专利名称：一种细菌质粒及其衍生质粒与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌质粒及其衍生质粒与应用。
背景技术：
质粒(plasmid)是染色体外遗传因子，能够进行自主复制，不具有胞外期，非寄主细胞生长、代谢、繁殖等生命活动所必需，但能赋予宿主细胞某些特殊属性，如对抗生素的耐受性，对有毒化合物的降解或利用特性。现有的研究结果表明，自然界中的许多现象，如微生物对污染物(或生物异生体)的降解，或者对抗生素或重金属等的抗性，甚至微生物的功能、特性变化与基因进化等生命现象都往往与质粒有关。目前关于质粒的研究相当普遍、深入，如一些非常著名的降解性质粒TOL，NAH等，抗性质粒ColE1，性质粒F因子等，研究内容涉及到质粒的复制机理，质粒上携带的功能基因的表达、调控等方面的内容。随着分子生物学技术手段的日益发展与完善，人们不断地从自然界中发现新质粒，其相关功能被人类合理地加以利用，值得一提的是，可移动遗传因子(mobile geneticelements，MGEs)及其水平基因转移(horizontal genes transfer，HGT)的研究，是目前生命科学的前沿课题与研究热点，其中涉及到一类非常重要的MGEs，即大片段的接合性质粒，越来越多的实验证据表明，接合性质粒在微生物的基因进化、种群演化等生命过程中起着极其重要的作用。
质粒的另外一个重要用途是作为基因工程载体。质粒能在适当的宿主细胞中进行自主复制，并且在大多数情况下不会对寄主造成毁灭性的损伤，可以很方便地将整合到自身的外源基因引入到目标受体细胞中，因此，常用作目标基因的克隆、表达载体。作为克隆外源DNA的质粒载体，应该具备以下性质1)能够在适当的受体细胞中独立自主地进行复制；2)具有一定的选择性标记；3)含有多个单酶切限制位点，用于外源DNA的插入；4)质粒本身尽可能地小，一般为松弛型复制的多拷贝数质粒；5)在受体细胞中不与其他复制子发生重组；6)不能自发进行接合转移(self-transmissible)；7)若是要表达克隆的外源基因，还需带上适当的启动子序列。而一个优良的质粒工程载体通常应该具备以下基本特征1)具有较高的克隆能力；2)较大的克隆容量；3)基因操作比较容易进行；4)若是作为表达载体，尚需携带较强的启动子。
生物技术是目前污染治理中常见与有效的手段，因其成本低、治理效果较好、可处理的污染对象较宽、二次污染轻、环境相容性好等优势，是人们治理污染时首选的工艺方案之一。微生物种类繁多，其代谢途径纷繁复杂；微生物的生命现象简单，遗传变异的几率是相当高的，因此，各种新的代谢途径的产生可能性与速度也是相当可观的。有些学者认为，只要时间足够长，自然界是可以进化出可以利用任何一种可能的化合物的生化途径，意味着自然界中的任何物质，无论是天然存在的还是人工合成的，都是能够被一定的微生物利用或降解的。因此，从理论上讲，生物技术是可以适用于所有类型的污染源治理的，只要污染物的浓度与毒性没有超出特定微生物群落的生物极限。传统的生物处理工艺如活性污泥法，生物膜法，往往采用自然界中普遍存在的微生物群体，虽然经过一定的驯化手段，获得了一定的适应性。但是，目前国内外的工艺运行结果显示，这种“朴素”的微生物群体对污染源的处理降解效率往往不是很高，并且在的生物系统中，有很大比例的微生物并不能起到降解或絮凝等作用，但是同样地占据各种营养资源与空间，并且有些微生物之间甚至可能存在拮抗作用。为了改变这样的局面，人们采取“生物增强技术”(Bioaugmentation)进行各种污染源的治理，即向污染体系中投加经过人工改造的功能微生物群体，以增大对其中某种或某一类污染物的降解效率，从而提高整个生物处理系统的作用效率。自20世纪80年代以来，生物强化技术在一些工业废水的治理中取得了一定的效果。但是，由于当时检测手段等客观条件的限制，无法精确检测投加菌的活动规律，难以对目标菌进行有效地调控，创造适宜的环境条件促进功能微生物的生长、繁殖，这样，目标菌释放到污染体系中之后，往往难以成为体系中的优势菌，降低了“生物增强”效果。
最近提出的“基因强化技术”(gene enhanced technology，GET)是指向污染体系中投加具有一定功能的目标基因或携带某些目标基因的载体细胞，同时，创造适宜的条件激发或促使目标基因在体系中的微生物群落之间迅速转移、传播，并进一步在生物体中进行功能表达，使较多的微生物发生基因水平上的变化，获取了相应的功能。这样，从比较深刻的层面上，促进微生物群体功能的进化，提高了整个微生物群体对污染物的处理能力与效率。
因此，从被某些特定的污染物长期污染、驯化的环境中采集样品(土样或者水样)，从中富集、分离、纯化所需的目标微生物，并进一步提取、纯化功能性质粒，或者直接从采集的样品中提取质粒，所述的两种方法均是获取降解、抗性等功能基因的简捷、有效途径，也是从自然界中获取目标功能基因的有效途径，现有的分子生物学技术，如PCR，原位杂交技术等，已经可以实现直接从环境中获取符合各种目的的特定基因或有用片段，将来用于环境治理基因产品的制备与使用。
虽然，分子生物学操作中使用质粒载体相当普遍而且已经商品化制备与销售，如pUC系列，pGEM系列，Bluescript系列等，但是，大多数商品化的基因操作载体来自于大肠杆菌系列，目前，源于环境微生物如假单胞菌属、产碱杆菌属等的工程载体并不很多，一些相关工作取得了初步研究结果。假单胞菌是自然界中一类非常普遍的细菌，广泛存在于土壤、水体、和一些污染环境中，人们开展了这类微生物的质粒克隆载体及其宿主菌等方面的研究，Frh等利用重组/突变的方法获得了较好的可用于基因克隆的宿主菌，Dunn等人也得到了铜绿假单胞菌PAO1162的可用于基因克隆的突变株，目前各种类型的克隆载体，包括表达载体、启动子探针载体等功能载体已经被构建出来，并且已经用于污染物生物降解与环境监测中。一个很著名的例子是，研究地较为透彻的质粒RSF1010，其上的三个基本复制蛋白(repA，repB，repC)及一个复制起点oriV已被鉴定出来，该类质粒具有广泛寄主范围，尺寸较小(8.7kb)，因此，常被用作基本复制子构建其他的克隆载体，如质粒pKT231(13kb)即是其目前最常用的衍生体。该质粒具有卡那霉素、四环素抗性，含有11个单切点限制酶位点，其中5个可实现卡那的插入失活，因此可作为克隆位点，另外，这一类的质粒具有一个特殊的优势，即，在含有某些接合性质粒的宿主中，可以被诱动而发生转移。因此，是目前环境生物技术中比较有前景的载体质粒。
现有的质粒载体(尤其是原核生物的基因工程操作)的应用范围非常广泛，已经发展到一个相当成熟、经典的阶段，但是大多数质粒载体用在临床医学、基础微生物学方面，而用于环境微生物、工业微生物、以及土壤微生物等方面的特种质粒很有限。根据遗传学基本规则，质粒作为染色体外遗传因子，种属间的差异不是特别明显，但是，任何质粒仍然具有自己特定的寄主范围，因此，有必要设法增大质粒的寄主范围。除了成为一种在原核生物中具有广泛的寄主，同时希望成为可以在不同种属间进行穿梭转移的基因载体，例如，可以在细菌与真菌间进行传递DNA的工程载体。所以，进行环境微生物多功能质粒载体的研究是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种细菌质粒及其衍生质粒与应用。
本发明所提供的细菌质粒，名称为pW240，来源于人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)W24 CGMCC №1649它具有序列表中序列1的核苷酸序列。
序列表中序列1由4227个核苷酸组成。其中，序列1中的自5′端第3896-2481位核苷酸为一个诱动基因(mob基因)的编码序列；序列1中的自5′端第1487-21位核苷酸为复制蛋白(rep)基因编码序列。
质粒pW240的物理图谱如图2a所示，包括的常见限制性内切酶位点，其中的单酶切位点有SmaI，XbaI，XmaI，SpeI，SacI等识别位点。
本发明还提供了一种pW240的衍生质粒pW241，物理图谱如图2b所示。
所述pW241是在pW240中插入卡那霉素抗性基因后得到的质粒；所述卡那霉素抗性基因插入到序列表中序列1的自5′端的第1831和1832位的核苷酸之间，并且在卡那霉素抗性基因两端分别引入EcoRI，NdeI及BamHI，XhoI限制型酶切位点。
pW241已经具有筛选标记，作为质粒工程载体时，可以很方便地筛选出来。
含有上述人苍白杆菌质粒及其衍生质粒的微生物也属于本发明的保护范围。
上述人苍白杆菌质粒pW240可从人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24CGMCC №1649菌株中提取得到，该菌株已于2006年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1649。
人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649自武汉钢铁集团公司焦化废水车间的活性污泥中分离得到。
人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649可在普通细菌LB培养基及无机盐加氰化物(200mg/L NaCN)筛选培养基上生长，菌落白色、呈圆形，边缘光滑，30℃～37℃培养24h，光学显微镜下观察其为G-杆菌，周生鞭毛，有较强的运动性。专性好氧，严格呼吸代谢。以氧为末端电子受体。接触酶、氧化酶阳性。吲哚阴性。化能异养菌。能利用各种氨基酸、有机酸和碳水化合物为碳源。
人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649具有较宽的有机污染物降解谱，能够利用苯、苯酚、甲苯、二甲苯、氰化物等底物为唯一能源、碳源和氮源。该菌株十分适宜于作为构造环境工程菌的原始出发菌株。
本发明的pW240是一个非常小的天然质粒，大小为4227bp，在几何尺度上适合于用作基因操作的质粒载体；该质粒结构简单，测序结果表明，该质粒仅含有两个功能基因，即一个诱动基因与一个复制蛋白基因。这两个特征表明该质粒改造后的潜在能力较大，作为克隆载体时具有较大的克隆容量；插入新的外源性目标基因时，基因间的关系非常简单，易于人工识别与控制，并利于试验设计与基因作用产物的检测。
本发明的pW240尺寸小，不携带转移基因(transfer基因)，因此在宿主中不会发生自发转移，也是构建质粒载体的优良“胚料”；但是该质粒含有一个与质粒pRm1132f上同源的诱动基因(mob基因)，表明在适当的宿主中，当与某些接合性大质粒共存时，可以被诱动而发生转移，即发生细胞接合过程，原理是，小质粒寄生于适当的宿主细胞中，当该宿主细胞中存在着其他接合性大质粒时，则小质粒有可能被诱动而发生转移；因此，该质粒及在该质粒基础上进一步构建的克隆载体可作为一种具有广泛寄主的质粒载体。
限制性内切酶图谱分析结果表明，本发明的质粒具有数个单酶切位点，如SmaI，XbaI，XmaI，SpeI，SacI等，其中SmaI，XmaI位于诱动基因mob，复制蛋白rep基因的域外，可用作进一步基因操作的克隆位点，在进行外源基因的插入时，不会影响质粒上一些必要结构的功能。
由于本发明的pW240是来自污染体系的降解菌的野生质粒，该质粒及含有该质粒的源菌株可用于环境工程菌的构建。在本发明的pW240及其衍生质粒中可添加某些具有潜在环境或农业应用价值的功能基因如有机污染物降解基因或农药解毒基因，或者某些可移动遗传因子如转座子或插入重复序列(IS)，构建出可以在污染体系中进行转移、扩散的多功能可水平转移遗传因子，用于环境污染的治理应用领域。总之，本发明的质粒是一种既具有理论研究价值，又具有实际应用价值的质粒载体。
图1为从人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649中提取的质粒电泳图谱。
图2a为质粒pW240的物理图谱。
图2b为质粒pW241的物理图谱。
图3为pUC19中插入卡那霉素抗性基因的酶切检测。
图4a为以pW241和pW240为模板用卡那霉素抗性基因引物(Kan-F；Kan-R)进行PCR得到的产物电泳图谱。
图4b为pW241质粒的酶切验证电泳图。
图5a为pW241转化子的抗性检测。
图5b为pW241和pW240质粒在W24中共存的PCR验证具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、质粒pW240的获得一、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649的分离及其鉴定1、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649的分离人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649从武汉钢铁集团公司焦化废水车间的活性污泥中分离得到，具体方法如下将样品接种到含CN-的液体选择性富集培养基(即在BS无机盐培养基中添加200mg/L NaCN作为唯一碳源与氮源)的摇瓶中，35℃，120rpm下振荡培养一周。将富集培养液涂布到固体BS氰化物选择培养基上，35℃，恒温培养，直至长出明显可见的菌落。挑取单菌落，移接到液体BS选择性培养基中，35℃，120rpm下振荡培养，直至细胞浓度达到107～108cfu/mL。再次涂布固体平板，或者划线分离检测纯度，直至获得以无机氰化物为唯一碳源与氮源生长的纯种菌株。
分离得到一株人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24，该菌可在普通细菌LB培养基及无机盐加氰化物(200mg/L NaCN)筛选培养基上生长，菌落白色、呈圆形，边缘光滑，30℃～37℃培养24h，光学显微镜下观察其为G-杆菌，周生鞭毛，有较强的运动性。专性好氧，严格呼吸代谢。以氧为末端电子受体。接触酶、氧化酶阳性，吲哚阴性，化能异养菌。能利用各种氨基酸、有机酸和碳水化合物为碳源。
该菌株于2006年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1649。
2、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649对有机污染物降解功能的测定分别在BS固体培养基(每1000mL水中含Na2HPO4·2H2O 7.0g，KH2PO43.0g，NaCl 0.25g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl2·2H2O 0.02g，FeCl3·6H2O0.045g，MnSO4·4H2O 0.01g，ZnSO4·7H2O 0.01g，CuSO4·5H2O 0.002g，CoCl2·6H2O 0.003g，NiCl2·6H2O 0.003g，Na2MoO4·2H2O 0.002g，pH7.5，13.5g琼脂粉)中添加4.39g/L苯、50mg/L苯酚、1.72g/L甲苯、1.72g/L二甲苯、1.96g/L吡啶、200mg/L氰化钠、50g/L咪唑和0.5g/L喹啉作为唯一碳源和氮源，对人苍白杆菌W24 CGMCC №1649进行培养，观察其生长情况。
结果表明人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649能够利用苯、苯酚、甲苯、二甲苯、氰化物等底物为唯一碳源和氮源进行生长。
3、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649的抗性谱测定分别在添加200mg/L的卡那霉素、壮观霉素、氯霉素、头孢霉素，四环素、氨苄霉素、羧苄霉素、利福平的LB固体培养基上涂布人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)W24 CGMCC №1649，观察其生长情况，结果表明人苍白杆菌(chrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649对头孢霉素，四环素、氨苄霉素、羧苄霉素具有耐受性，只对卡那霉素、壮观霉素、氯霉素和利福平敏感。
二、质粒pW240的提取及纯化从上述分离的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649中提取质粒，具体步骤如下1、所用材料1)培养基LB2)质粒提取所用溶液TE50mM Tris，20mM Na2EDTA，pH8.0；裂解液3％十二烷基硫酸钠(SDS)和0.2mol/L NaOH；TS1M Tris，4M NaCl，pH7.0；TES50mM Tris，5mM Na2EDTA，50mM NaCl,pH8.0。
2、质粒提取采用碱变性、乙醇沉淀纯化、QIAGEN试剂盒回收的方法，具体步骤如下1)挑取人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649的单菌落，接种于200mlLB培养基中，30℃振荡培养，直到OD600达到2.0；2)取40ml菌液于室温，5000rpm，离心10min；3)弃去上清，加入10mL的TE缓冲液，震荡悬浮菌体；4)加入20ml的细胞裂解液；5)室温放置10min，加入10ml的TS缓冲液；6)冰浴30min，8000rpm，离心20min；7)收集上清，加入等体积冰冷无水乙醇，-80℃放置20min；8)10000rpm，离心20min，弃去上清；
9)沉淀重新悬浮，溶于1ml的TES缓冲液中，用等体积氯仿抽提；10)吸取上清，-20℃保存备用。
通过上述过程获得的质粒经琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649中含有两个质粒，一个大质粒，分子量80-100kb，另外一个小质粒，大小为4kb左右，将小质粒命名为pW240。图1中，泳道1为质粒粗提物的琼脂糖凝胶电泳结果，泳道2为DNA分子量标准1kbMarker。
将上述质粒pW240采用市购的QIAGEN试剂盒回收，步骤如下1)紫外灯照射，切下目标条带，称重；2)将凝胶条带溶于3倍体积的buffer QG溶液中，65℃加热5-10分钟，每隔两分钟颠倒混匀一次，加1/3体积的异丙醇；3)倾入回收柱中，静止2分钟；4)13,000rpm，离心30秒，弃去回收柱下层废液；5)加入750ul wash buffer PE溶液，13000rpm，离心30秒；6)重复以上步骤一次；7)13000rpm，离心2分钟，更换新的离心管；8)向回收柱中加入20-50ul的EB buffer，13000rpm，离心30秒，收集DNA。
经过上述过程获取的纯化的质粒DNA，用于进一步的酶切反应、PCR反应、测序反应。
3、质粒pW240的全序列测定采用鸟枪法进行小质粒pW240的全序列测定，即构建质粒文库和对亚克隆片段进行重叠分析的方法(overlapping the sequences of subclones)。其步骤如下所述1)对步骤2中切胶回收纯化的质粒pW240用两种限制性内切酶TaqI，Sau3AI进行部分消化，分别回收酶切产物。将pBluescript II SK(+/-)质粒，分别用ClaI和BamHI两种限制性内切酶消化载体，并和对应回收片段连接，转化，蓝白斑筛选重组质粒，构建成两个不同酶切位点的质粒文库。
2)从质粒文库中经PCR验证筛选阳性克隆子，并选取了46个插入大小有差异的重组质粒，进行插入片段的序列测定。
3)通过生物软件对测定的所有序列进行拼接，并对已拼接成的几段长序列继续设计引物扩增质粒上其余的未知目的序列。
设计4对引物，所设计采用的引物为JIAO-1-FCCTGTTTTGTAGCACCAGCATTCG和JIAO-1-RCAGTTTCGTGCATAGGGCAATAGC；JIAO-2-FCCTTATCGCCCCGTTTATTGTG和JIAO-2-RGACTGAAGATTTCCCGCTCAACTA；JIAO-3-FTGCAGCACCATCCAATAACAG和JIAO-3-RCTTAAATCTCCACGCTGGTCA；4k_endTTTCGGAACTGAGCAAGAGCC和01hTGTTGCCGTCAAGGTTGATGT。
测序拼接结果表明，该pW240质粒的核苷酸长为4.227kb，具有序列表中序列1的核苷酸序列，其限制型酶切位点与功能基因分布如图2a所示。经Blast比对与分析，发现与已有数据库中登记注册的基因的核苷酸序列同源性极低，是一个全新的天然质粒；经蛋白的氨基酸序列比对发现，该质粒携带一个复制蛋白基因(rep基因)和诱动基因(mob基因)，序列1中的自5′端第1487-21位核苷酸为复制蛋白基因(rep基因)，序列1中的自5′端第3896-2484位核苷酸为一个诱动基因(mob基因)。经限制性酶切图谱分析结果表明，该质粒具有多个常用酶的单酶切位点，如SmaI，XbaI，XmaI，SpeI，SacI等，可作为基因操作的克隆位点。
4、质粒pW240的功能、特性测定对该质粒的有关功能进行了初步检测，包括质粒可能编码的抗性功能、降解特性。实验方法为将提取纯化的pW240质粒通过电击转化入大肠杆菌DH5α感受态中，抗性检测即将转化产物涂布在LB分别添加100mg/L的卡那酶素，氯酶素和壮观酶素的平板上；降解特性即将转化产物涂布在添加4.39g/L苯、50mg/L苯酚、1.72g/L甲苯、1.72g/L二甲苯、1.96g/L吡啶、200mg/L氰化钠、50g/L咪唑和0.5g/L喹啉的BS平板上。结果无论是在抗性还是降解平板上均没有菌落长出，结果显示质粒pW240不具备抗性和降解特性。
综上所述，该pW240质粒具有以下独特的特征和用途1)Blast比对结果表明，发现该质粒的序列与公开数据库中现已注册的基因序列不具有同源性，因此是一个新质粒；2)pW240是一个非常小的天然质粒，大小为4227bp，在几何尺度上是适合于用作基因操作的质粒载体的；该质粒结构简单，测序结果表明，该质粒仅含有两个功能基因，即一个诱动基因与一个复制蛋白基因。说明该质粒改造后的潜在能力较大，作为克隆载体时具有较大的克隆容量；插入新的外源性目标基因时，基因间的关系非常简单，易于人工识别与控制，并利于试验设计与基因作用产物的检测；3)由于pW240仅仅只有4227bp，属于小质粒，不携带转移基因(transfer基因)，因此在宿主中不会发生自发转移，也是构建质粒载体的优良“胚料”；但是该质粒含有一个与质粒pRm1132f上同源的诱动基因(mob基因)，表明在适当的宿主中，当与某些接合性大质粒共存时，可以被诱动而发生转移，即发生细胞接合过程，原理是，小质粒寄生于适当的宿主细胞中，当该宿主细胞中存在着其他接合性大质粒时，则小质粒有可能被诱动而发生转移；因此，该质粒及在该质粒基础上进一步构建的克隆载体可作为一种具有广泛寄主的质粒载体。
4)限制性内切酶图谱分析结果表明，pW240具有数个单酶切位点，如SmaI，XbaI，XmaI，SpeI，SacI等，其中SmaI，XmaI位于诱动基因mob，复制蛋白rep基因的域外，可用作进一步基因操作的克隆位点。
5)除了上述关于克隆载体/表达载体的构建及其相关特征的优点，另外一个应用是进一步将上述获得的克隆载体或表达载体，添加某些具有潜在环境或农业应用价值的功能基因如污染物降解基因或农药解毒基因，或者某些可移动遗传因子如转座子或插入重复序列(IS)，这样则可构建出可以在污染体系中进行转移、扩散的多功能可水平转移遗传因子。
实施例2、pW241的构建根据以上实验结果，并结合已获取的序列信息，在小质粒的诱动基因mob，rep蛋白基因的域外，对小质粒进行卡那霉素抗性基因的插入。
一、卡那霉素抗性基因的获取根据质粒pCAMBIA1301(11837bp)上的7114-8623之间的序列，该段序列包含完整的卡那基因，设计引物进行PCR扩增Kan-F5’gggatcctcgagTGGCCTAACTACGGCTACACTA 3’Kan-R5’cgcgaattcatatgCAGCTCGGCACAAAATCACCA 3’在其两侧分别引入限制性酶切位点BamHI，XhoI及EcoRI，NdeI。扩增得到大小为1452bp的卡那霉素抗性基因PCR产物。将卡那霉素抗性基因PCR产物用BamHI和EcoRI酶切，后与经同样酶切的pUC19载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，经含卡那霉素抗性(含有100mg/L卡那霉素的LB固体)平板筛选转化子。从转化子中提取质粒，进行酶切和PCR检测，结果表明上述所得1452bp PCR产物含有功能活性的卡那霉素抗性基因，酶切检测结果如图3所示，图3中，泳道2为pUC19质粒载体经SmaI酶切，泳道5、3、4分别为卡那抗性基因插入pUC19质粒获得的pUC19-kam重组质粒，EcoRI单酶切的重组质粒pUC19-kam，EcoRI+XhoI双酶切的重组质粒pUC19-kam，泳道1和6为DNA分子量标准1kbMarker。
二、质粒pW240上筛选标记(卡那霉素抗性基因)的插入mob基因和rep基因几乎占据了pW240整个质粒一级结构序列的三分之二，根据酶切位点的分布，将卡那霉素抗性基因插入序列表中序列1的自5′端的第1831和1832位的核苷酸之间(pW240的平末端SmaI切点处)。先用SmaI对pW240进行酶切，与步骤一中同样引物用pfu酶从质粒pCAMBIA1301(11837bp)扩增得到的卡那霉素抗性基因连接，化学转化大肠杆菌Top10感受态细胞，在卡那霉素抗性平板(含有100mg/L卡那霉素的LB培养基)上筛选转化子，进行卡那霉素抗性基因PCR鉴定和酶切验证。结果表明卡那霉素抗性基因已成功插入质粒pW240中，将插入卡那霉素抗性基因的pW240命名为pW241。PCR结果如图4a所示，其中，图4a中泳道1为携带卡那霉素抗性基因的pW241质粒PCR扩增产物，大小1.45kb；泳道2为DNA分子量标准1kb Marker，泳道3为pW240质粒。图4b为pW241质粒的酶切验证，泳道2为pW241质粒；泳道3为pW241/(EcoRI+XhoI)，切出一条1.45kb的卡那基因；泳道4为将pW241用EcoRI的单酶切产物；泳道5为将pW241用HindIII酶切的产物，获得一720bp的酶切条带；泳道6为pW241用NcoI消化的产物，NcoI为不存在的位点，图中显示此条带未酶切动；泳道1和7为DNA分子量标准1kb Marker。
将已经连上卡那霉素筛选标记的小质粒pW241重新转化到人苍白杆菌W24CGMCC №1649，在LB加卡那霉素(100ug/ml)的抗性平板上筛选转化子(结果如图5a所示，A为W24 CGMCC №1649野生菌，B为转入pW241的W24 CGMCC №1649)，将筛选得到的克隆提取质粒，并在pW240的卡那霉素抗性基因插入位点两侧设计新引物PCR验证，结果显示两小质粒pW240与pW241共存于人苍白杆菌W24 CGMCC №1649中，菌落PCR结果如图5b所示，其中泳道2-6为pW240质粒，仅有200bp大小一条带；泳道9为pW241质粒，仅有包括卡那基因在内的1.7kb条带；泳道7-8为pW241和pW240在W24中共存，包括200bp和1.7kb两条带；泳道1为DNA分子量标准1kb Marker。
三、pW241对人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649的转化活性将获取的具有卡那霉素抗性基因的质粒pW241转化到野生菌人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649，考察pW241在其中的活性与寄存情况，操作步骤如下1、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649感受态细胞的制备所有步骤均在冰浴条件下操作，具体步骤如下所述1)挑取LB固体培养基上的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24CGMCC №1649新鲜单菌落，接种于20ml LB液体培养基中，37℃220rpm振荡培养2小时，菌液OD值达到0.5-0.6，冰上冷却培养物至0℃。
2)将菌液转入灭菌离心管，4℃4000g收集菌体，去上清，在吸水纸上倒置空干。
3)加入20ml的预冷10％甘油，置于冰上，不时轻轻颠倒离心管，将菌体泡溶。
4)4℃4000g收集菌体，去上清，在吸水纸上倒置空干。
5)加入10ml的预冷10％甘油，轻摇离心管，将菌体泡溶。
6)重复步骤4)和步骤5)7)重复步骤4)8)加入200ul的预冷10％甘油，溶解菌体，分装成40ul/1.5ml离心管。
2、pW241质粒的转化1)将电转化仪(BIO-RAD Gene PulserII System)调到2.5kV，脉冲控制器调到400Ω。
2)将1ul pW241(水溶10ug/ml)加入到盛有40ul新鲜制备的或融化的冻存的感受态细胞小管中，混匀。
3)将转化混合物转移到预冷的电转化池中，吸干池的外表面，然后放入样品槽中。
4)进行脉冲电转化，然后取出电转化池，马上加入1mlLB培养液，于37℃250rpm，迅速振荡培养45min。
5)取200ul涂布于含有卡那霉素(100ug/ml)、IPTG(4ug/ml)和x-gal(32ug/ml)的LB平板(含有4ul IPTG+40ul x-gal)。37℃培养8-12小时，观察菌体生长情况，结果如图5a所示，表明质粒pW241成功转化入人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649中，使原先不具备卡那霉素抗性的无色杆菌W24 CGMCC №1649获取了卡那霉素抗性，图5a中A为人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649(野生菌)，B为pW241转入到人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 CGMCC №1649中获得的转化子。
序列表<160>1<210>1<211>4227<212>DNA<213>人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)<400>1caggggcctt ttggctgcta cacagccaag gcgacaccgt cgcccagcaa ctccattgct 60gttttcaaac agggttcgcc aaacgctttc ccttttgccg acgcctcttt tcggaactga120gcaagagcct gttgcagagc cgcaccagac ttgcacccct tggcgtctcg gatcgttttt180gcccgcagca ctaattcacg agctgagaca gacatgacat tttgccctgc ctctttttcc240ttcaacatct cagcaatgag atcgtcgatt gcaggccaat cccaccccgc accaacaaca300cgcagaacgt caggagcgtg accacgacgc agaaccttat gccaacgata cggctcaagg360gttccgacaa cttccgcctc atcttcgagc attttaacgc cgggattatc ggaatcatcc420tctggctgaa taccaagttt atcagccaag cttttcgtga tgacacatga ccgagtgccg480ggcataacct cagcatattc acggaaaagc cctgcaaaca tggcgtcacc gccctcagcg540cgagcggcta aatcccaagg cgtcaaacct tccttgccct gttttgtagc accagcattc600gacacttccc aagccgcaga accttttgcc agatattcag ccaagtctgc ctctgtccag660acaaccgtca catcctgcgc ctgtcttgaa gtccgcccac cagccgcaga aatatacgag720cgatagcgct ccatgagcca ctcacctgcc tcagcggcat gagcatcggc catcctcatg780gccttatcca gctcggcggc tccagccgct cttgcggcct taaaatcgat gtcggtaaag840acgacaagcg ccacatgtag atggaagtgc caaccgtgtt tttccgacca cgtcacttca900ggccctacaa gcgtccccgc gattttgaat cgctcgaccg ccagcgccca aggcttgcct960tggcgagcct tacggcaggc agtcatgacc aaacttttca gatcagccag agaatccttt 1020ttgccgtgtt tcacggtcaa agtaacaaag acaatgcggc caccctttgc ttcagccgcc 1080ttgaaaacct cagttacttt ttcagccctt tgggccgcac gacgaggcgc acaggtaggg 1140cagagccaag gactatcaca gaagaaaaca cccgaaacgc cagcttttcc atcctttcgc 1200gtcaatgaca ctgcggacac ttcgtgtcca gccgttccgc atttacaaac gccgggaaca 1260
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1.一种细菌质粒，具有序列表中序列1的核苷酸序列。
2.一种权利要求1所述质粒的衍生质粒，是在权利要求1所述质粒中插入卡那霉素抗性基因后得到的质粒。
3.根据权利要求2所述衍生质粒，其特征在于所述卡那霉素抗性基因插入到序列表中序列1的自5′端的第1831和1832位的核苷酸之间得到的质粒。
4.含有权利要求1-3任一所述质粒的微生物。
5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于所述微生物为人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)W24 C6MCC №1649。
全文摘要
本发明公开了一种质粒及其衍生质粒与应用。本发明所提供的质粒，具有序列表中序列1的核苷酸序列。本发明的质粒及其衍生质粒将在质粒工程载体的研究和开发中发挥重要作用。
文档编号C12N15/74GK1837369SQ20061006621
公开日2006年9月27日 申请日期2006年3月29日 优先权日2006年3月29日
发明者李毅, 王丽英, 王军, 乔琳, 沙圣德, 夏勉, 王喜萍, 杨效曾, 曹小近 申请人:北京未名凯拓农业生物技术有限公司