专利名称：木霉菌转化子的限制性内切酶介导基因整合化构建方法
技术领域：
本发明涉及一种木霉菌转化子的限制性内切酶介导基因整合化构建方法，通过限制性内切酶介导的基因整合(REMI)转化技术，对生物防治真菌-木霉菌(Trichoderma harzianum，Trichoderma atroviride)的菌株分子进行改良，获得优良生物防治木霉菌突变株，用于防治植物病害。
背景技术：
木霉菌作为国际公认的一类环境友好防治各种植物病害的生物防治真菌，是创制多功能生物农药的重要微生物和基因资源。然而目前生产上应用的木霉菌主要是自然筛选获得的，无论在病害防治水平、稳定性和抗逆性度等方面尚不理想，因此急需应用生物技术进行改良，为创制高效生物农药提供源源不断的优良菌株资源。目前改良木霉菌的技术主要有理化诱变育种，原生质体融合、插入突变和基因转化等。Papavizas等曾用紫外线诱变木霉菌，获得了对苯菌灵等类杀菌剂有抗性的菌株，从而制备出木霉菌和苯菌灵杀菌剂复合制剂。Harman(1986)等通过原生质体融合技术选出比亲本菌株防治病害效果更好的融合子(Trichoderma harzianum strain T22。Limon等(1998)利用amS基因及其木霉菌几丁质酶基因chit33共转化哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)CECT2413得到了几丁质酶基因超量表达的转化菌株，与野生型菌株相比，对Rhizoctonia solani的抑菌活性明显提高。然而无论要筛选高效生物防治菌株，还是克隆新的生物防治相关基因均需要创造大量的突变株，然后进行筛选。目前创造突变的方法主要以理化诱变法为主，该方法诱变效率低，需要从大量的菌株中通过单个克隆来筛选突变体，同时要探明影响突变体的营养和形态的变化，需用图谱等方法克隆突变基因，费工费时。限制性内切酶介导的基因整合化技术的插入突变是在限制性内切酶介导下通过质粒DNA的异源随机插入而使基因突变，从而直接获得突变株和基因标记。研究表明，此技术应用于生物防治木霉菌菌株进行分子改良，一方面可筛选出优良突变株直接用于防治植物病害生物农药制备，另一方面可以利用标签质粒DNA序列和单拷贝插入的特点，高效分离生物防治相关基因。但目前尚未见有公开报道的相关技术。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种木霉菌转化子的限制性内切酶介导基因整合化构建方法，得到比亲本菌株拮抗谱更广，防治效果更高、更好的优良木霉菌菌株，以增强木霉菌的生防效果及稳定性。
为实现这一目的，本发明以生物防治真菌-木霉菌为原始出发菌，将提取质粒DNA与制备的木霉菌原生质体混合，在限制性内切酶的作用下，使外源线性质粒pV2片段插入木霉菌染色体组诱导插入突变，获得转化子，然后对突变的转化子进行筛选，得到比亲本生物防治病害效果更好的优良木霉菌突变株，从中可筛选到对番茄灰霉病和黄瓜枯萎病等防治效果显著高于野生菌株的转化子。
本发明的方法具体包括以下步骤1.木霉菌菌株原生质体的制备本发明采用生物防治效果明显的木霉菌制备原生质体。首先将木霉菌在PDA固体培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上培养产孢后，用无菌水洗下木霉菌孢子，然后将木霉菌孢子加入PDB液体培养基(马铃薯葡萄糖酵母膏培养基)中，在25-30℃下，100-150转/分摇床培养18-22小时，用布氏漏斗过滤收集菌丝，再用0.7摩尔/升NaCl溶液冲洗菌丝。
将崩溃酶用0.7摩尔/升NaCl溶液配制浓度为13-20毫克/毫升的酶液，将上述得到的菌丝放入离心管中，再将配制好的崩溃酶酶液以菌丝2倍体积的量加入到盛有菌丝的离心管中，将离心管放在摇床上，在25-30℃下以120-150转/分振荡培养3-4小时，然后过滤，并用0.7摩尔/升NaCl溶液冲洗菌丝，收集原生质体于离心管中，在4℃下4000转/分离心15分钟，倒掉上清液，向离心管中加入山梨糖醇缓冲液冲洗原生质体沉淀，并在4℃下4000转/分离心15分钟，倒掉上清液，得到原生质体沉淀。重复用山梨糖醇缓冲液冲洗原生质体沉淀、离心、去上清共2-3次。再根据得到的原生质体的量向管中加入山梨糖醇缓冲液，调节原生质体浓度至107-108个/毫升。
本发明所述山梨糖醇缓冲液的组分为山梨醇316.256克、PH7.5的1摩尔/升Tris-Hcl 10毫升、CaCl21.11g，加水定容到1000ml。
2.质粒提取与DNA消化吸取含有质粒PV2的冷冻保存的菌种100微升，加到含有50微克/毫升的氨苄青霉素的100毫升的LB液体培养基上，37℃140-200转/分摇床培养12-16小时，取已培养至对数生长期的1.5毫升细菌培养液放于1.5毫升的离心管中，5000转/分离心5分钟。弃上清，向留有沉淀的离心管中加入100微升含有50毫摩尔/升葡萄糖，10毫摩尔/升乙二胺四乙酸，25毫摩尔/升Tris HCl的溶液I进行悬浮沉淀，冰浴5-10分钟，再加入200微升含200毫摩尔/升NaOH，1％SDS的溶液II，置冰浴5分钟使质粒DNA变性后，再加入150微升含3摩尔/升醋酸钾，pH4.8的溶液III，混匀，冰浴5-10分钟。向离心管中加入450微升的按体积25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶异戊醇的混合物进行抽提，10000转/分离心10分钟。吸取上清于另一离心管中，向其中加入与上清等体积的按体积25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶异戊醇的混合物进行抽提，重复此抽提步骤2-3次。最后小心吸取上清于另一离心管中，向管中加入上清液的2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30分钟左右，10000转/分离心10分钟，倒掉上清，向管中沉淀加入30-50微升10毫摩尔/升Tris.Hcl，1毫摩尔/升乙二胺四乙酸配置的缓冲液，得到了含有少量RNA的DNA溶液。向此溶液中加入无DNA的RNase A，使其终浓度达10-20微克/毫升左右，37℃温育30-60分钟，去除RNA得到质粒DNA。
所述LB培养基的组分为10克胰化蛋白胨、5克酵母提取物、5克NaCl，溶于950毫升去离子水中，调节pH值到7.0，每瓶100毫升分装灭菌后备用。
3.转化在50毫升离心管中加入质粒40微克、浓度为10个单位/微升限制性内切酶HindIII10微升、山梨醇缓冲液200微升，配制成酶-质粒混合液，然后向离心管中加入100-200微升原生质体悬浮液，并使其与酶-质粒混合液混匀，置冰上15-20分钟，缓慢向管中加入2毫升聚乙二醇，冰浴20-25分钟，然后将离心管取出在28℃下放置10-20分钟，加入5毫升预冷的山梨醇缓冲液，4℃下2000转/分离心15分钟，弃上清，加入3毫升液体再生培养基，25-30℃下放置6小时。将培养液倒入培养皿中，然后加入约15毫升预先熔化好的，并且冷却至50℃左右的固体再生培养基，尽快摇晃使培养液与培养基混匀，使其冷却干燥，熔化水琼脂，并冷却至50℃左右，加入潮霉素至浓度为300微克/毫升，快速倒入平板中，在培养基表面铺满一层为止，每个平板约需10毫升，在28-30℃下，培养4-5天，将能够抗潮霉素的菌落转移到预先倒好的含有潮霉素250微克/毫升的固体PDA培养基上进行二次筛选，第二次筛选得到的木霉菌即为所要得到的转化体。
根据抗潮霉素基因序列，设计引物进行PCR检测，以pV2为模板和潮霉素和氨苄青霉素的基因序列为探针，转膜印迹检测转化子。经PCR和Southern blot检测为突变株的转化子经继代培养，将确定为可以稳定遗传的转化子的菌株制成硅胶粒在-20℃冰箱中保存，用于优良生物防治菌株筛选。
所述液体再生培养基的组分为(NH4)2SO42.8克、尿素600毫克、磷酸钾4克、葡萄糖40克、蔗糖100克、CaCL2600毫克、MgSO4.10H2O 200毫克、FeSO4.7H2O 10毫克、ZnSO4.7H2O 1.8毫克、MnSO4.H2O 3.2毫克、CoCL2.6H2O4毫克。
所述固体再生培养基的组分在液体再生培养基组分的基础上，再加入琼脂17-20克。
本发明利用限制性内切酶介导的基因整合转化技术，已经证明此技术可以使转化频率和单拷贝整合事件明显提高。此外，此技术的另一个优点是便于快速、有效地分离目的基因。在这种插入突变体中，转化DNA自然标记了插入位点附近的DNA，因此，插入诱变流程可通过回收带有两侧侧翼片段的质粒而大大加速各个基因的克隆。转化后，可以获得很多表型和基因型有差异的突变子，从中筛选目标转化子用于进一步的研究。通过本发明可以得到大量的木霉菌转化子，比一般质粒转化方法可显著提高真菌的转化效率20-60倍，并可从中筛选到对番茄灰霉病和黄瓜枯萎病等防治效果显著高于野生菌株的转化子，为扩大菌种资源，克隆生物防治基因资源，获得多功能生物防治菌株奠定基础。
具体实施例方式
以下结合具体的木霉菌转化子的生物防治效果实施例对本发明作进一步的说明。以下实施例不构成对本发明的限定。
实施例1 防治番茄灰霉病木霉菌转化子的构建1.原生质体的制备在PDA培养基上培养木霉菌T21约3～4天，收集孢子于无菌水中，孢子悬浮液的浓度大约为107个孢子/毫升。将得到的孢子悬浮液1毫升加入到100毫升的PDB液体培养基中，25℃、110转/分振荡培养20小时后得到木霉菌菌丝，无菌条件下收集菌丝于无菌的50毫升的离心管中，并确定其重量。
将崩溃酶用0.7摩尔/升NaCl溶液配制浓度为13毫克·毫升-1的酶液，加入到盛有菌丝的离心管中，加入量为菌丝重的2倍。将离心管放在摇床上，28℃下130转/分振荡培养3小时。过滤除去菌丝碎片，并用0.7摩尔/升NaCl溶液冲洗菌丝，收集原生质体溶液于50毫升离心管中。将离心管在4℃下以4000转/分钟离心15分钟，倒掉上清液，再向管中加入5毫升山梨糖醇缓冲液冲洗原生质体沉淀，并在4℃下4000转/分离心15分钟，倒掉上清液，收集原生质体，重新用山梨醇缓冲液反复洗涤原生质体2～3次。最后根据得到的原生质体的量向管中加入山梨糖醇缓冲液，调节原生质体浓度至107-108个/毫升。
所述PDA培养基的组分马铃薯200g，葡萄糖17-20克，琼脂条15-20克，加水定容到1000毫升，分装灭菌后备用，用于木霉菌产孢。
所述PDB培养基的组分马铃薯200克，葡萄糖17-20克，酵母膏15克，加水定容到1000毫升，分装灭菌后备用，用于培养木霉菌菌丝。
所述山梨糖醇缓冲液的组分山梨醇316.256克、PH7.5的1摩尔/升Tris-Hcl 10毫升、CaCl21.11g，加水定容到1000ml。
2.pV2质粒的提取与DNA消化质粒pV2由中国农业大学彭友良教授提供。
吸取含有质粒PV2的冷冻保存的菌种100微升，加到100毫升的LB液体培养基中，再向其中加入氨苄青霉素使其终浓度达到50毫克/毫升，37℃140转/分摇床培养14小时，取已培养至对数生长期的1.5毫升细菌培养液放于1.5毫升的离心管中，5000转/分离心5分钟。弃上清，向留有沉淀的离心管中加入100微升含有50毫摩尔/升葡萄糖，10毫摩尔/升乙二胺四乙酸，25毫摩尔/升Tris HCl的溶液I进行悬浮沉淀，冰浴5-10分钟，再加入200微升含200毫摩尔/升NaOH，1％SDS的溶液II，置冰浴5分钟使质粒DNA变性后，再加入150微升含3摩尔/升醋酸钾，pH4.8的溶液III，混匀，冰浴5-10分钟。向离心管中加入450微升的按体积25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶异戊醇的混合物进行抽提，10000转/分离心10分钟。吸取上清于另一离心管中，向其中加入与上清等体积的按体积25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶异戊醇的混合物进行抽提，重复此抽提步骤2-3次。最后小心吸取上清于另一离心管中，向管中加入上清液的2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30分钟左右，10000转/分离心10分钟，倒掉上清，向管中沉淀加入30微升由10毫摩尔/升Tris.Hcl，1毫摩尔/升乙二胺四乙酸配置的缓冲液中，得到了含有少量RNA的DNA溶液。向此溶液中加入无DNA的RNase A，使其终浓度达10-20微克/毫升左右，37℃温育30分钟，去除RNA得到质粒DNA。
所述LB液体培养基的组分为10克胰化蛋白胨、5克酵母提取物、5克NaCl，溶于950毫升去离子水中，调节pH值到7.0，每瓶100毫升分装灭菌后备用。
3.转化取1.5毫升的离心管，加入定量的pV2质粒40微克，10个单位/微升的介导酶HindIII 10微升，200微升的山梨醇缓冲液，配制成酶-质粒混合液，置冰上备用。取100微升调好浓度的原生质体悬浮液于50毫升离心管中，再加入已配好的酶-质粒混合液，混匀后，置冰上15分钟。逐滴缓慢向管中加入2毫升聚乙二醇，置冰上20分钟后，然后将离心管取出在28℃下放置10分钟，再向离心管中加入5毫升冰预冷的山梨醇缓冲液，然后于4℃下2000转/分钟离心15分钟，弃上清。加入3毫升液体再生培养基，28℃下放置6小时。将培养液倒入培养皿中，然后加入约15毫升预先熔化好的，并且冷却至50℃左右的固体再生培养基，尽快摇晃使培养液与培养基混匀，使其冷却干燥，熔化水琼脂，并冷却至50℃左右，加入潮霉素至浓度为300微克/毫升，快速倒入平板中，在培养基表面铺满一层为止，每个平板约需10毫升，在28℃下，培养4天，将能够抗潮霉素的菌落转移到预先倒好的含有潮霉素250微克/毫升的PDA培养基上进行二次筛选，第二次筛选得到的木霉菌即为所要得到的转化体。
根据抗潮霉素基因序列，设计引物进行PCR检测，以pV2为模板和潮霉素和氨苄青霉素的基因序列为探针，转膜印迹检测转化子。经PCR和Southern blot检测为突变株的转化子经继代培养，将确定为可以稳定遗传的转化子的菌株制成硅胶粒在-20℃冰箱中保存，用于优良生物防治菌株筛选。
生物防治活性鉴定根据离体接种的结果选择抑病效果好的转化子Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55的孢子悬浮液喷雾接种，每处理10株，30株喷孢子悬浮液150毫升，置于人工气候室中生长。湿度保持在90％以上，24小时后接种灰霉病菌，7天后调查发病情况。结果表明，转化子Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55防病效果明显高于出发菌株T21和对照。其中转化子Ttrm31对番茄灰霉病的防效比出发菌提高20％。
实施例2 防治黄瓜枯萎病的木霉菌转化子的构建1.原生质体的制备在PDA培养基上培养木霉菌T21约3～4天，收集孢子于无菌水中，孢子悬浮液的浓度大约为107个孢子/毫升。将得到的孢子悬浮液1毫升加入到100毫升PDB液体培养基中，30℃、130转/分振荡培养22小时后得到木霉菌菌丝，无菌条件下收集菌丝于无菌的50毫升的离心管中，并确定其重量。
将崩溃酶用0.7摩尔/升NaCl溶液配制浓度为15毫克/毫升的酶液，加入到盛有菌丝的离心管中，加入量为菌丝重的2倍。将离心管放在摇床上，30℃下150转/分振荡培养4小时。过滤除去菌丝碎片，并用0.7摩尔/升NaCl溶液冲洗菌丝，收集原生质体溶液于50毫升离心管中。将离心管在4℃下以4000转/分钟离心15分钟，倒掉上清液，再向管中加入5毫升山梨糖醇缓冲液冲洗原生质体沉淀，并在4℃下4000转/分离心15分钟，倒掉上清液，收集原生质体，重新用山梨醇缓冲液反复洗涤原生质体2～3次。最后根据得到的原生质体的量向管中加入山梨糖醇缓冲液，调节原生质体浓度至107-108个/毫升。
2.pV2质粒的提取与DNA消化吸取含有质粒PV2的冷冻保存的菌种100微升，加到含有50微克/毫升的氨苄青霉素的100毫升的LB液体培养基上，37℃200转/分摇床培养15小时，取已培养至对数生长期的1.5毫升细菌培养液放于1.5毫升的离心管中，5000转/分离心5分钟。弃上清，向留有沉淀的离心管中加入100微升含有50毫摩尔/升葡萄糖，10毫摩尔/升乙二胺四乙酸，25毫摩尔/升Tris HCl的溶液I进行悬浮沉淀，冰浴5-10分钟，再加入200微升含200m摩尔/升NaOH，1％SDS的溶液II，置冰浴5分钟使质粒DNA变性后，再加入150微升含3摩尔/升醋酸钾，pH4.8的溶液III，混匀，冰浴5-10分钟。向离心管中加入450微升的按体积25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶异戊醇的混合物进行抽提，10000转/分离心10分钟。吸取上清于另一离心管中，向其中加入与上清等体积的按体积25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶异戊醇的混合物进行抽提，重复此抽提步骤2-3次。最后小心吸取上清于另一离心管中，向管中加入上清液的2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30分钟左右，10000转/分离心10分钟，倒掉上清，向管中沉淀加入50微升10毫摩尔/升Tris.Hcl，1毫摩尔/升乙二胺四乙酸配置的缓冲液，得到了含有少量RNA的DNA溶液。向此溶液中加入无DNA的RNase A，使其终浓度达10-20微克/毫升左右，37℃温育30分钟，去除RNA得到质粒DNA。
3.转化取1.5毫升的离心管，加入定量的pV2质粒40微克，10个单位/微升的介导酶HindIII 10微升，200微升的山梨醇缓冲液，配制成酶-质粒混合液，置冰上备用。取100微升调好浓度的原生质体悬浮液于50毫升离心管中，再加入上步已配好的酶-质粒混合液，混匀后，置冰上20分钟。逐滴向管中缓慢加入2毫升聚乙二醇，置冰上25分钟后，然后将离心管取出在28℃下放置10分钟，再向离心管中加入5毫升冰预冷的山梨醇缓冲液，然后于4℃下2000转/分钟离心15分钟，弃上清。加入3毫升液体再生培养基，28℃下放置6小时。将培养液倒入培养皿中，然后加入约15毫升预先熔化好的，并且冷却至50℃左右的固体再生培养基，尽快摇晃使培养液与培养基混匀，使其冷却干燥，熔化水琼脂，并冷却至50℃左右，加入潮霉素至浓度为300微克/毫升，快速倒入平板中，在培养基表面铺满一层为止，每个平板约需10毫升，在28℃下，培养4天，将能够抗潮霉素的菌落转移到预先倒好的含有潮霉素250微克/毫升的固体PDA培养基上进行二次筛选，第二次筛选得到的木霉菌即为所要得到的转化体。
根据抗潮霉素基因序列，设计引物进行PCR检测，以pV2为模板和潮霉素和氨苄青霉素的基因序列为探针，转膜印迹检测转化子。经PCR和Southern blot检测为突变株的转化子经继代培养，将确定为可以稳定遗传的转化子的菌株制成硅胶粒在-20℃冰箱中保存，用于优良生物防治菌株筛选。
生物防治活性鉴定不同木霉菌转化子防治黄瓜枯萎病的效果明显不同。TC6、TD5、TF1、TK1转化子的防治效果优于出发菌株T23，其中TD5和TK1的防治效果最好，防效分别比出发菌(亲本菌株)提高15％和25％。
权利要求
1.一种木霉菌转化子的限制性内切酶介导基因整合化构建方法，其特征在于包括如下具体步骤(1)木霉菌菌株原生质体的制备首先将木霉菌在PDA固体培养基上培养产孢后，用无菌水洗下木霉菌孢子，然后将木霉菌孢子加入PDB液体培养基中，在25-30℃下，100-150转/分摇床培养18-22小时，过滤收集菌丝，再用0.7摩尔/升NaCl溶液冲洗菌丝；将崩溃酶用0.7摩尔/升NaCl溶液配制浓度为13-20毫克/毫升的酶液，将上述得到的菌丝放入离心管，再将配制好的崩溃酶酶液以菌丝2倍体积的量加到离心管中，在25-30℃下以120-150转/分振荡培养3-4小时，然后过滤，并用0.7摩尔/升NaCl溶液冲洗菌丝，收集原生质体于离心管中，将离心管得到的原生质体溶液离心、去上清；然后重复向离心管中加入山梨糖醇缓冲液冲洗原生质体沉淀、离心、去上清2-3次；再根据得到的原生质体的量向离心管中加入山梨糖醇缓冲液，调节原生质体浓度至107-108个/毫升；其中，所述山梨糖醇缓冲液的组分为山梨醇316.256克、PH7.5的1摩尔/升Tris-Hcl 10毫升、CaCl21.11g，加水定容到1000ml；(2)质粒提取与DNA消化吸取含有质粒PV2的冷冻保存的菌种100微升，加到含有50微克/毫升的氨苄青霉素的100毫升的LB液体培养基上，37℃140-200转/分摇床培养12-16小时，取已培养至对数生长期的1.5毫升细菌培养液放于1.5毫升的离心管中，5000转/分离心5分钟，弃上清，向留有沉淀的离心管中加入100微升含有50毫摩尔/升葡萄糖，10毫摩尔/升乙二胺四乙酸，25毫摩尔/升Tris-HCl的溶液I进行悬浮沉淀，冰浴5-10分钟，再加入200微升含200毫摩尔/升NaOH，1％SDS的溶液II，置冰浴5分钟使质粒DNA变性后，再加入150微升含3摩尔/升醋酸钾，pH4.8的溶液III，混匀，冰浴5-10分钟；向离心管中加入450微升的按体积25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶异戊醇的混合物进行抽提，10000转/分离心10分钟；吸取上清于另一离心管中，向其中加入与上清等体积的按体积25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶异戊醇的混合物进行抽提，重复此抽提步骤2-3次；最后吸取上清于另一离心管中，向管中加入上清液的2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30分钟，10000转/分离心10分钟，倒掉上清，向管中沉淀加入30-50微升10毫摩尔/升Tris.Hcl，1毫摩尔/升乙二胺四乙酸配置的缓冲液，得到含有RNA的DNA溶液；向此溶液中加入无DNA的RNase A，使其终浓度达10-20微克/毫升，37℃温育30-60分钟，去除RNA得到质粒DNA；其中，所述LB培养基的组分为10克胰化蛋白胨、5克酵母提取物、5克NaCl，溶于950毫升去离子水中，调节pH值到7.0，每瓶100毫升分装灭菌后备用；(3)转化在50毫升离心管中加入质粒40微克、浓度为10个单位/微升限制性内切酶HindIII10微升、山梨醇缓冲液200微升，配制成酶-质粒混合液，然后向离心管中加入100-200微升原生质体悬浮液，并使其与酶-质粒混合液混匀，置冰上15-20分钟，缓慢向管中加入2毫升聚乙二醇，冰浴20-25分钟，然后将离心管取出在28℃下放置10-20分钟，加入5毫升预冷的山梨醇缓冲液，4℃下2000转/分离心15分钟，弃上清，加入3毫升液体再生培养基，25-30℃下放置6小时；然后将培养液倒入培养皿中，加入15毫升预先熔化并冷却至50℃的固体再生培养基，混匀后冷却干燥，熔化水琼脂，并冷却至50℃，加入潮霉素至浓度为300微克/毫升，快速倒入平板中，在28-30℃下，培养4-5天，将能够抗潮霉素的菌落转移到预先倒好的含有潮霉素250微克/毫升的固体PDA培养基上进行二次筛选，能够继续生长的菌落为得到的木霉菌转化体；其中，所述液体再生培养基的组分为(NH4)2SO42.8克、尿素600毫克、磷酸钾4克、葡萄糖40克、蔗糖100克、CaCL2600毫克、MgSO4.10H2O 200毫克、FeSO4.7H2O 10毫克、ZnSO4.7H2O 1.8毫克、MnSO4.H2O 3.2毫克、CoCL2.6H2O 4毫克；所述固体再生培养基的组分是在液体再生培养基组分的基础上，再加入琼脂17-20克。
2.根据权利要求1的木霉菌转化子的限制性内切酶介导基因整合化构建方法，其特征在于根据抗潮霉素基因序列，设计引物进行PCR检测，以pV2为模板和潮霉素和氨苄青霉素的基因序列为探针，转膜印迹检测转化子；经PCR和Southern blot检测为突变株的转化子经继代培养，将确定为可以稳定遗传的转化子的菌株制成硅胶粒在-20℃冰箱中保存，用于优良生物防治菌株筛选。
全文摘要
本发明涉及一种木霉菌转化子的限制性内切酶介导基因整合化构建方法，首先通过产孢、菌丝培养以及采用崩溃酶酶液和山梨糖醇缓冲液处理，得到木霉菌菌株原生质体，然后将提取质粒DNA与制备的木霉菌原生质体混合，在限制性内切酶的作用下，使外源线性质粒片段插入染色体组诱导插入突变，最后对突变的转化子进行筛选，得到比亲本生防效果更好的优良生物防治木霉菌突变株。本发明利用限制性内切酶介导的基因整合化技术可以得到大量的木霉菌转化子，并可从中筛选到对番茄灰霉病和黄瓜枯萎病等防治效果显著高于野生菌株的转化子，为扩大菌种资源，克隆生物防治基因资源，获得多功能生物防治菌株奠定基础。
文档编号C12R1/885GK1916177SQ20061003090
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月7日 优先权日2006年9月7日
发明者陈捷, 刘限, 黄玉茜, 管丽萍 申请人:上海交通大学