专利名称：降解氰化物污染木霉菌转化子的筛选与固定化制备方法
技术领域：
本发明涉及一种降解氰化物污染木霉菌转化子的筛选与固定化制备方法，从利用限制性内切酶介导的基因整合技术(REMI)得到的木霉菌转化子中，筛选到具有高氰化物降解活性的木霉菌转化子，将其细胞固定化后应用于含氰废水的处理。
背景技术：
由于现代工业发展对产业生态保护日益重视，因此有效的处理工业排放的废弃物是建立绿色工业的需要。氰化物作为工矿企业经常释放的废弃物中的主要成分，是对环境生物毒性最高的化学污染物之一，并可在水体和土壤中较长期富集。氰化物毒性机制至少有三种(1)与二价或三价的金属形成复合物，(2)在酶解过程中生成稳定的氰或腈衍生物，(3)与酮基团形成氰醇。
目前对于氰化物污染物处理最为常用的就是化学法，但其价格昂贵，污泥产量高，在处理过程中常常引入其他有害试剂，同时对于某些金属氰化物的降解效率非常低。因此，急需一种低成本、高效率的方法来处理被氰化物污染的废水和土壤，而生物降解则是最有前景的方法之一。
迄今为止，已经发现很多微生物都具有降解氰化物的能力，木霉便是其中之一。微生物主要是通过产生硫氰酸酶和氰水合酶降解游离氰化物。然而在活体微生物处理氰化物过程中发现，其对氰化物降解活性将受到多方面因素的影响，如与污水或土壤中其他微生物的竞争作用，生长受环境某种化学物质(离子)的抑制，抗逆能力差等。木霉作为土壤习居菌长期以来一直作为有生防价值的拮抗性真菌，其生长速度快，抢占空间时间短，竞争力强，同时其产生的厚垣孢子对环境高温、高湿，干旱等逆境的抗性高，因此是一种很有实用价值的，能兼顾防治农作物病害的多功能氰化物降解微生物。然而，目前自然筛选的木霉菌菌株降解活性一般较低，而且筛选的工作量大，很难获得各方面特性均理想的降解菌株，因此需要利用生物技术改良野生株，筛选出比野生株氰化物降解酶系活性更高的菌株。
活体降解微生物直接应用于污染环境的修复受到很多条件限制，因此一般需要经过固定化之后才能更好的发挥降解效应。利用固定化细胞建立高效的废水处理系统于20世纪70年代就已经开始了，此技术具有反应器生物浓度高，处理能力大，污泥产量少，菌种高纯高效，适应水质和pH变化等优点。然而，利用固定化技术固定微生物，需要解决废水中各种离子对固定化细胞的侵蚀和固定化载体结构易被破坏等问题，为此，需要研究如何提高固定化细胞机械强度和稳定性，并保持固定化细胞原有的高降解活性。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种降解氰化物污染木霉菌转化子的筛选与固定化制备方法，得到的木霉菌转化子能够有效降解水体中的氰化物。
为实现这一目的，本发明首先利用限制性内切酶介导基因整合技术构建木霉菌突变株，通过对出发菌株及其转化子间氰化物降解酶系的活性比较分析，筛选出对氰化物高降解活性的木霉菌转化子，然后在确定了固相化过程中海藻酸钠和CaCl2浓度、菌丝包埋量、固定化时间、降解温度与时间等因素的基础上，使用海藻酸钠作为载体包埋转化子细胞，制备固定化细胞小球。最后检测固定化木霉菌转化子对含氰废水修复效应。
本发明的方法具体包括如下步骤1、木霉菌转化子的构建采用质粒30-40μg、浓度为10U/μl的限制性内切酶HindIII10μl、山梨醇缓冲液(1M pH7.5)即STC 200μl，配制成酶-质粒混合液，待用。将浓度为106-108/ml的木霉菌原生质体悬浮液100μl与配制成的酶-质粒混合液混匀后，缓慢加入浓度为60％2ml聚乙二醇即PEG，加入5ml预冷的STC，4℃下2000rpm离心15分钟，弃上清，加入3ml液体再生培养基，混匀，倒入无菌培养皿中，加入15-20ml已溶解好并冷却到45-55℃的固体再生培养基，20-25℃下放置6小时后，倒入含300μg/ml潮霉素的水琼脂10-15ml，平铺在再生培养基上，2-3天后出现转化子。将转化子培养在含有250μg/ml潮霉素的PDA培养基进行二次筛选，对可以正常生长的转化子进行5-7代PDA培养基培养后，再一次将转化子培养在含有250μg/ml潮霉素的PDA培养基上，此时仍旧能够正常生长的就是通过REMI技术得到的稳定的转化子，把他们接种到PDA斜面上放在4℃冰箱中保存。
其中，所述液体再生培养基的配制为分别取硫酸铵2.8g，尿素600mg，硫酸钾4g，无水氯化钙600mg，葡萄糖40g，蔗糖100g，MgSO4·10H2O 200mg，FeSO4·7H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 1.8mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl2·6H2O 4mg加入到800ml水中，调节pH值至5.0。固体培养基则在液体培养基的基础上加入18-20g琼脂粉。
2、转化子的硅胶粒保存通过对木霉氰化物降解酶的测定后，将得到的降解氰化物活性高的木霉菌转化子在28℃条件下置于PDA(马铃薯-葡萄糖-琼脂)培养基培养，平板培养5-7天，使绿色孢子布满整个培养皿。取螺旋口玻璃管，放入硅胶粒到玻璃管体积的1/4-1/2，经干热灭菌处理后，冷却，使用前冰浴15-30分钟。取5％灭菌的脱脂牛奶0.5-2毫升加入培养皿中，水平摇晃，制成孢子悬液。用无菌移液管或枪吸取0.5-1毫升的孢子悬液，加到已冷却的玻璃管中的硅胶粒表面，盖上盖后，迅速摇动，使硅胶粒湿润并粘上孢子，立即放回冰浴。10-20分钟后，拧紧盖子放入4℃或-20℃冰箱中保存。
3、菌丝的培养取一粒上述浸润孢子悬液的硅胶粒，放置于倒有PDA的培养基上，培养5-7天后，绿色孢子产生，挑取长有孢子的菌丝与5ml-6ml无菌水混合，挑取的孢子量使混合溶液呈绿色即可，用三层擦净纸过滤得到滤液；取3ml滤液放入50-100ml PDB(马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母浸膏15g，加水定容到1000ml)液体培养基，在摇床中，28℃下100-140rpm下培养60-70小时。将培养好的菌丝，三层擦镜纸过滤，并用0.7M的NaCl或无菌水将菌丝中培养基冲洗干净，得到绿色的湿菌丝体。
4、固定化小球的制备按2g-3g海藻酸钠、1g硅藻土置于100ml蒸馏水的比例，将海藻酸钠、硅藻土置于蒸馏水中，加热搅拌溶解并湿热灭菌，配制成海藻酸钠溶液。
配制质量浓度为2-3％的CaCl2溶液，装于瓶中湿热灭菌。按每200ml海藻酸钠溶液中放入湿菌丝5克的比例，将湿菌丝放入灭菌后的海藻酸钠溶液中搅拌均匀，使用20-50ml注射器吸取菌丝混合液，用针头将其打入200ml-400ml的上述CaCl2溶液中并匀速搅拌，形成φ3-5mm的小球，之后小球在CaCl2溶液中4℃下固定2-3小时，过滤得到固定化小球。用已灭菌的质量浓度为0.9％的NaCl溶液冲洗，洗去未结合的钙离子。继续将小球放入体积浓度为0.1-0.3％的戊二醛溶液中进行交联30秒-2分钟。用无菌水冲洗后，得到制备好的固定化小球，即为固定化木霉菌转化子，4℃保存。
将采用本发明方法得到的固定化木霉菌转化子加入到含有氰化物的基础离子培养基中，52ppm和250ppm，500ppm的CN-分别在60小时，12天，22天后，降解率达到95％以上，氰化物的残留浓度均低于国家检测标准。
利用本发明制备的固定化小球来降解氰化物，其降解速度比游离细胞的降解速度要快，而且方便回收，回收的小球在用3％的CaCl2固定2小时后，又可以用于下一批的氰化物降解实验。
具体实施例方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例11、转化子构建和获得采用质粒40μg、浓度为10U/μl的限制性内切酶HindIII10μl、山梨醇缓冲液(1M pH7.5)即STC 200μl，配制成酶-质粒混合液，待用。将浓度为106/ml的木霉菌原生质体悬浮液100μl与前已配制完成的酶-质粒混合液混匀后，缓慢加入浓度为60％2ml聚乙二醇即PEG，加入5ml预冷的STC，4℃下2000rpm离心15分钟，弃上清，加入3ml液体再生培养基，混匀，倒入9cm无菌培养皿中，加入已溶解好的冷却到45℃，20ml固体再生培养基，25℃下放置6小时后，倒入含300μg/ml潮霉素的水琼脂10ml，平铺在再生培养基上，2天后出现转化子。将转化子培养在含有250μg/ml潮霉素的PDA培养基进行二次筛选，对可以正常生长的转化子进行7代PDA培养基培养后，再一次将转化子培养在含有250μg/ml潮霉素的PDA培养基上，此时仍旧能够正常生长的就是通过REMI技术得到的稳定的转化子，把它们接种到PDA斜面上放在4℃冰箱中保存。
其中，所述液体再生培养基的配制为分别取硫酸铵2.8g，尿素600mg，硫酸钾4g，无水氯化钙600mg，葡萄糖40g，蔗糖100g，MgSO4·10H2O 200mg，FeSO4·7H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 1.8mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl2·6H2O 4mg加入到800ml水中，调节pH值至5.0；固体培养基则在液体培养基的基础上加入18-20g琼脂粉。
2、TkA8转化子筛选与硅胶粒保存将REMI技术得到的转化子进行降解氰化物酶系活性筛选后，得到了T30转化子TkA8。将TkA8在PDA上28℃培养6天后，使绿色孢子长满整皿。之前的准备工作中，将硅胶粒装满螺旋口玻璃管的1/3，配制5％脱脂奶粉50ml，并湿热灭菌。开始硅胶粒菌种保存前，先将硅胶粒管冰浴30分钟。取出已培养好的TkA8，在培养皿中放入1ml的5％无菌脱脂奶粉，晃动培养皿，制成孢子悬液，吸取0.5ml的孢子悬液入在冰浴中的硅胶粒管中，迅速拿出剧烈摇动，以保证所有硅胶粒上都粘有孢子即可，再将其放回冰浴中，15分钟后取出，放入-20℃冰箱保存。
3、TkA8转化子菌丝的培养取出TkA8转化子硅胶粒一颗，放在已倒好PDA的培养皿中央，28℃温箱中培养7天后，接种钩挑出1/3皿上长有孢子的菌丝，与5ml无菌水混合，过滤后得到孢子悬液，取3ml于50ml PDB(马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母浸膏15g，加水定容到1000ml)液体培养基中，28℃，转速140rpm，培养70小时。之后，菌丝通过放了三层擦净纸布氏漏斗过滤得到，用0.7M的NaCl的灭菌溶液洗去菌丝中的培养基。
4、固定化细胞小球的制备固定化细胞制备前，先称取6g海藻酸钠和2g硅藻土溶于200ml水中，溶解过程中要加热搅拌，配制质量浓度为3％CaCl2溶液400ml，所用溶液均湿热灭菌。另外配制体积浓度为0.3％400ml戊二醛溶液待用。将灭菌的海藻酸钠-硅藻土200ml倒入400ml的烧杯中，称取10g TkA8湿菌丝体(湿菌丝体∶海藻酸钠-硅藻土＝1∶20)于其中，放入转子搅拌，直至菌丝分布均匀。取无菌注射器，吸取海藻酸钠-硅藻土-菌丝混合物，使用12号针头将菌丝混合物注射入3％CaCl2溶液中，同时不断搅拌CaCl2溶液，小球瞬时形成。将200ml的菌丝海藻酸钠混合物都制备成小球后，让它们在CaCl2溶液中，4℃条件下固定2小时，过滤得到固定化小球，用0.9％NaCl溶液冲洗去多余的钙离子后，将小球在4℃的0.3％戊二醛溶液中交联1分钟，过滤用无菌水洗净。得到待用的固定化小球。游离菌丝与包埋入菌丝的海藻酸钙小球的比例约为1∶18。
称取10克固定化小球于基础离子培养基中，固定化小球的重量与基础离子培养基的体积之比为1∶7.5，并加入终浓度为52微克/毫升CN-氰化钾溶液，180转/分振荡培养60小时后测定CN-浓度，降解率达到95％。
将已降解完全的培养基中的固定化小球取出，无菌水洗净后，放入3％CaCl2溶液中，4℃固定2小时，得到的小球可以继续利用降解含氰溶液，降解效率为新鲜制备的小球的92％，并且可以循环使用6次以上。
实施例21、转化子构建和获得采用质粒30μg、10U/μl的限制性内切酶HindIII10μl、山梨醇缓冲液(1MpH7.5)即STC 200μl，配制成酶-质粒混合液，待用。将浓度为106/ml的木霉菌原生质体悬浮液100μl与前已配制完成的酶-质粒混合液混匀后，缓慢加入浓度为60％2ml聚乙二醇即PEG，加入5ml预冷的STC，4℃下2000rpm离心15分钟，弃上清，加入3ml液体再生培养基，混匀，倒入9cm无菌培养皿中，加入已溶解好的冷却到55℃，15ml固体再生培养基，25℃下放置6小时后，倒入含300μg/ml潮霉素的水琼脂10ml，平铺在再生培养基上，3天后出现转化子。将转化子培养在含有250μg/ml潮霉素的PDA培养基进行二次筛选，对可以正常生长的转化子进行5代PDA培养基培养后，再一次将转化子培养在含有250μg/ml潮霉素的PDA培养基上，此时仍旧能够正常生长的就是通过REMI技术得到的稳定的转化子，把它们接种到PDA斜面上放在4℃冰箱中保存。
2、TkB5转化子筛选与硅胶粒保存将REMI技术得到的转化子进行降解氰化物酶系活性筛选后，得到了T30转化子TkA8。将TkA8在PDA上28℃培养6天后，使绿色孢子长满整皿。之前的准备工作中，将硅胶粒装满螺旋口玻璃管的1/3，配制5％脱脂奶粉50ml，并湿热灭菌。开始硅胶粒菌种保存前，先将硅胶粒管冰浴30分钟。取出已培养好的TkA8，在培养皿中放入1ml的5％无菌脱脂奶粉，晃动培养皿，制成孢子悬液，吸取0.5ml的孢子悬液入在冰浴中的硅胶粒管中，迅速拿出剧烈摇动，以保证所有硅胶粒上都粘有孢子即可，再将其放回冰浴中，15分钟后取出，放入-20℃冰箱保存。
3、TkB5转化子菌丝体的培养取出TkB5转化子硅胶粒二颗，放在已倒好PDA的培养皿中，28℃温箱中培养5天后，接种钩挑出1/2皿菌丝，与5ml无菌水混合，过滤后得到孢子悬液，取5于100ml PDB液体培养基中，28℃，转速140rpm，培养60小时后，菌丝通过放了三层擦净纸布氏漏斗过滤得到，用无菌水将残留的培养基冲洗干净。
4、固定化小球的制备固定化小球制备前，先称取3g海藻酸钠和1克硅藻土溶于100毫升水中，溶解过程中要加热搅拌，配制3％CaCl2溶液200毫升，所用溶液均湿热灭菌。另外配制0.3％戊二醛200ml溶液待用。将灭菌的海藻酸钠-硅藻土100毫升倒入200毫升的烧杯中，称取5g TkB5湿菌丝体放于其中，搅拌至菌丝分布均匀。取具12号针头的无菌注射器，吸取海藻酸钠-硅藻土-菌丝混合物，注入3％CaCl2溶液中，不断搅拌，小球瞬时形成。将200毫升的菌丝小球加入CaCl2溶液，4℃条件下固定3小时，过滤得到固定化小球，用0.9％NaCl溶液冲洗去多余的钙离子后，将小球在4℃的0.3％戊二醛溶液中交联2分钟，过滤用无菌水洗净，即得到待用的固定化小球。
称取12.5g制备好的固定化小球放入100ml pH6.5的基础培养基，加入500ppm CN-终浓度的氰化钾，28℃，140转/分，振荡培养。在22天后，培养基中的KCN浓度的浓度可降解到0.2ppm。
权利要求
1.一种降解氰化物污染木霉菌转化子的筛选与固定化制备方法，其特征在于包括以下步骤1)木霉菌转化子的构建采用质粒30-40μg、10U/μl的限制性内切酶HindIII10μl、STC山梨醇缓冲液200μl，配制成酶-质粒混合液；将浓度为106-108/ml的木霉菌原生质体悬浮液100μl与配制成的酶-质粒混合液混匀后，缓慢加入浓度为60％2ml聚乙二醇，加入5ml预冷的STC，4℃下2000rpm离心15分钟，弃上清，加入3ml液体再生培养基，混匀，倒入无菌培养皿中，加入15-20ml已溶解好并冷却到45-55℃的固体再生培养基，20-25℃下放置6小时后，倒入含300μg/ml潮霉素的水琼脂10-15ml，平铺在再生培养基上，2-3天后出现转化子；将转化子培养在含有250μg/ml潮霉素的PDA培养基进行二次筛选，对正常生长的转化子进行5-7代PDA培养基培养后，再一次将转化子培养在含有250μg/ml潮霉素的PDA培养基上，将仍能正常生长的稳定的转化子接种到PDA斜面上，放在4℃冰箱中保存；其中，所述液体再生培养基的配制为分别取硫酸铵2.8g，尿素600mg，硫酸钾4g，无水氯化钙600mg，葡萄糖40g，蔗糖100g，MgSO4·10H2O 200mg，FeSO4·7H2O 10mg，ZnSO4.7H2O 1·8mg，MnSO4.H2O 3·2mg，CoCl2·6H2O 4mg加入到800ml水中，调节pH值至5.0；固体培养基则在液体培养基的基础上加入18-20g琼脂粉；2)转化子的硅胶粒保存将经降解酶活性测定后得到的降解氰化物活性高的木霉菌转化子在28℃条件下置于PDA培养基培养，平板培养5-7天，使绿色孢子布满整个培养皿，取螺旋口玻璃管，放入硅胶粒到玻璃管体积的1/4-1/2，经干热灭菌处理后，冷却，使用前冰浴15-30分钟；取5％灭菌的脱脂牛奶0.5-2毫升加入培养皿中，水平摇晃，制成孢子悬液；用无菌移液管或枪吸取0.5-1毫升的孢子悬液，加到已冷却的玻璃管中的硅胶粒表面，盖上盖后，迅速摇动，使硅胶粒湿润并粘上孢子，立即放回冰浴，10-20分钟后，拧紧盖子放入4℃或-20℃冰箱中保存；3)菌丝的培养取一粒上述浸润孢子悬液的硅胶粒，放置于倒有PDA的培养基上，培养5-7天后产生绿色孢子，挑取长有孢子的菌丝与5-6ml无菌水混合使混合溶液呈绿色，然后过滤，取3ml滤液放入50-100ml PDB液体培养基，在摇床中，28℃、100-140rpm下培养60-70小时；将培养好的菌丝过滤，并用0.7M的NaCl或无菌水将菌丝中培养基冲洗干净，得到绿色的湿菌丝体；4)固定化小球的制备按2g-3g海藻酸钠、1g硅藻土置于100ml蒸馏水的比例，将海藻酸钠、硅藻土置于蒸馏水中，加热搅拌溶解并湿热灭菌，配制成海藻酸钠溶液；配制质量浓度为2-3％的CaCl2溶液，装于瓶中湿热灭菌，按每200ml海藻酸钠溶液中放入湿菌丝5克的比例，将湿菌丝放入灭菌后的海藻酸钠溶液中搅拌均匀，使用20-50ml注射器吸取菌丝混合液，用针头将其打入200ml-400ml的上述CaCl2溶液中并匀速搅拌，形成φ3-5mm的小球，之后小球在CaCl2溶液中4℃下固定2-3小时，过滤得到固定化小球；用已灭菌的质量浓度为0.9％的NaCl溶液冲洗后，继续将小球放入体积浓度为0.1-0.3％的戊二醛溶液中进行交联30秒-2分钟，用无菌水冲洗后，得到制备好的固定化小球，即为固定化木霉菌转化子，4℃保存。
全文摘要
本发明涉及一种降解氰化物污染木霉菌转化子的筛选与固定化制备方法，首先利用限制性内切酶介导基因整合技术构建木霉菌突变株，通过对出发菌株及其转化子间氰化物降解酶系的活性比较分析，筛选出对氰化物高降解活性的木霉菌转化子，然后在确定了固相化过程中海藻酸钠和CaCl
文档编号C12N15/80GK1916157SQ20061003090
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月7日 优先权日2006年9月7日
发明者陈捷, 周晓英, 刘力行, 陈云鹏 申请人:上海交通大学