专利名称：小蜜环菌属真菌的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物的培养方法，特别涉及一种药用真菌的培养方法，确切地说是小蜜环菌真菌的培养方法。
背景技术：
亮菌(Armillariella tabescens)和蜜环菌(Armillariella mellea)同属真菌界、担子菌门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、小蜜环菌属。小蜜环菌又名假蜜环菌，其属下主要有亮菌和蜜环菌两种真菌，均为药用真菌。
亮菌临床主要用于治疗急慢性肝炎、急性胆囊炎、慢性胆囊炎急性发作，其它胆道疾病并发急性感染，慢性胃炎，还可以用于防辐射、抗肿瘤、增强人体免疫力、治疗放疗、化疗引起的白细胞减少症、小儿黄疸、加速造血组织DNA的合成等。目前，投入临床使用的主要有亮菌甲素注射液、亮菌口服液、亮菌糖浆、亮菌片剂等。
蜜环菌具有抗炎、抗肿瘤、抗辐射、促进造血机能、降低血糖、增强免疫力、提高记忆力等作用，还可治疗由不同病因引起的眩晕综合症、血管性头疼等常见病、多发病，并具有一定的抑制肿瘤生长等药理和保健功能。目前已开发出多种与密环菌有关的药品和保健品，如蜜环菌片、脑心舒口服液、蜜环菌浸膏、蜜环菌糖浆等。
目前，公知的亮菌和蜜环菌培养方法有固态发酵和液体深层发酵。固态发酵周期过长、容易染菌、药效成分分离困难；液体深层发酵，时间虽短，但需要一定的设备，投资大，短时间难以实现，发酵菌丝的生物量和活性物质含量偏低。
发明内容
本发明所称的小蜜环菌属真菌的培养方法，是指小蜜环菌属真菌处于静置悬浮状态下进行培养的方法，旨在培养得到真菌菌索并从中提取多糖等目标化合物用作原料药。
所述的静置悬浮培养就是在培养过程中不摇荡、不搅拌，菌种悬浮在液体培养基的表层或浅表层处生长发育成菌索。所要解决的技术问题是使菌株悬浮而不沉降。
菌株悬浮的前提条件是菌种为固体菌种，培养基为液体培养基，即固体菌种悬浮在液体培养基中。解决菌种悬浮的技术方案有两种，一是在液体培养基的表层或浅表层设置起支架作用的支撑物，如不锈钢丝网或不锈钢钩架或海绵等；二是在培养菌种(种子培养阶段)时于固态培养基中添加增浮剂，如作物秸杆粉末或粗糠(稻壳)或锯末等，自这样的固体培养基上培养的固体菌种会悬浮在液体培养基中。
本培养方法以亮菌和蜜环菌为出发菌株，包括母种培养、固体菌种培养和静置悬浮培养，与现有技术的区别在于固体菌种通过静置悬浮培养成菌索。
本静置悬浮培养方法之一是将固体菌种接种在位于液体培养基表层或浅表层处的起支架作用的支撑物上，于24～28℃条件下静置培养16～22天，优选25～27℃，静置培养18～20天。
静置悬浮培养用的液体培养基优选每升培养基含玉米粉5～15g， 黄豆粉 5～15g，葡萄糖5～15g， 蔗糖15～25g，KH2PO40.5～1.5g， MgSO40.2～1.0g。
最佳每升培养基含玉米粉10g，黄豆粉 10g，葡萄糖10g，蔗糖20g，KH2PO41g， MgSO40.5g。
所述的玉米粉和黄豆粉是指各自加水浸煮后分离得到的水浸煮液，合并后定容至所需的体积。
本静置悬浮培养方法之二是将母种接种在添加有增浮剂的固体培养基上于24～28℃条件下固态发酵培养35～45天制备固体菌种，优选25～27℃，培养38～42天制备固体菌种。将该固体菌种接种到液体培养中进行静置悬浮培养时会自动悬浮在液体培养基上。
培养固体菌种的固体培养基优选以下组分和重量份数玉米粉80～110份 麦麸 30～50份山芋粉40～60份增浮剂 40～60份水200～800份。
最佳玉米粉100份 麦麸 40份山芋粉50份增浮剂 50份水600份。
所述的增浮剂选自作物秸杆粉末或粗糠(稻壳)或锯末等。
静置悬浮培养用的液体培养基同上，即每升培养基中含玉米粉5～15g，黄豆粉 5～15g，
葡萄糖 5～15g，蔗糖15～25g，KH2PO40.5～1.5g， MgSO40.2～1.0g。
最佳每升培养基含玉米粉 10g， 黄豆粉 10g，葡萄糖 10g， 蔗糖 20g，KH2PO41g，MgSO40.5g。
所述的玉米粉和黄豆粉是指各自加水浸煮后分离得到的水浸煮液，合并后定容至所需的体积。
静置悬浮培养温度24～28℃，时间16～22天。优选25～27℃，18～20天。
静置培养结束后取出菌索用水提醇沉法提取多糖。即将菌索匀浆后加水于40～60℃条件下浸提2～3小时后分离，浸提2～3次，合并滤液，负压浓缩后加95％乙醇直至多糖沉淀析出完全，过滤分离，将沉淀干燥便是多糖，无定形灰白色粉末。自亮菌菌索中可提取出8～10％(w/w)的亮菌多糖，自蜜环菌菌索中可提取出10～12％(w/w)的蜜环菌多糖。
活性多糖的毒性实验研究急性毒性作用取20±2g雌雄各半的健康小鼠50只，随机分成5组，将亮菌多糖及蜜环菌多糖分别按5g/kg/d，10g/kg/d剂量和生理盐水分别对5组小鼠进行灌胃，每天上、中、下午各灌胃一次，连续灌胃4天，观察其行为表现、体重、皮毛的色泽及形状、对各种刺激的反应、胃肠道反应、食欲、大小便的状况及颜色、呼吸系统的状况、瞳孔大小、眼睑的状况等。未发现小鼠因药物中毒死亡现象，且所观察的各状况均正常。小鼠的胸腺、肝脏、肾脏、脾脏、胰脏石腊切片在高倍显微镜下观察到亮菌、蜜环菌多糖5g/kg/d，10g/kg/d组各器官与其对照组相比，其组织结构、细胞形状均无明显变化。小鼠对亮菌、蜜环菌多糖的最大耐受量＞10g/kg/d。试验证明，亮菌、蜜环菌多糖无急性毒性作用。
长期毒性实验将亮菌多糖及蜜环菌多糖分别设三个剂量组灌胃给药，每天一次，连续180天。结果高、中、低剂量组的大鼠健康状况、生长发育、外围血象、肝肾功能均无影响，病理检查亦无明显变化。
活性多糖的药理活性研究实验证明亮菌多糖能提高受照小鼠存活率及SOD活性、升高白细胞、骨髓DNA含量，抑制小鼠精子畸变率、骨髓微核细胞数的增加，并使受照鼠胸腺、脾脏重量回升，还能增加内源性脾结节数，降低MDA含量，表明亮菌菌索多糖对γ射线所致小鼠辐射损伤有较好保护作用。
亮菌多糖可以促使ConA诱导小鼠体内T淋巴细胞自分泌IL-2。因此，亮菌多糖可以通过刺激淋巴细胞产生细胞因子提高小鼠的免疫功能。
实验表明，亮菌多糖动物半体内抑瘤率为81％，体内抑瘤率对S180为35.8％，对HAC为37.7％；亮菌多糖能抑制小鼠S180肿瘤的生长和增强巨噬细胞的活性。
亮菌多糖具有消炎，退黄疸和降低谷丙转氨酶以及解痉和镇痛作用。可用于急、慢性肝炎及胆道疾病的治疗。
蜜环菌多糖具有中枢镇静作用，与中枢抑制剂戊巴比妥钠有协同作用，能延长小鼠的睡眠时间，对中枢兴奋药五烯氮哇有拮抗作用，能降低尼古丁引起的小鼠死亡率，增加犬的脑血流量和冠状动脉血流量；蜜环菌多糖对不同病因(高血压、椎基底动脉供血不足、植物神经功能紊乱及及阴虚阳亢型病人)引起的眩晕症状均有一定效果，疗效高达70％～80％，对肢麻、耳鸣、癫痫、顽固性神经衰弱、血管性头痛、巴金森氏综合症和三叉神经痛等也有一定的疗效。
蜜环菌多糖具有显著的免疫调节功能，能增加正常小鼠和环磷酰胺所致免疫功能抑制小鼠溶血素的含量，当剂量为100mg(kg.d)时，5天后能显著增加两种小鼠的空斑形成细胞数，体外试验表明蜜环菌多糖对T细胞的功能有促进作用；同时，蜜环菌多糖还能增加小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分数和吞噬指数。
此外，蜜环菌多糖还具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、促进造血机能、降低血糖、提高记忆力、抑制肿瘤生长等作用。
试验表明，自本静态悬浮培养方法制备小蜜环菌属真菌菌索中提取的活性多糖等目标化合物，可作为原料药使用。
本培养方法，在实验室中是将培养瓶置于恒温箱或恒温室内培养，无需摇瓶振荡，在工业装置中只需对发酵容器保温，无需搅拌。在静置培养过程中，菌株自培养基中吸取营养，自空气中吸收氧份，菌丝体向下方生长直至长成粗壮的菌索并充满整个培养瓶。所得到的菌索以干重法计，其产量对亮菌可达15～20g/L，对蜜环菌可达35～40g/L。相对于固态发酵或液体深层发酵，操作简单，分离方便，周期短，菌索产量高、活性多糖产率也高且稳定。
具体实施例方式
(一)、液体培养基的配制现以配制1000ml液体培养基为例，非限定实施例叙述如下
1、取玉米粉、黄豆粉各8g，各自加100ml水煮沸20～30分钟，分离，如此浸煮三次各得浸煮液300ml，合并浸煮液计600ml，取葡萄糖8g、蔗糖15g、KH2PO40.5g、MgSO4·7H2O 0.3g加入浸煮液中搅拌溶解并定容至1000ml，消毒灭菌备用。
2、取玉米粉12g、黄豆粉12g、葡萄糖12g、蔗糖25g、KH2PO41.5g、MgSO4·7H2O1g，操作同实施例1。
3、取玉米粉8g、黄豆粉12g、葡萄糖8g、蔗糖25g、KH2PO40.5g、MgSO4·7H2O1g，操作同实施例1。
4、取玉米粉12g、黄豆粉8g、葡萄糖12g、蔗糖15g、KH2PO41.5g、MgSO4·7H2O0.3g，操作同实施例1。
5、取玉米粉、黄豆粉各10g、葡萄糖10g、蔗糖20g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O0.6g，操作同实施例1。
(二)、种子培养1、亮菌一级母种培养培养基PDA培养基。
培养条件25～28℃于暗光照下培养12天，pH自然。
2.1亮菌二级种子培养(固态发酵培养)将步骤1活化好的母种用接种铲挑出1块接种于固体培养基(500ml瓶，装料量为达到瓶子高度的2/3。)中，每瓶装有下列培养基，扣紧瓶盖，瓶盖内有一层专用耐高温聚乙烯塑料膜和一层牛皮纸。
培养基组分玉米粉100g，麦麸50g，山芋粉50g，饮用水600ml。
培养条件培养温度26℃，pH自然条件下培养40天。
用本培养方法制备的亮菌固体菌种适用于使用支撑物的静置悬浮培养。
2.2亮菌二级种子培养(固态发酵培养)将步骤1活化好的母种用接种铲挑出1块接种于固体培养基(500ml瓶，装料量为达到瓶子高度的2/3。)中，每瓶装有下列任一培养基，扣紧瓶盖，瓶盖内有一层专用耐高温聚乙烯塑料膜和一层牛度纸。
培养基组分(1)、玉米粉80g，麦麸30g，山芋粉40g，麦秸杆粉末40g，饮用水300g。
(2)、玉米粉110g，麦麸50g，山芋粉60g，稻秸杆粉末60g，饮用水700g。
(3)、玉米粉80g，麦麸50g，山芋粉40g，粗糠60g，饮用水600g。
(4)、玉米粉110g，麦麸30g，山芋粉60g，锯末40g，饮用水600g。
(5)、玉米粉100g，麦麸50g，山芋粉50g，粗糠30g、麦秸杆粉末20g，饮用水600g。
培养条件培养温度26℃，pH自然条件下培养40天。
用本培养方法制备的亮菌固体菌种适用于直接接种在液体培养基中进行静置悬浮培养，本固体菌种可悬浮在液体培养基的表层或浅表层处。
蜜环菌的一级母种培养和二级种子培养与亮菌相同，得到的固体菌种或使用支撑物进行静置悬浮培养，或直接接种在液体培养基中进行静置悬浮培养。
(三)、静置悬浮培养1、使用支撑物进行静置悬浮培养以8目不锈钢丝网为例，非限定实施例叙述如下将实施例(一)1～5的任一培养基装瓶，500ml瓶，装瓶量300ml，在培养基表层处设置不锈钢丝网。
用接种铲挑取实施例(二)2.1步骤中制备的亮菌固体菌种接种在不锈钢丝网上，将接种后的培养瓶置于恒温箱(室)中，于25～27℃、pH自然条件下培养18～20天。
用实施例(二)2.1方法制备的蜜环菌固体菌种同样接种在支撑物上进行静置悬浮培养，方法同上。
2、将固体菌种直接接种在液体培养基中进行静置悬浮培养将实施例(一)1～5的任一培养基装瓶，500ml瓶，装瓶量300ml。
用接种铲挑取实施例(二)2.2步骤中制备的亮菌固体菌种接种到培养瓶内的液体培养基中，菌种悬浮在培养基的表层处，将接种后的培养瓶置于恒温箱中，于25～27℃，pH自然条件下培养18～20天。
用实施例(二)2.2方法制备的蜜环菌菌种静置悬浮培养的方法同上。
权利要求
1.一种小蜜环菌属真菌的培养方法，以亮菌和蜜环菌为出发菌株，包括母种培养、固体菌种培养和静置悬浮培养，其特征在于所述的静置悬浮培养就是将固体菌种直接接种在位于液体培养基表层或浅表层处起支架作用的支撑物上于24～28℃条件下静置培养16～22天；所述的支撑物选自不锈钢丝网或不锈钢钩架或海绵。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于直接接种在支撑物上的固体菌种于25～27℃条件下静置培养18～20天。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于所述的液体培养基为每升培养基中含玉米粉5～15g，黄豆粉5～15g，葡萄糖5～15g，蔗糖 15～25g，KH2PO40.5～1.5g，MgSO40.2～1.0g。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述的液体培养基为每升培养基中含玉米粉10g，黄豆粉10g，葡萄糖10g，蔗糖 20g，KH2PO41g，MgSO40.5g。
5.一种小蜜环菌属真菌的培养方法，以亮菌和蜜环菌为出发菌株，包括母种培养、固体菌种培养和静置悬浮培养，其特征在于在固体菌种培养时将母种接种在添加有增浮剂的固体培养基上于24～28℃条件下固态发酵培养35～45天；所述的增浮剂选自作物秸杆粉末或粗糠或锯末。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于母种在固体培养基上于25～27℃、固态发酵培养38～42天。
7.根据权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于所述的固体培养基有以下组分和重量份数玉米粉80～110份麦麸 30～50份山芋粉40～60份 增浮剂40～60份水200～800份。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于所述的固体培养基为玉米粉100份麦麸 40份山芋粉50份 增浮剂50份水600份。
全文摘要
一种小蜜环菌属真菌的培养方法，以亮菌和蜜环菌为出发菌株，将经种子培养得到的固体菌种悬浮在液体培养基中于静置状态下24～28℃时培养16～22天制备亮菌菌索和蜜环菌菌索，旨在自菌索中提取活性多糖等目标化合物用作原料药。在液体培养基中设置支撑物使固体菌种悬浮，或者在固体培养基中添加增浮剂经固态发酵培养得到的固体菌种会自动悬浮在液体培养基中。本培养方法较之现有的固态发酵或液体深层发酵操作简单、分离方便、周期短、菌索产量高，活性多糖产率也高且稳定。
文档编号C12N1/14GK1923999SQ20061009607
公开日2007年3月7日 申请日期2006年9月13日 优先权日2006年9月13日
发明者沈业寿, 马金宝, 郑媛, 李赓, 李峰 申请人:安徽大学