专利名称：组合发酵生产d－乳酸工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种组合发酵技术生产D-乳酸工艺，可以根据该菌株在生长、代谢的不同阶段对氧气、活性因子及不同碳源、氮源需求量的差异，进行有氧、微氧、厌氧三段组合发酵。
背景技术：
乳酸在自然界中主要以三种构型存在D，L、L和D型。D-乳酸主要存在于细菌的细胞壁和芽孢杆菌属(Bacillus)细菌的孢子内，以及某些植物细胞内。D-乳酸(光学纯度97％以上)作为一个手性中心，是合成多种手性物质的前体，在医药、农药除草剂方面的实际应用正日益引起人们的重视。如钙拮抗剂降压药，皮考啉酸衍生物以及优良除草剂——骠马、威霸、二甲四氯丙酸、氟系等的重要合成前体。
D-乳酸是合成聚乳酸的重要原料，是理想的绿色高分子材料。以D-乳酸为原料的乳酸酯类广泛用于香料、合成树脂涂料、胶粘剂印刷油墨等生产中，而且可用于石油管道清洗、电子工业清洗及S-2-氯丙酸除草剂DuplosanR的手性合成原料等。
随着研究的深入，D-乳酸用途不断扩宽，市场需求量也将随之不断增加，所以寻找工艺简单、成本较低、产率较高的D-乳酸制备方法将产生巨大的社会效益和经济效益。
工业生产乳酸最早在1881年开始于美国，采用化学合成法，通常化学合成法生产的乳酸皆为DL-乳酸，随着光学活性乳酸的深入研究，目前D-乳酸的制备方法主要有手性拆分法、酶转化法、直接发酵法。
手性拆分法主要利用手性拆分剂作用于消旋乳酸，该法成本高，拆分条件苛刻，拆分剂毒性大，分离困难，环境污染严重，不符合全球环保意识不断增强的潮流，且不具备工业化生产的潜力。
酶转化法是利用L型的酶消耗DL或L型底物得到D型产物，由于可利用的酶制剂品种有限，酶的价格昂贵，易失活、不易放大产业化等。
直接发酵法是以粗制农作物或废弃物等为原料，接种微生物经发酵而生产乳酸。与化学合成法及酶转化法相比，发酵法可通过菌种选育或代谢调控而获得光学纯度的D-乳酸，此外还具有原料来源广泛、生产成本低、可循环利用、环境友好等优点，因此全世界近80％的厂家采用直接发酵法生产光学纯度乳酸。
发酵法生产乳酸的技术日益进步，主要是L-乳酸的发酵研究，当前D-乳酸的发酵水平远远落后于L-乳酸。2006年Takaaki Tanaka等以Lactobacillusdelbrueckii subsp.Delbrueckii IFO 3202为出发菌株，从米糠为原料发酵生产D-乳酸，pH6.0～6.8时产外消旋乳酸，随后控制体系pH5.0，36小时后在37℃100g/L的米糠产D-乳酸28g/L，其中D-乳酸的光学纯度为95％。而国内目前只有丁子建等2004年首次报道采用芽孢杆菌(Sporolactobacillus sp.)从葡萄糖发酵72小时，D-乳酸产量为40.7g/L，尚无工业化生产的报道。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足之处提供一种组合发酵生产D-乳酸工艺，以解决目前D-乳酸研究开发过程中存在发酵周期长、效率低、发酵液中目标产物D-乳酸浓度低、底物产物抑制、后提取过程复杂、生产成本高、工业放大困难等不足。
组合发酵生产D-乳酸工艺是采用以下方案实现的组合发酵生产D-乳酸工艺为1、平板培养采用肉汤培养基培养，肉汤培养基重量百分配比为蛋白胨1％、牛肉膏0.5％、NaCl0.5％、水余量，将乳酸杆菌接到肉汤培养基中，培养温度37℃，培养时间15～30h。
2、种子培养液体种子培养基重量百分配比为葡萄糖0.5～2％、酵母膏0.2～1.5％、蛋白胨0.5～2％、NaCl 0.2～0.8％、MgSO4·7H2O 0.01～0.05％、CaCO30.2～3％、水余量，将平板培养的乳酸杆菌接种到含30ml液体种子培养基中培养6～10h，pH控制在5.0～7.5，发酵温度37℃，培养转速为150～250rpm。
3、摇瓶培养摇瓶培养基重量百分配比为葡萄糖0.5～2％、蛋白胨0.5～1.5％、Na2HPO4·7H2O 0.2～0.6％、KH2PO40.1～0.2％、NaCl 0.3～0.9％、NH4Cl0.05～0.1％、MgSO4·7H2O 0.01～0.05％、CaCl2·2H2O 0.001～0.01％、水余量。
将种子培养基培养的乳酸杆菌接种到摇瓶培养基中进行培养，接种量为5～15％(v/v)，摇瓶培养温度37℃，pH控制在5.0～7.5，培养转速为150～250rpm。
4、发酵培养将摇瓶培养基培养的乳酸杆菌接种到发酵罐中的发酵培养基中培养，发酵培养基由组合发酵微生物培养所需的碳源、氮源配制成，根据该菌株在生长、代谢的不同阶段对氧气、活性因子及不同碳源、氮源需求量的差异，进行有氧、微氧、厌氧三段组合发酵技术。在第一阶段为有氧发酵阶段，氧气、空气或两者的混合物以总流速为1～2.5L/min混合流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为200～400rpm，维持溶氧浓度(DO)为70～100％。采用中和剂将pH值维持在5.0～7.5，温度控制在30～43℃，适量补料，好氧培养10～20h，当细胞浓度即光密度(O.D.)达到20～40时，转入第二阶段微氧发酵阶段，维持溶氧浓度(DO)在5～20％，微氧培养0.5～5h。再转入第三阶段厌氧产酸发酵阶段，停止供氧，温度控制在30～43℃，添加无菌中和剂将发酵体系pH值控制在5.0～7.5，发酵25～38h，产酸达到7.5％～13.1％。
发酵培养基本发明组合发酵微生物发酵培养所需的碳源选用葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、玉米粉、土豆粉、麦芽糖等中的一种成分或多种培养基成分混合物，浓度为0.5～8％。
氮源选用尿素、硫酸铵、氨水、大豆饼粉、玉米浆、棉子蛋白、花生饼粉等中的一种成分或多种培养基成分混合物，浓度为0.5～5％。
发酵培养基中除了添加碳源和氮源外，还需要添加其他无机离子等成分KH2PO40.2％，NaCl 0.15％，MgSO4·7H2O 0.025％，CaCl2·2H2O 0.001％。
调节体系pH的中和剂选用NaOH、CaCO3、Ca(OH)2、CaO、(NH4)2OH、KOH等中的一种或多种混合物。
采用流加糖或相关碳源和氮源等方法，使发酵过程实行高密度培养，当细胞浓度O.D.水平达到大约20～40时，转入微氧发酵阶段0.5～5小时，再转入厌氧状态产酸，用NaOH、CaCO3、Ca(OH)2、CaO、(NH4)2OH、KOH等中的一种或多种混合物，将发酵体系pH值控制在5.0～7.5，温度控制在30℃～43℃。发酵20～30小时后产酸达到13.1％，对糖的转化率为89％，光学纯度达99％。
本发明所用菌种来源乳酸杆菌(Lactobacillus)，宽度小于2μm，常常表现出长杆状，幼龄时单个或成对，生长旺盛。用次甲基蓝染色可显示出颗粒状物。不运动，不液化明胶，不产生吲哚和硫化氢。过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、联苯胺反应均为阴性。
组合发酵生产D-乳酸工艺特点1、可以根据该菌株在生长、代谢的不同阶段对氧气、活性因子(无机离子)及不同碳源、氮源需求量的差异，进行有氧、微氧、厌氧三段组合发酵技术，2、构建微生物高密度发酵调控培养技术，提高微生物菌体生长速率和体内的酶系活性。
3、针对高浓度产物和底物抑制D-乳酸生产菌的生长、代谢与产酸过程及高浓度D-乳酸会造成发酵体系pH下降等问题，开发在线控制手段集成，优化发酵过程，形成乳酸杆菌生长代谢过程与发酵过程模型化及控制技术集成化体系，提高了微生物代谢产酸的速率，缩短D-乳酸发酵周期，解决目前发酵法存在抑制的问题，提高发酵液中D-乳酸的浓度，可达13.1％以上，同时提高了D-乳酸分离收率，降低了生产成本。
组合发酵生产D-乳酸工艺生产的D-乳酸(光学纯度97％以上)作为一个手性中心，是合成多种手性物质的前体，在医药、化工、农药除草剂方面有着广泛的用途。
具体实施例方式
实施例1采用肉汤培养基将乳酸杆菌接到蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％肉汤平板培养基中，培养温度37℃，培养时间30h。将平板培养的乳酸杆菌接种到含30ml葡萄糖2％、酵母膏0.2％、蛋白胨2％、NaCl 0.5％、MgSO4·7H2O 0.05％、CaCO30.2％、水95.05％液体种子培养基中培养6h，pH控制在5.0～7.5，发酵温度37℃，培养转速为250rpm。再将10ml种子液转移至发酵培养基装液量为100ml的500ml摇瓶培养基中，于37℃250r/min进行培养10h，然后将种子液全部接种于发酵培养基中培养。
摇瓶培养基重量百分配比为葡萄糖0.5％、蛋白胨0.5％、Na2HPO4·7H2O 0.6％、KH2PO40.1％、NaCl 0.9％、NH4Cl 0.1％、MgSO4·7H2O 0.05％、CaCl2·2H2O0.01％、水96.74％。
发酵培养基重量百分配比为玉米粉2％，棉子蛋白3％，花生饼粉2％，KH2PO40.2％，NaCl 0.15％，MgSO4·7H2O 0.025％，CaCl2·2H2O 0.0013％、水92.6235％，灭菌后添加0.1％的高温淀粉酶，液化1h后，加入相同比例的糖化酶，并接入乳酸杆菌。
选用2.0L发酵罐，配置1.5L上述发酵培养基。在第一阶段，空气以总流速为1.5L/min混合流入，并以300rpm搅拌混合，维持溶氧浓度(DO)为70～100％。用20％(w/v)NaCO3将pH值维持在5.0～7.5，温度控制在37℃，适量补糖，好氧培养20h，当细胞浓度光密度(O.D.)水平达到25时，转入微氧，维持溶氧浓度(DO)为16％，3h。再转入厌氧状态，温度控制在45℃，添加无菌CaCO3将pH值控制在5.0～7.5，继续发酵10h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸的发酵产酸达到8.9％。
实施例2采用肉汤培养基将乳酸杆菌接到蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％肉汤平板培养基中，培养温度37℃，培养时间20h。将平板培养的乳酸杆菌接种到含30ml葡萄糖0.5％、酵母膏1.5％、蛋白胨0.5％、NaCl 0.8％、MgSO4·7H2O 0.01％、CaCO33％、水93.69％，液体种子培养基中培养8h，pH控制在5.0～7.5，发酵温度37℃，培养转速为200rpm。再将10ml种子液转移至发酵培养基装液量为100ml的500ml摇瓶培养基中，于37℃250r/min进行培养10h，然后将摇瓶培养液全部接种于发酵培养基中培养。
摇瓶培养基重量百分配比为葡萄糖2％、蛋白胨1.5％、Na2HPO4·7H2O 0.2％、KH2PO40.2％、NaCl 0.3％、NH4Cl 0.05％、MgSO4·7H2O 0.01％、CaCl2·2H2O 0.001％、水95.739％。
发酵培养基重量百分配比为玉米粉1.5％，大豆饼粉3％，土豆粉2％，KH2PO40.2％，NaCl 0.15％，MgSO4·7H2O 0.025％，CaCl2·2H2O 0.001％、水93.125％，灭菌后添加0.1％的高温淀粉酶，液化1h后，加入相同比例的糖化酶，并接入乳酸杆菌。
选用2.0L发酵罐，配置1.5L上述发酵培养基。在第一阶段，空气以总流速为1.0L/min混合流入，并以200rpm搅拌混合，维持溶氧浓度(DO)为70～100％。用20％(w/v)NaCO3将pH值维持在7.0，温度控制在37℃，适量补糖，好氧培养13h，当细胞浓度光密度(O.D.)水平达到30时，转入微氧，维持溶氧浓度(DO)为16％，3h。再转入厌氧状态，温度控制在45℃，添加无菌CaCO3将pH值控制在7.2，继续发酵9h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸的发酵产酸达到7.5％。
实施例3采用肉汤培养基将乳酸杆菌接到蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％肉汤平板培养基中，培养温度37℃，培养时间15h。将平板培养的乳酸杆菌接种到含30ml葡萄糖1.25％，酵母膏0.8％，蛋白胨1.25％， NaCl 0.5％，MgSO4·7H2O0.03％、水余量，CaCO31.6％、水96.6％，液体种子培养基中培养10h，pH控制在5.0～7.5，发酵温度37℃，培养转速为150rpm。再将10ml种子液转移至发酵培养基装液量为100ml的500ml摇瓶培养基中，于37℃150r/min进行培养10h。然后将摇瓶培养液全部接种于发酵培养基中培养。
摇瓶培养基重量百分配比为葡萄糖1.25％、蛋白胨1％、Na2HPO4·7H2O 0.4％、KH2PO40.15％、NaCl 0.6％、NH4Cl 0.075％、MgSO4·7H2O 0.025％、CaCl2·2H2O0.005％、水97.395％。
发酵培养基重量百分配比为麦芽糖3％，玉米浆4.5％，KH2PO40.2％，NaCl0.15％，MgSO4·7H2O 0.025％，CaCl2·2H2O 0.001％、水92.124％，灭菌后添加0.1％的高温淀粉酶，液化1h后，加入相同比例的糖化酶，并接入乳酸杆菌。
选用2.0L发酵罐，配置1.5L上述发酵培养基。在第一阶段，空气以总流速为1.2L/min混合流入，并以300rpm搅拌混合，维持溶氧浓度(DO)为70～100％。用20％(w/v)NaOH将pH值维持在7.0，温度控制在37℃，适量补糖，好氧培养20h，当细胞浓度光密度(O.D.)水平达到30时，转入微氧，维持溶氧浓度(DO)为16％，3h。再转入厌氧状态，温度控制在45℃，添加无菌CaCO3将pH值控制在7.2，继续发酵10h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸的发酵产酸达到9.2％。
实施例4将乳酸杆菌接到含30ml液体种子培养基中培养6h，再将15ml种子液转移至150ml摇瓶中培养10h，摇瓶于37℃，200rpm培养。然后全部接种于发酵培养基中。
摇瓶培养基重量百分配比为葡萄糖0.5％、蛋白胨0.5％、Na2HPO4·7H2O0.6％、KH2PO40.1％、NaCl 0.9％、NH4Cl 0.1％、MgSO4·7H2O 0.05％、CaCl2·2H2O0.01％、水96.74％。
发酵培养基重量百分配比为乳糖3％，尿素2％，果糖0.5％，硫酸铵0.5％，KH2PO40.2％，NaCl 0.15％，MgSO4·7H2O 0.025％，CaCl2·2H2O 0.001％、水93.624％，接入10％的乳酸杆菌。
选用2.0L发酵罐，配置1.5L上述发酵培养基。在第一阶段，氧气以总流速为1.5L/min混合流入，并以400rpm搅拌混合，维持溶氧浓度(DO)为70～100％。用20％(w/v)NaOH和KOH将pH值维持在7.0，温度控制在37℃，适量补糖，好氧培养11h，当细胞浓度光密度(O.D.)水平达到27时，转入微氧，维持溶氧浓度(DO)为8％，3h。再转入厌氧状态，温度控制在43℃，添加无菌CaCO3将pH值控制在7.2，厌氧发酵11小时后产酸达到8.2％。
实施例5将乳酸杆菌接到含30ml液体种子培养基中培养6h，再将15ml种子液转移至150ml摇瓶培养液中培养10h，摇瓶于37℃，200rpm培养。然后全部接种于发酵培养基中。
摇瓶培养基重量百分配比为葡萄糖2％、蛋白胨1.5％、Na2HPO4·7H2O 0.2％、KH2PO40.2％、NaCl 0.3％、NH4Cl 0.05％、MgSO4·7H2O 0.01％、CaCl2·2H2O0.001％、水95.739％。
发酵培养基重量百分配比为乳糖2％、葡萄糖0.5％、蔗糖0.5％、玉米浆3.5％、KH2PO40.2％、NaCl 0.15％、 MgSO4·7H2O 0.025％、CaCl2·2H2O 0.001％、水92.124％，灭菌后，接入10％的乳酸杆菌。
选用2.0L发酵罐，配置1.5L上述发酵培养基。在第一阶段，空气以总流速为1.1L/min混合流入，并以400rpm搅拌混合，维持溶氧浓度(DO)为70～100％。用20％(w/v)(NH4)2OH将pH值维持在7.0，温度控制在37℃，适量补糖，好氧培养13h，当细胞浓度光密度(O.D.)水平达到32时，转入微氧，维持溶氧浓度(DO)为8％，5小时。再转入厌氧状态，用15％(w/v)CaO将pH值控制在6.0，温度控制在42℃。厌氧发酵18小时后产酸达到12.3％。
实施例6将乳酸杆菌接到含30ml液体种子培养基中培养6h，再将15ml种子液转移至150ml摇瓶培养基中培养10h，摇瓶于37℃，250rpm培养，然后全部接种于发酵培养基中。
摇瓶培养基重量百分配比为葡萄糖1.25％、蛋白胨1％、Na2HPO4·7H2O 0.4％、KH2PO40.15％、NaCl 0.6％、NH4Cl 0.075％、MgSO4·7H2O 0.025％、CaCl2·2H2O0.001％、水96.499％。
发酵培养基重量百分配比为葡萄糖1％、果糖1％、乳糖0.5％、尿素0.5％、硫酸铵0.5％、玉米浆2％、KH2PO40.2％、NaCl 0.15％、MgSO4·7H2O 0.025％、CaCl2·2H2O 0.001％、水94.125％，灭菌后接入10％的乳酸杆菌。
选用2.0L发酵罐，配置1.5L上述发酵培养基。在第一阶段，空气和O2以总流速为1.0L/min混合流入，并以400rpm搅拌混合，维持溶氧浓度(DO)为70～100％。用28％(w/v)NH4OH和NaOH混合液将pH值维持在7.0，温度控制在37℃，适量补糖，好氧培养15h，当细胞浓度光密度(O.D.)水平达到40时，转入微氧，维持溶氧浓度(DO)为5％，1.5小时。再转入厌氧状态，用20％(w/v)CaCO3和Ca(OH)2混合物将pH值控制在6.5，温度控制在41℃。发酵28小时后产酸达到11.7％。
实施例7
将乳酸杆菌接到含30ml液体种子培养基中培养6h，再将10ml种子液转移至100ml摇瓶培养液中培养10h，摇瓶于37℃，150rpm培养。然后全部接种于发酵培养基中。
摇瓶培养基重量百分配比为葡萄糖1.2％、蛋白胨0.8％、Na2HPO4·7H2O 0.5％、KH2PO40.15％、NaCl 0.5％、NH4Cl 0.07％、MgSO4·7H2O 0.02％、CaCl2·2H2O0.01％、水96.75％。
发酵培养基重量百分配比为葡萄糖2％、玉米浆3％、NaH2PO4·H2O 0.015％、KH2PO40.032％、K2HPO4·3H2O 0.032％、NH4Cl 0.002％、(NH4)2SO40.02％、MgSO4·7H2O 0.01％，CaCl2·2H2O 0.001％、水94.92％。
选用2.0L反应器批次反应，最初含有1.5L上述发酵培养基。在第一阶段，空气和O2以总流速为1.0L/min混合流入，并以400rpm搅拌混合，维持溶氧浓度(DO)为70～100％。用30％(w/v)NaOH将pH值维持在7.0，温度控制在37℃，流加30％浓度的葡萄糖溶液，当细胞浓度光密度(O.D.)水平达到37时，转入微氧，维持溶氧浓度(DO)为10％，2小时。再转入厌氧状态，用20％(w/v)NaOH将pH值控制在5.0～7.0，温度控制在43℃。发酵24小时后产酸达到13.1％，对糖的转化率为90％，光学纯度达98％。
权利要求
1.一种组合发酵生产D-乳酸工艺，其特征在于其工艺为(1)平板培养采用肉汤培养基培养，将乳酸杆菌接种到肉汤培养基中，培养温度37℃，培养时间15～30h；(2)种子培养将平板培养的乳酸杆菌接种到液体种子培养基中培养6～15h，pH控制在5.0～7.5，发酵温度37℃，培养转速为150～250rpm；(3)摇瓶培养将种子培养基培养的乳酸杆菌接种到摇瓶培养基中进行培养，接种量为5～15％(v/v)，摇瓶培养温度37℃，pH控制在5.0～7.5，培养转速为150～250rpm；(4)发酵培养将摇瓶培养基培养的乳酸杆菌接种到发酵罐中的发酵培养基中培养，发酵培养基由组合发酵微生物培养所需的碳源、氮源配制而成，根据该菌株在生长、代谢的不同阶段对氧气、活性因子及不同碳源、氮源需求量的差异，进行有氧、微氧、厌氧三段组合发酵技术，在第一阶段为有氧发酵阶段，氧气、空气或两者的混合物以总流速为1～2.5L/min混合流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为200～400rpm，维持溶氧浓度(DO)为70～100％，采用中和剂将pH值维持在5.0～7.5，温度控制在30～43℃，补料，好氧培养10～20h，当细胞浓度即光密度(O.D.)达到20～40时；转入第二阶段微氧发酵阶段，维持溶氧浓度(DO)在5～20％，微氧培养0.5～5h；再转入第三阶段厌氧产酸发酵阶段，停止供氧，温度控制在30～43℃，添加无菌中和剂将发酵体系pH值控制在5.0～7.5，发酵25～38h，产酸达到7.5％～13.1％。
2.根据权利要求1所述的组合发酵生产D-乳酸工艺，其特征在于肉汤培养基重量百分配比为蛋白胨1％、牛肉膏0.5％、NaCl0.5％、水余量。
3.根据权利要求1所述的组合发酵生产D-乳酸工艺，其特征在于液体种子培养基重量百分配比为葡萄糖0.5～2％、酵母膏0.2～1.5％、蛋白胨0.5～2％、NaCl0.2～0.8％、MgSO4·7H2O0.01～0.05％、CaCO30.2～3％、水余量。
4.根据权利要求1所述的组合发酵生产D-乳酸工艺，其特征在于摇瓶培养基重量百分配比为葡萄糖0.5～2％、蛋白胨0.5～1.5％、Na2HPO4·7H2O 0.2～0.6％、KH2PO40.1～0.2％、NaCl 0.3～0.9％、NH4Cl 0.05～0.1％、MgSO4·7H20 0.01～0.05％、CaCl2·2H2O 0.001～0.01％、水余量。
5.根据权利要求1所述的组合发酵生产D-乳酸工艺，其特征在于组合发酵微生物发酵培养所需的碳源选用葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、玉米粉、土豆粉、麦芽糖中的一种成分或多种培养基成分混合物；氮源选用尿素、硫酸铵、氨水、大豆饼粉、玉米浆、棉子蛋白、花生饼粉中的一种成分或多种培养基成分混合物。
6.根据权利要求1或5所述的组合发酵生产D-乳酸工艺，其特征在于发酵培养基中除了添加碳源和氮源外，还需要添加其他无机离子成分，无机离子重量百分配比为KH2PO40.2％、NaCl 0.15％、MgSO4·7H2O 0.025％、CaCl2·2H2O0.001％。
7.根据权利要求1所述的组合发酵生产D-乳酸工艺，其特征在于调节体系pH的中和剂选用NaOH、CaCO3、Ca(OH)2、CaO、(NH4)2OH、KOH中的一种或多种混合物。
全文摘要
本发明涉及的是一种组合发酵技术生产D－乳酸工艺，可以根据该菌株在生长、代谢的不同阶段对氧气、活性因子及不同碳源、氮源需求量的差异，进行有氧、微氧、厌氧三段组合发酵。其工艺为(1)平板培养将乳酸杆菌接到肉汤培养基中培养；(2)种子培养将平板培养的乳酸杆菌接种到含30ml液体种子培养基中培养；(3)摇瓶培养将种子培养基培养的乳酸杆菌接种到摇瓶培养基中进行培养；(4)发酵培养将摇瓶培养基培养的乳酸杆菌接种到发酵罐中的发酵培养基中培养，进行有氧、微氧、厌氧三段组合发酵技术，温度控制在30～43℃，添加无菌中和剂将发酵体系pH值控制在5.0～7.5，发酵25～38h，产酸达到7.5％～13.1％。
文档编号C12R1/225GK1952164SQ20061009745
公开日2007年4月25日 申请日期2006年11月10日 优先权日2006年11月10日
发明者杨文革, 胡永红, 陈春晓, 沈飞 申请人:南京工业大学