“热装罐”型食品容器。同样地，PEN可用于制造在轮胎帘布制备中使用的高强度纤维。
现今，如图1所示，NDC一般通过将DMN氧化为粗萘二甲酸(cNDA)，接着通过酯化来生产。在当前大多数情况下，NDC用作合成PEN的主要原料。但是，与NDA相比，NDC存在一些问题。首先，NDC缩合成PEN伴生有甲醇，带有爆炸的危险，而NDA缩合产生的是水。其次，因为其是通过NDA酯化和纯化获得的，因此与NDA相比，NDC需要更多的处理。同样地，NDC不能利用现有的PET生产设备。尽管存在着这样的缺点，一般还是使用NDC而不是NDA用于PEN合成，因为NDA无法以足够供PET合成使用的纯度被制备。
正如图2中所看到的，DMN氧化产生cNDA，由于不完全氧化的结果，伴生有副产物，例如2-甲酰基-6-萘甲酸、2-萘甲酸等。杂质特别是FNA，如果存在的话，在PEN聚合为聚合材料的过程中会引起断裂，由此对聚合物的性质产生不利的影响。为了将cNDA应用于PEN合成，必须事先将FNA从其中除去，但这是困难的。
已知有多种方法用于从cNDA反应中除去FNA。例如，业已提出重结晶纯化NDA，重复氧化以及在甲醇的存在下将cNDA转化为NDC，接着水合或氢化为纯的NDA。此外，业已进行了通过溶剂洗涤、熔体结晶、高压结晶、超临界萃取等方法除去FNA的尝试。但是，这些技术刚好导致了NDA不够的纯度。从另一方面来说，除非牺牲产率，常规的方法才能增加NDA的纯度，所以它们难以在实践中使用。
如上所述，用于NDA生产的化学和物理方法存在着问题，包括产生环境污染、由于高温和高压产生爆炸的可能性、由于大型设备而增加的生产成本、大量的能源消耗等。为了在聚合为高性能聚合材料中直接使用，2，6-萘二甲酸必须是高纯度的，这是使用常规方法难以达到的。额外的纯化处理，即使能得到高纯度的NDA，还是会导致生产率降低和过程延长。
因而，近来已广泛地注意到生物学方法，特别是使用微生物的生物学方法。先前，本发明人使用在韩国专利申请号2002-0087819中披露的新的芽孢杆菌开发出FNA的除去方法，并提出一种在如韩国专利申请号2002-7005344中披露的在二甲苯单加氧酶存在下制备芳族醛和羧酸的方法。没有任何先前的文献描述了使用来源于溶芳烃鞘氨醇单胞菌的苯甲醛脱氢酶将FNA转化为NDA。
发明内容
本发明已经关注在现有技术中出现的上述问题，因此，本发明的一个目的是提供一种制备转化体的方法，所述转化体表达由xylC基因编码的苯甲醛脱氢酶，能用于纯化NDA。
本发明的另一个目的是提供一种纯化cNDA的方法，其中在转化体的存在下将cNDA中含有的FNA氧化为NDA。
根据本发明的一个方面，提供了一种制备表达苯甲醛脱氢酶的转化体的方法，包括构建携带编码来源于溶芳烃鞘氨醇单胞菌KCTC 2888的苯甲醛脱氢酶的SEQ ID NO1的基因(xylC)的重组表达载体，以及使用所述重组表达载体转化宿主细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了通过所述方法制备的转化体。
根据本发明的再一个方面，提供了一种生产苯甲醛脱氢酶的方法，包括在25～45℃下培养所述转化体，并以0.1～2.0mM的量添加IPTG到转化体培养物中以诱导苯甲醛脱氢酶表达。
根据本发明的又一个方面，提供了一种纯化粗萘二甲酸的方法，包括将所述粗萘二甲酸与转化体反应以将粗萘二甲酸中含有的2-甲酰基-6-萘甲酸转化为2，6-萘二甲酸。
根据以下详细说明及附图，本发明的上述和其他目的、特征以及优点将会得到更清楚的理解，其中图1是显示通过常规氧化方法，2，6-二甲基萘转化为萘二甲酸和萘二甲酸酯的反应路线。
图2是显示伴生有2-甲酰基-6-萘甲酸的2，6-二甲基萘氧化为2，6-萘二甲酸的反应路线。
图3是携带编码来源于溶芳烃鞘氨醇单胞菌的苯甲醛脱氢酶的基因的重组表达载体pET20-xylC的基因图谱。
具体实施例方式
以下将给出本发明的详细说明。
根据本发明的一个方面，提供了一种制备表达苯甲醛脱氢酶的转化体的方法。为了该目的，将xylC(一种编码苯甲醛脱氢酶的基因)从溶芳烃鞘氨醇单胞菌克隆并插入重组表达载体中，接着将所述载体导入合适的宿主细胞中。
苯甲醛脱氢酶(BZDH)是一种同源二聚体并为xylC基因所编码。使用遗传学人工改造以表达xylC的大肠杆菌，可以氧化苯甲醛、3-甲基苯甲醛、4-甲基苯甲醛、3-硝基苯甲醛和氯取代的苯甲醛(参见Inoue等，J.Bacteriol.，1771196-1201，1995)。
使用溶芳烃鞘氨醇单胞菌可以实现表示为SEQ ID NO1并编码苯甲醛脱氢酶的xylC基因的克隆。为克隆xylC基因，使用一组基于xylC合成的引物5′-GGAGAATTCATATGGCTACGCAGT-3′(SEQ ID NO2)和5′-GTCTTGCAGTGAGCTCGTTTCTCC-3′(SEQ ID NO3)以及来自溶芳烃鞘氨醇单胞菌(KCTC 2888)的质粒DNA(pNL1)作为模板，进行聚合酶链式反应(PCR)。
使用携带xylC基因(SEQ ID NO1)的重组表达载体创建表达苯甲醛脱氢酶的转化体。所述重组表达载体可通过将克隆的xylC基因与启动子功能性连接而获得。
至于图3，其是携带有编码来源于溶芳烃鞘氨醇单胞菌的苯甲醛脱氢酶的基因的重组表达载体pET20-xylC的基因图谱。正如图3所看到的，表示为SEQ ID NO1的约1.5kbp长的DNA片段被插入pET-20b(+)载体中以形成重组载体pET20-xylC。
如在此所披露和要求的，编码来源于溶芳烃鞘氨醇单胞菌(KCTC 2888)的xylC的SEQ ID NO1所示序列意在包括“保守序列修饰”，即不显著影响或改变所述核苷酸序列编码的或含有所述氨基酸序列的酶的催化特性的核苷酸和氨基酸序列修饰。这样的保守序列修饰包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。可通过本领域已知的标准技术如位点定向诱变和PCR介导的诱变引入修饰。保守氨基酸取代包括其中任何一个氨基酸残基为具有类似侧链的氨基酸残基所取代。
在本发明中使用的表达载体并不特别受限。任何本领域众所周知的表达载体皆可利用，包括例如带有T7启动子、T3启动子或Sp6启动子的pForexT载体、pUC载体、pBluescript载体、pET载体等。
可以本领域众所周知的方法使用重组表达完成转化体的制备。根据本发明，借助于使用苯甲醛脱氢酶表达载体转化的微生物将2-甲酰基-6-萘甲酸转化为2，6-萘二甲酸。因此，优选转化的微生物能以高水平表达苯甲醛脱氢酶。就pET-20b(+)载体来说，在T7启动子控制下，结构基因的表达受调节，以便其可被异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(在下文中称为“IPTG”)所诱导。
适合用于转化体制备的宿主细胞是肠道菌群， 例如MC1061(大肠杆菌)、JM109(大肠杆菌)、XL1-Blue(大肠杆菌)和DH5α(大肠杆菌)。可使用热激、电穿孔、显微注射或粒子轰击方法将表达载体导入宿主细胞，这些方法并不被解释为限制本发明。
与此同时，可通过使用限制性内切酶消化或碱基测序证实xylC基因克隆入表达载体中。
转化体在25～45℃，优选在37℃的温度下充分生长，然后在100ml的LB培养基中以1％(v/v)的量接种。当观察到0.4～0.5的OD600时，以0.1～2.0mM，优选0.5mM的量添加IPTG以诱导苯甲醛脱氢酶表达，接着在37℃下温育。应当注意到可以使用本领域已知的任何方法来实现转化体生长和蛋白表达，而不受限于上述方法。
根据本发明，可通过借助于其中苯甲醛脱氢酶以高水平表达的转化的微生物将在粗萘二甲酸中含有的2-甲酰基-6-萘甲酸转化为2，6-萘二甲酸，来纯化粗萘二甲酸。
为了供转化所用，将回收自培养物的转化的微生物的生物质悬浮在生理盐水中。
在所述酶存在下，在pH 6.0～10.0，优选在pH 8.0的缓冲液中，粗萘二甲酸中含有的2-甲酰基-6-萘甲酸到2，6-萘二甲酸的转化得以发生。
可用于酶促转化的缓冲液的例子包括碳酸钠缓冲液(Na2CO3/NaHCO3)、甘氨酸缓冲液(甘氨酸/NaOH)、磷酸钾缓冲液(KH2PO4/KOH、K2HPO4/KOH、KH2PO4/NaOH、K2HPO4/NaOH)、磷酸钠缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4)、琥珀酸缓冲液(琥珀酸/NaOH)、醋酸钠缓冲液(醋酸钠/醋酸)、柠檬酸缓冲液(柠檬酸/柠檬酸钠)、焦磷酸钠缓冲液(Na4P2O7/HCl)、硼酸缓冲液(硼酸/NaOH)和四硼酸钠缓冲液(四硼酸钠/HCl)，根据酶活性，优选磷酸盐缓冲液。
非强制性选择地，可添加有机溶剂到酶反应中以便溶解cNDA。合适的有机溶剂的例子包括二甲亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)和四氢呋喃(THF)，根据酶活性，优选5％DMSO。优选地，有机溶剂的量不超过反应物总重量的20％。
转化优选在25～45℃，最优选在30℃下进行以使反应速率最优化。至于足以将2-甲酰基-6-萘甲酸转化为2，6-萘二甲酸的反应时间，其在0.5～48小时内变动，优选0.5～24小时，更优选6小时。
转化体XL1-Blue(pET20-xylC)接种在含有1,000ppm的cNDA和100mg/L的氨苄青霉素的LB培养基中，并在37℃下搅拌温育足够的时间。上清液的HPLC分析显示表达的苯甲醛脱氢酶(xylC)除去了FNA，产生高纯度的2，6-NDA。
通过以下实施例可获得对本发明的更好理解，其在于说明，而不视为对本发明的限制。
实施例1xylC基因的克隆为了克隆编码来自溶芳烃鞘氨醇单胞菌(KCTC 2888)的苯甲醛脱氢酶的xylC基因，首先，从其中分离出携带xylC基因的质粒(pNL1)(参见Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。对于PCR，使用分离的质粒DNA(pNL1)作为模板，基于公开的xylC的DNA碱基序列(可获得自GenBank序列数据库，NC 002033)合成引物1，5′-GGAGAATTCATATGGCTACGCAGT-3′(SEQ ID NO2)和引物2，5′-GTCTTGCAGTGAGCTCGTTTCTCC-3′(SEQ ID NO3)。使用该组引物，用于克隆全长xylC基因的PCR起始于在94℃下预变性5分钟，并进行在94℃变性温度下1分钟，在56℃退火温度下1分钟和在72℃延伸温度下1.5分钟的40个循环，最后在72℃下延伸额外10分钟。由PCR反应，分离了约1.5kbp长的DNA片段，并用NdeI和SalI消化。将其插入已用相同的限制性内切酶切割的质粒pET-20b(+)中，以便构建如图3所示的重组表达载体pET20-xylC。
实施例2克隆基因的分析为了对实施例1中克隆入重组载体(pET20-xylC)中的基因进行碱基测序，基于两个载体M13mp18和M13mp19的基因图谱，使用不同的酶切割该重组载体。将这样获得的DNA片段亚克隆入M13mp18和M13mp19中，然后通过ABI PRISM BigDye引物循环-测序试剂盒(Perkin-Elmer，USA)，在AmpliTaq DNA聚合酶存在下进行碱基测序分析。为了双向读出目的DNA的两条链，部分合成核苷酸片段。通过与来自GenBank的碱基序列比较，确定克隆的DNA是xylC基因。
实施例3制备表达BZDH的转化体使用氯化钙法(参见Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，用pET20-xylC载体转化大肠杆菌XL1-Blue，并在补充有氨苄青霉素(100mg/L)、X-gal、IPTG和细菌培养用琼脂(15g/L)的LB平板(酵母提取物，5g/L；Trypton，10g/L；NaCl，10g/L)上生长，以选择转化的大肠杆菌XL1-Blue(pET20-xylC)。
实施例4xylC基因的表达为研究xylC基因在转化的微生物中的表达，在相同的条件下培养实施例3中获得的转化体XL1-Blue(pET20-xylC)和作为对照的野生型XL1-Blue，测定每种类型细菌所表达的苯甲醛脱氢酶的活性。在这点上，在各自的LB培养基中接种实施例3的转化体和对照，在37℃下培养足够的时间，然后以1％(v/v)的量置于100ml LB培养基中。当在600nm处的吸光度达到0.4～0.5时，添加0.5mM IPTG以诱导xylC表达，接着在37℃下温育。
实施例5使用表达的BZDH将2-甲酰基-6-萘甲酸(FNA)转化为2，6-萘二甲酸(NDA)通过离心实施例4中表达苯甲醛脱氢酶的微生物培养物回收细胞团块，用0.85％生理盐水洗涤并在30℃的容器中与表1的反应溶液温育6小时，接着进行高效液相色谱(HPLC)分析。在表1的反应溶液中，缓冲液的pH设定在8.0，DMSO的浓度为5％，NDA中FNA的含量为9％。
下表2给出了分析结果。正如表2所看到的，在将FNA转化为NDA的能力方面，转化体XL1-Blue(pET20-xylC)远胜于野生型。在表3所列条件下进行HPLC分析。
表1
表2
表3
工业实用性如上文所述，根据本发明制备的转化体对于从粗萘二甲酸中除去2-甲酰基-6-萘甲酸是非常有效的。因此，本发明的方法可以经济有利和环境友好的方式用于生产高纯度的2，6-萘二甲酸，提供了高的工业实用性。
尽管业已披露本发明的优选实施方案作为说明的目的，但是本领域技术人员应当意识到不同的修饰、添加或替换是可能的，而不背离所附权利要求所披露的本发明的范围和精神。
序列表<110>株式会社晓星<120>制备表达苯甲醛脱氢酶的转化体及使用所述转化体制备2，6-萘二甲酸的方法<160>3<170>Kopatentln 1.71<210>1<211>1506<212>DNA<213>溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)<400>1atggctacgc agttgagaag tgcagaaaac gaatacggga tcaagtccga gtacggccac 60tatatcggcg gcgagtggat cgccggggac agcggcaaga ccatcgatct gctcaatccc120tcgaccggca aggtgctgac caagattcag gccggcaacg ccaaggatat cgaacgcgcg180attgccgccg ccaaggcggc gtttcccaag tggtcgcaga gcctgcccgg cgagcgccaa240gaaatcctga tcgaggttgc gcgtcgtctg aaggcacgcc attcgcacta tgccaccctc300gaaacgctca acaacggcaa gccgatgcgc gaatcgatgt atttcgatat gccgcagacg360atcgggcagt ttgagctgtt cgccggtgcc gcctatggcc tgcacggcca gacgctcgat420tatcccgacg cgatcggcat cgtccaccgc gaaccgctcg gcgtctgcgc gcagattatc480ccatggaacg tgccgatgtt gatgatggcg tgcaagatcg cgcccgcgct ggcctcgggc540aacactgtcg ttctgaagcc ggccgaaacg gtctgccttt cggtgattga attcttcgtg600gaaatggctg atctgttgcc gccgggtgtg atcaacgtcg tcaccggcta tggcgcggac660
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<212>DNA<213>溶芳烃鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aromaticivorans)<400>3gtcttgcagt gagctcgttt ctcc2权利要求
1.一种制备表达苯甲醛脱氢酶的转化体的方法，包括构建携带编码来源于溶芳烃鞘氨醇单胞菌KCTC 2888的苯甲醛脱氢酶的SEQ ID NO1的基因(xylC)的重组表达载体；以及使用所述重组表达载体转化宿主细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是肠道菌群。
3.一种通过权利要求1的方法制备的转化体。
4.一种生产苯甲醛脱氢酶的方法，包括在25～45℃下培养权利要求3的转化体；和以0.1～2.0mM的量添加IPTG到转化体培养物中以诱导苯甲醛脱氢酶表达。
5.一种纯化粗萘二甲酸的方法，包括将所述粗萘二甲酸与权利要求3的转化体反应以将粗萘二甲酸中含有的2-甲酰基-6-萘甲酸转化为2，6-萘二甲酸。
6.如权利要求5所述的方法，其中粗萘二甲酸与所述转化体的反应在含有0～20％有机溶剂的缓冲溶液中进行，所述有机溶剂选自二甲亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺和四氢呋喃。
7.如权利要求5所述的方法，其中反应在25～45℃下进行0.5～48小时。
8.如权利要求5所述的方法，其中粗萘二甲酸与所述转化体在含有有机溶剂的缓冲溶液中反应，所述缓冲溶液是磷酸钾溶液(KH2PO4/KOH、K2HPO4/KOH、KH2PO4/NaOH、K2HPO4/NaOH)，pH在6.0～10.0范围内。
全文摘要
在此披露的是一种制备转化体的方法，所述转化体携带编码来源于溶芳烃鞘氨醇单胞菌KCTC 2888的苯甲醛脱氢酶的基因并表达所述酶，还披露了通过应用所述转化体将FNA转化为萘二甲酸所实现的粗萘二甲酸的生物学纯化，所述粗萘二甲酸通过2，6－二甲基萘的氧化得到，并伴生有2－甲酰基－6－萘甲酸。
文档编号C12N15/09GK101084313SQ200580044056
公开日2007年12月5日 申请日期2005年12月23日 优先权日2004年12月30日
发明者李种桓, 崔龙福 申请人:株式会社晓星