专利名称：改良皮肤癣菌试验培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌显色培养基，特别涉及一种能将皮肤癣菌与非皮肤癣菌的真菌快速区分开的改良皮肤癣菌试验培养基。
背景技术：
皮肤癣菌是一大类真菌，可以引起人和动物皮肤、毛发和甲板的感染。皮肤癣菌病发病率十分高，在我国患者总数估计高达数亿之多。在临床治疗前，医生常常要为患者进行真菌化验，在明确确是真菌感染而且是何种真菌感染以后，才能选择有效抗真菌药物进行彻底治疗。而真菌培养是诊断的“金标准”。影响真菌培养的速度和准确度的关键因素之一就是培养基。
皮肤癣菌试验培养基(dermatophyte test medium，DTM)是一种选择性培养基，其组成如下
pH5.5±0.1DTM培养基将皮肤癣菌和非皮肤癣菌区分开的原理为1.皮肤癣菌优先利用培养基中的蛋白质肽类，产碱，pH升高，培养基(含指示剂酚红)变红；大多数非皮肤癣菌优先利用培养基中的葡萄糖，产酸，pH降低，培养早期颜色基本不变，这可能与皮肤癣菌的嗜角质性有关。2.DTM培养基中所含的抗生素和放线菌酮可抑制大部分非皮肤癣菌的生长，而皮肤癣菌的生长不受影响。
DTM培养基有较高的实用价值，因为1、近年来，真菌感染的发病率在逐年升高，此类疾病的诊治是政府卫生部门和医患双方关注的焦点；2、不同抗真菌药物的抗菌谱不尽相同，某些真菌感染性疾病如甲真菌病治疗疗程较长，费用较高，且药物均有潜在的不良反应，因此菌种鉴定和有针对性的合理治疗对此类疾病尤为重要；3.传统的真菌培养鉴定方法对检验者的经验和技术要求较高，目前在国内仅有少数医院开展此项目，而且一般需要培养2周左右时间，而DTM培养基产生阳性结果的时间不足一周，且结果直观，非专业人员也能报告结果。虽然仅根据颜色变化，不能将真菌鉴定到种，但对治疗药物的选择已提供了足够的信息。
DTM培养基由Taplin等在“一种新的培养基(BTM)对皮肤癣菌分离和鉴定的研究”一文首先报道(Taplin D，Zaias N，Rebell G，等.，皮肤病学文献，1969，99203-209.)，在国外已应用三十余年，是多项与皮肤癣菌有关的疾病如甲真菌病的流行病学调查和实验室研究等选用的培养基之一。国外已有商品化的DTM培养基，国内尚未见此培养基的应用报道。美国几项关于DTM的大规模研究(Pariser D，Opper C.可于诊室操作的皮肤癣菌检测方法-全国甲真菌病调查研究。治疗杂志，2002，11(3)43-8.)提示临床医生使用该培养基，在诊室里就完全可以完成从取材到报告结果的全过程，节约了患者的医疗费用(DTM培养方法$1，传统培养方法$25)，有较好的推广应用前景。
但DTM培养基也有其不足之处，主要表现为1.敏感性仍有待提高。申请人对临床标本的检测结果表明皮肤癣菌的开始变色时间，即结果报告的时间平均为7.32±0.41d，虽比传统培养方法提前1周，若能进一步提前，将有利于患者的及时治疗。2.结果判断标准有待改进。传统的判断标准认为在7d之内变色的一般为皮肤癣菌，非皮肤癣菌则与之相反。但我们在临床标本的检测中发现，若按此标准，错判率可＞50％；国外也有研究发现按此标准有不同程度的假阳性率(Scherer WP，Kinmon K.皮肤癣菌试验培养基与传统真菌实验室检验方法的对比-100例疑似甲真菌病老年患者的研究。美国足病协会杂志，2000，90(9)450-9；Salkin，I.F.皮肤癣菌试验培养基对非皮肤癣菌的鉴定。应用微生物学，1973，26134-137；Salkin IF，Padhye AA，Kemna ME.一种可以鉴别皮肤癣菌的新的培养基。临床微生物学杂志，1997，352660-2662.)。3.培养基中的抗生素(金霉素)不耐高温，需在高压消毒后才能加入，较为繁琐。
发明内容
本发明要解决的就是DTM培养基所存在的上述不足之处，为人们提供一种改良皮肤癣菌试验培养基。
为解决上述技术问题，本发明应用正交设计等方法对现有的DTM培养基进行改良，其具体组成如下
pH5.5±0.1本发明除具备传统培养方法和原DTM培养基的优点外，还具有如下优点1.将培养基中的营养成分(葡萄糖和大豆蛋白胨)的含量减半，对变色时间无显著影响，对批量生产较有利，可节约成本；2.将指示剂由0.02％酚红替换为0.05‰溴百里酚蓝(BTB)，BTB是一种在微生物培养基中应用较广的酸碱指示剂，其pH值范围为6.0～7.6，酚红则为6.8～8.4，而培养基的初始pH值为5.5±0.1，因此BTB比酚红能更快地指示由酸至碱的变化，且酚红的变色过程一般为橙黄→淡红→红，BTB为黄→绿→蓝，在此培养基上BTB比酚红更易于人的视觉对色差的感知，使敏感性提高，结果报告时间提前。对临床标本的检测结果表明其结果报告时间平均为5.83±0.39d，而原DTM培养基为7.32±0.41d；3.用氯霉素替换原有抗生素，氯霉素是目前真菌实验室常用培养基-沙氏培养基选用的抗生素，抗菌谱广，价廉，而且可在高压前与其他成分同时加入，使配制更为简便；4.将原来DTM配方中放线菌酮的浓度降低一半，即节约了成本(放线菌酮十分昂贵且不易得到，进口管制很严，因为属剧毒品)，也起到了对非皮肤癣菌生长的限速作用；5.根据非皮肤癣菌的变色明显滞后于生长，而皮肤癣菌的生长与变色基本同步的特点，我们将判断标准设定为开始变色时菌落直径≤5mm的为皮肤癣菌，反之则为非皮肤癣菌。对临床标本的检测研究结果表明用此标准可提高诊断的准确性，与专业真菌实验室的鉴定结果有高度一致性(Kappa＞0.9)，误判率控制在5％以内，明显少于以开始变色时间为标准(P＜0.01)。
可见，本发明不仅能方便、准确地区分皮肤癣菌和非皮肤癣菌，而且敏感性进一步提高，判读结果的准确率提高，报告时间提前，其配方更经济，配制更简便，有利于及时、合理的抗真菌治疗，有较好的社会效益和经济效益。
具体实施例方式
实施例1
1.培养基配制成分大豆蛋白胨5g葡萄糖5g氯霉素0.0625g放线菌酮 0.1g0.1％溴百里酚蓝 25mL琼脂 18gHCL(1.0N) 4.6-5.0mL水加至1000mLpH5.5±0.1制法将大豆蛋白胨、葡萄糖和琼脂加至水中，加热溶解；边搅拌，边加溴百里酚蓝液，用1N Hcl调节pH；将放线菌酮、氯霉素加入培养基；121℃10分钟高压灭菌。
2.结果报告标本接种按常规真菌培养方法，每日定时观察培养基变色及菌株生长情况，开始变色时如果菌落直径≤5mm，则有95％的可能性为皮肤癣菌，反之则为非皮肤癣菌。
实施例21.培养基配制成分大豆蛋白胨5g葡萄糖5g氯霉素0.125g放线菌酮 0.3g0.1％溴百里酚蓝 50mL琼脂 19gHCL(1.0N) 4.6-5.0mL水加至1000mL
pH5.5±0.1制法将大豆蛋白胨、葡萄糖和琼脂加至水中，加热溶解；边搅拌，边加溴百里酚蓝液，用1N Hcl调节pH；将放线菌酮、氯霉素加入培养基；121℃10分钟高压灭菌。
2.结果报告标本接种按常规真菌培养方法，每日定时观察培养基变色及菌株生长情况，开始变色时如果菌落直径≤5mm，则有95％的可能性为皮肤癣菌，反之则为非皮肤癣菌。
实施例31.培养基配制成分大豆蛋白胨5g葡萄糖5g氯霉素0.25g放线菌酮 0.5g0.1％溴百里酚蓝 100mL琼脂 20gHCL(1.0N) 4.6-5.0mL水加至1000mLpH5.5±0.1制法将大豆蛋白胨、葡萄糖和琼脂加至水中，加热溶解；边搅拌，边加溴百里酚蓝液，用1N HCL调节pH；将放线菌酮、氯霉素加入培养基；121℃10分钟高压灭菌。
2.结果报告标本接种按常规真菌培养方法，每日定时观察培养基变色及菌株生长情况，开始变色时如果菌落直径≤5mm，则有95％的可能性为皮肤癣菌，反之则为非皮肤癣菌。
权利要求
1.改良皮肤癣菌试验培养基，其特征在于由5g/L大豆蛋白胨、5g/L葡萄糖、0.0625～0.25g/L氯霉素、放线菌酮0.1～0.5g/L、0.025～0.1g/L溴百里酚蓝、琼脂20g/L、1NHCL4.6-5.0mL配制而成。
2.如权利要求1所述的改良皮肤癣菌试验培养基，其特征在于其pH值为5.5±0.1。
全文摘要
本发明涉及一种改良皮肤癣菌试验培养基，由5g/L大豆蛋白胨、5g/L葡萄糖、0.0625～0.25g/L氯霉素、放线菌酮0.1～0.5g/L、0.025～0.1g/L溴百里酚蓝、琼脂20g/L、1N HCL4.8mL配制而成，其pH5.5±0.1。本发明具备传统培养方法和原DTM培养基的优点，且判读结果的准确率提高，报告时间提前，价廉，简便易行，有利于及时、合理的抗真菌治疗，有较好的社会效益和经济效益。将来一旦开发成功，成为医院检验科或真菌室的常规试剂，定有广阔的商品化的应用前景。
文档编号C12P1/04GK1900293SQ20061008832
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月11日 优先权日2006年7月11日
发明者刘维达, 李筱芳, 沈永年, 吕桂霞, 陈伟 申请人:中国医学科学院皮肤病研究所