专利名称：体外诱导造血干/祖细胞分化为成熟红细胞的方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体的说是涉及一种在无血清培养体系中利用基质细胞的支持作用诱导不同来源的造血干/祖细胞分化为成熟红细胞的方法及其用途。
背景技术：
目前临床输血治疗面临的两个主要问题是血液来源紧张和输血相关传染病的发生，对于前一问题经常可以在电视、报纸、网络等媒体上见到相关报道，更严重的是后一问题，目前我国登记的艾滋病患者中有7万多例是在献血、输血过程中感染的，因此迫切寻找新的更安全的血液来源。
随着对造血干细胞分化发育研究的深入，体外诱导造血干祖细胞高效率扩增产生完全成熟的红细胞，逐渐成为解决临床输血治疗面临的困境的一个可行的方向。
目前对于体外大规模产生红细胞的研究一般在无血清培养体系中进行，这样可以避免血清中一些尚未确定的物质的影响，而且可以避免血清中可能存在的污染源。
要达到可以规模化生产红细胞，有三个关键的问题需要解决，一是扩增效率的提高；二是产生的红细胞完全脱核，具有完全的功能；三是使整个生产体系避免污染，确保安全。
目前有研究在无血清培养体系中能使造血干细胞(HSC)在体外持续扩增45天，细胞数目扩增107倍，但其红细胞脱核效率不高，另一项研究利用基质细胞的造血支持作实现了红系祖细胞的完全脱核，生成了有功能的红细胞，为体外产生红细胞的研究提供了好的研究基础，但其在研究中应用了动物细胞系，使其安全性受到了很大的质疑。
另外目前有研究已从小鼠胚胎干细胞(ES)中大规模培养得到红系祖细胞，并且红系祖细胞能分化为成熟的脱核红细胞，更重要的是注射到小鼠体内时红系祖细胞不具有致瘤性。已有研究对人ES细胞展开了类似研究，诱导人ES细胞分化得到红系祖细胞，然后实现红系祖细胞的完全脱核，生成可供临床输血治疗应用的红细胞，这也将是未来ES细胞应用的一个方向，体外大规模培养红细胞最终应用于临床仍有很多问题要需要研究，首先就要建立一种高效、安全的生成有完整功能的红细胞的技术方法，为最终的应用和开展红细胞发育的相关研究打下基础。
发明内容
本发明提供了一种在无血清培养体系中利用基质细胞的支持作用诱导不同来源的造血干/祖细胞分化为成熟红细胞的方法，为寻找新的红细胞来源提供了新的方法，还可以为红系细胞发育及红细胞相关疾病的基础研究和寻找治疗方法提供很好的体外细胞模型。
本发明通过以下技术方案实现1.用免疫磁珠法分离不同来源的HSC，体外在无血清培养体系中利用细胞因子组合大规模扩增得到不同发育阶段的纯的红系祖细胞；2.分离人源的造血支持作用的基质细胞，并对其生长特性及表面标志等特性进行鉴定分析；3.将不同发育阶段的红系祖细胞与基质细胞在脱核培养体系中共培养，使红系祖细胞达到完全脱核，生成具有完整生理功能的红细胞；上述方法中所说的不同来源的造血干/祖细胞包括脐带血、外周血、骨髓、患者经细胞因子动员后的外周血及人ES细胞经体外诱导分化得到的造血干/祖细胞。
上述方法中所述人源的基质细胞包括流产胎儿肝脏来源的基质细胞、流产胎儿骨髓来源的间充质干细胞(MSC)、成人骨髓来源的MSC，及脂肪等其它组织来源的MSC等具有造血支持作用的基质细胞。
上述方法中所应用的基质细胞是原代细胞，并非永生化细胞系。
上述方法中基质细胞是用钴源(钴-60)照射或丝裂霉素处理后细胞生长受抑制的细胞，可更好的发挥造血支持作用。
上述方法中的红系祖细胞的无血清诱导体系是在无血清培养基StemSpanSFEM(Stem Cell公司产品，Cat# 09600)中加入促红细胞生成素(Epo，Sigma公司产品，Cat# E5627)3-5U/mL、干细胞生长因子(SCF，R&D公司产品，Cat#255-SC)50-100ng/mL、胰岛素样生长因子-1(IGF-1，R&D公司产品，Cat#291-G1)40-60ng/mL、地塞米松(Dex，Sigma公司产品，Cat#D1756)1μM等细胞因子组合实现的。
上述方法中的不同阶段红系祖细胞是指HSC诱导分化8天以后的红系祖细胞。
上述方法中的红系祖细胞与基质细胞共培养是直接接触培养。
上述方法中的红细胞脱核培养体系是在无血清培养基中加入Epo 8-10U/mL、IGF-1 40-60ng/mL，铁饱和的转铁蛋白(Sigam公司，Cat#T0665)500μg/mL等因子并补充Fe如加入Iron Supplement(Sigma公司产品，Cat#I3153)来实现。
上述方法中的无血清培养基可以是在StemSpan SFEM培养基，也可以是在IMDM培养基(GIBCO公司产品，Cat#12200-028)中加入1～2％BSA、10μg/ml人胰岛素、200μg/ml转铁蛋白、2mmol/L L-谷氨酰胺及10-4mol/L 2-巯基乙醇作为基础培养基来实现。
图1流式细胞术检测分离得到的CD34+细胞的纯度A为阴性对照；B为CD34+细胞检测结果；图2胎儿肝脏基质细胞形态学观察；图3第30代胎儿肝脏基质细胞核型分析结果；图4流式细胞术检测胎儿肝脏基质细胞表面标志；图5体外培养不同阶段红系祖细胞的形态学观察A为诱导第1天镜下观察红系祖细胞形态；B为诱导第5天镜下观察红系祖细胞形态；C为诱导第8天镜下观察红系祖细胞形态；
图6体外培养红系祖细胞增殖曲线；图7不同阶段红系祖细胞Wright-Gimesa染色A为诱导第4天红系祖细胞Wright-Gimesa染色；B为诱导第8天红系祖细胞Wright-Gimesa染色；图8流式细胞术检测不同阶段红系祖细胞表面标志A为诱导第7天红系祖细胞表面标志流式检测结果；B为诱导第14天红系祖细胞表面标志流式检测结果；C为诱导第21天红系祖细胞表面标志流式检测结果；图9红系祖细胞与基质细胞共培养显微镜观察和不同阶段脱核的红细胞Wright-Gimesa染色A为脱核体系中培养第3天红系细胞形态学观察；B为脱核体系中培养第6天红系细胞形态学观察；C为脱核体系中培养第6天红细胞Wright-Gimesa染色；D为脱核体系中培养第10天红细胞Wright-Gimesa染色；具体实施方式
实施例1脐带血单个核细胞(MNC)的分离在产妇知情同意的情况下采集足月顺产胎儿脐带血80-100ml，用于分离HSC。
1.1肝素抗凝的新鲜血液标本按1∶1的体积比与PBS混匀，混匀后再按4∶1的体积比与0.5％甲基纤维素混匀，室温下静置30min，待红细胞自然沉降至界限分明时，吸出上清部分置50mL离心管中，室温1,500rpm离心5min；1.2弃上清，加10mLPBS悬浮细胞，同上离心洗涤；1.3弃上清，用5mL PBS重悬细胞；1.4在10mL离心管中加入预先平衡至室温的5mL人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品，Cat#LTS1077)，然后沿管壁缓慢加入5mL细胞悬液，室温，1,500rpm离心25min；1.5收集界面MNC细胞层，室温，1,500rpm离心5min，弃上清；
1.6用1mL PBS悬浮细胞，移入1.5mL Ep管中，计数。
实施例2从MNC中分离CD34+细胞(采用miniMACS分离系统)2.1每108个脐血单个核细胞(MNC)悬浮于300μL4℃预置的PBS中，加入100μL非特异性阻断抗体FcR封闭剂，混匀。然后再加100μL磁珠偶联的CD34单克隆抗体(FcR封闭剂、磁珠偶联的CD34单克隆抗体均购自Miltenyi Biotec公司，Lot#5050601032)，混匀，4℃孵育30min；2.2补加500μl PBS，4C，1,500rpm离心3min，弃上清；2.3用1mL除气的PBS重悬细胞，制备单细胞悬液；2.4将MACS分离柱固定于MACS磁场(MACS分离柱及磁场均购自MiltenyiBiotec公司)内，用除气的2mL PBS冲洗分离柱；2.5将单细胞悬液缓慢贴壁加入分离柱，避免产生气泡，待其自然流出后用500μL除气的PBS洗涤不结合的细胞，共4次；2.6将分离柱移出磁场，用1mL PBS加压洗脱，收集组分为CD34+细胞。计数。
实施例3造血干细胞纯度分析免疫磁珠标记的细胞两次通过分离柱纯化，分为两组，一组为测试组，用PE标记的抗CD34抗体(Miltenyi Biotec公司产品)检测分离得到的CD34+细胞纯度，另一组为对照组，采用PE标记的抗小鼠IgG(中山公司产品)与分离得到的CD34+细胞孵育作为对照组，经流式细胞仪检测CD34+细胞的纯度可达到98.64％(图1)。
实施例4胎儿肝脏来源的基质细胞的分离培养征得流产患者本人同意取其14周胎龄流产胎儿，分离肝脏组织，用生理盐水灌注血管，将组织中血液充分冲出，取合适大小的组织块，去除筋膜等，用消毒灭菌剪刀将肝脏组织剪碎成1mm3大小，将其排列于25mm2的培养瓶中，每瓶种20块组织，然后将其倒置于5％的CO2孵箱中，半小时后将培养瓶翻转，加入约3mL培养基，放入孵箱中继续培养，大约2天后可见有细胞从组织块边缘爬出，继续培养当细胞铺满培养瓶底80％时，将其用0.25％胰酶(Gibco公司产品，Cat#25200-056)消化下来，连同组织块一起种入新瓶中，24小时后换液去除不贴壁的细胞及残留组织块，细胞长满以后常规传代培养。所用培养基为高糖DMEM(Sigma公司产品，Cat#D5648)和DF-12培养基(Sigma公司产品，Cat#D0547)1∶1混合后加入10％胎牛血清(Biochrom公司产品，cat#S0115)。胎儿肝脏基质细胞在体外呈成纤维细胞状生长(图2)，细胞常规传代至第30代时取细胞作核型分析，结果显示其经体外传代培养后仍保持其正常核型(图3)。
实施例5流式细胞术检测胎肝基质细胞表面标志分离的胎肝基质细胞体外培养传至第10代时胰酶消化收集细胞，并用PBS洗涤2次，去除细胞表面残留血清蛋白的影响，细胞计数后等分成8管，分别标记待测抗体及相应对照抗体，每管细胞数不少于5×105，室温避光标记半小时后，用PBS洗涤细胞2次，以去除残留抗体，最后用1％多聚甲醛固定细胞，用流式细胞术检测表面分子表达情况，结果见(图4)，可以看出胎儿肝脏基质细胞基本不表达造血细胞表面标志CD45 1.94％，CD34 0.59％；而其他基质细胞表面标志却高表达CD90 84.20％，CD71 54.28％，CD44 93.88％，CD29 98.79％，是一群MSC样细胞，具有同样的造血支持作用。
实施例6体外诱导脐带血来源的HSC生成纯的红系祖细胞免疫磁珠法分离的CD34+细胞以5×105/mL接种于24孔板，培养体系组成是在无血清培养基StemSpan SFEM中加入Epo 5U/mL、SCF 100ng/mL、IGF-150ng/mL、Dex 1μM等细胞因子，诱导分化8天后可以观察到细胞体积变大，细胞形态趋于均一(图5)，红系祖细胞可以在体外维持增殖达50天，细胞增殖曲线见(图6)。
实施例7红系祖细胞Wright-Gimesa染色收集细胞约5×104个，在离心机上将细胞均匀甩片至载玻片上，室温用配制好的Wright-Gimesa染液原液固定2分钟，后换用稀释液染色18分钟，后用水冲去染液，干燥后置显微镜下观察细胞形态，并用图像采集系统采集图像，显示培养细胞为纯的红系祖细胞，细胞大小均一，发育阶段亦相近，见(图7)，证明此诱导途径是高效的。
实施例8流式细胞术检测造血细胞表面标志将不同培养时间的悬浮培养的细胞收集后用PBS洗涤2次，后均匀分成8管，每管细胞不少于5×105个分别标记相应抗体，进行三标流式细胞术检测，室温避光标记半小时后收集细胞，用PBS洗涤2次，用1％多聚甲醛固定后送去检测，流式细胞仪检测同样证明培养细胞逐渐呈均一的红系祖细胞的表面标志，CD71和CD117均高表达，GlyA随着细胞的逐渐成熟表达亦逐渐升高，而其他系血细胞的表面标志基本不表达或表达很低，从另一个角度证明这一无血清培养体系对于扩增红系祖细胞是高效的(图8和表1)。
表1不同培养时间细胞表面标志检测
实施例9将红系祖细胞与基质细胞共培养使红系祖细胞脱核生成红细胞红系祖细胞去核分化体系是在无血清培养基StemSpan SFEM中加入Epo 10U/mL，铁饱和的转铁蛋白500μg/mL，IGF-1 50ng/mL，1×Iron Supplement等细胞因子组成，胎儿肝脏来源的基质细胞用10μg/mL的丝裂霉素处理后用作基质细胞，将发育不同阶段(诱导8天后)的红系祖细胞与基质细胞共培养(图9)，脱核培养3天后可见有脱核红细胞出现，第10天可见细胞基本全部脱核，生成成熟红细胞(图9)。
实施例10体外培养红细胞的检测将体外培养的红细胞用血细胞分析仪分析常规指标，检测结果显示红细胞平均容积(MCV)为105±7fl，红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)为25±4％，红细胞平均血红蛋白含量(MCH)为28±2pg，检测结果与正常外周血红细胞接近，显示该诱导培养体系能够成功诱导造血干/祖细胞分化为成熟红细胞。
权利要求
1.一种诱导不同来源造血干/祖细胞分化为成熟红细胞的方法，其特征在于利用基质细胞与无血清培养体系的共同作用，实现造血干/祖细胞分化为红系祖细胞，进而脱核生成具有完整功能的红细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于造血干/祖细胞可来源于脐带血、外周血、骨髓、患者经细胞因子动员后的外周血及人ES细胞经体外诱导分化得到的造血干/祖细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所用的基质细胞包括流产胎儿肝脏来源的基质细胞、流产胎儿骨髓来源的MSC、成人骨髓来源的MSC，及脂肪等其它组织来源的MSC等具有造血支持作用的基质细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所用的基质细胞是分离的原代细胞，并非永生化细胞系，使用前采用钴源照射或丝裂霉素处理，细胞生长受到抑制以更好发挥造血支持作用。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所用的红系祖细胞的无血清诱导体系是在无血清培养基中加入促红细胞生成素、干细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、地塞米松等细胞因子组合实现的。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所用的红细胞脱核培养体系是在无血清培养基中加入Epo、IGF-1，铁饱和的转铁蛋白等因子并补充Fe来实现。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所用的无血清培养基可以是商品化的StemSpan SFEM培养基，也可以通过在IMDM培养基中补充加入BSA、人胰岛素、转铁蛋白、L-谷氨酰胺及2-疏基乙醇作为基础培养基。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于红系祖细胞与基质细胞的共培养是直接接触培养。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过本技术方法的实现可作为体外模型用于研究红细胞分化发育的机制。
10.利用上述方法获得的成熟红细胞的用途，其特征在于通过规模化应用获得的大量红细胞制品，可为解决血源紧张及防止血源性疾病的传播提供良好的红细胞替代品，并为研究红细胞相关疾病的发病机理及其治疗方法提供体外细胞模型。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域，具体为一种在无血清培养体系中利用基质细胞的支持作用诱导不同来源造血干/祖细胞分化为成熟红细胞的技术方法。本技术方法通过胎儿肝脏来源的基质细胞或胎儿骨髓来源的间充质干细胞与体外诱导到不同阶段的红系祖细胞共培养，实现红细胞的完全脱核，生成具有完整功能的红细胞。本技术方法的实现及规模化应用可以提供大量通用型或稀有血型的红细胞制品，为解决血源紧张及防止血源性疾病的传播提供完全天然的红细胞替代品，还可作为体外模型用于研究红细胞分化发育的机制，并为研究红细胞相关疾病的发病机理及其治疗方法提供体外细胞模型，具有巨大的市场价值及广阔的应用前景。
文档编号C12N5/08GK101045914SQ200610066208
公开日2007年10月3日 申请日期2006年3月29日 优先权日2006年3月29日
发明者裴雪涛, 习佳飞, 王韫芳, 张鹏, 闫舫, 白慈贤, 南雪, 陈琳 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所