专利名称：糜子抗旱基因s－腺苷甲硫氨酸合成酶基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域。特别涉及一个来源于糜子的抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，其编码蛋白及其在培育抗旱和水分高效利用植物中的用途。
背景技术：
分离抗旱相关基因，并获得转基因植物是植物抗旱性遗传改良的一个重要途径。通过多种分子生物学方法分离耐旱生物(如微生物、植物和动物)与生物水分缺失反应及其调节有关的蛋白质合成酶的相应基因是一种较好的选择。脯胺酸合成酶基因、海藻糖合成酶基因、传递信号和调控基因表达的转录因子等基因已从微生物、昆虫及植物(如山菠菜)等得到克隆，并导入部分植物(如甜菜、烟草、拟楠芥菜、小麦、玉米等)，获得转基因植物的耐旱性和耐寒性有所提高，展示了良好的应用潜力。
利用获得的抗旱基因构建植物表达载体，转化植物，获得转基因植物，为植物育种提供新的抗旱和水分高效利用的新种质，选育出抗旱和水分高效利用的新品种，是提高农业生产力和竞争力的一个重要方面。
糜子(Panicum miliaceum L.)，为禾本科黍属(Panicum)，起源于我国，在华夏民族的发展中发挥过重要的作用。与其它禾本科作物如小麦、玉米相比，糜子具有耐旱、抗逆、水分利用效率高等特点，是植物抗旱性改良的优异基因资源。经检索，未发现任何公开或报道糜子抗旱和水分高效利用相关的功能基因克隆的相关文献。
发明内容
研究表明，利用糜子抗旱和水分高效利用机制提高其它作物(如小麦、玉米等)的抗旱性和水分利用效率，将对提高作物产量、缓解水分供需矛盾具有十分重要的作用。糜子在干旱和复水条件下表达的调控基因是糜子抗旱机制中最重要的成分之一。
本发明的目的在于，提供糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因及其用途。
本发明通过抑制减法杂交(SSH)技术分别构建了糜子抗旱种质的复水与干旱、复水与正常灌水的cDNA文库，对文库中所获克隆进行了随机测序，分离获得的糜子复水EST中有一条(RS-162，GenBank收录号DW177307)与水稻S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有较高的同源性，氨基酸一致性为148/157(94％)，该EST包含有该基因的3’端序列。根据水稻及大麦的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的核酸序列，设计了一条简并的上游引物(5-AGATGGCYGMASTTGAWACC-3)，根据糜子的该EST序列设计了一条下游引物(5-TGAGGTCCACCGATGACAAA-3)。以糜子抗旱种质复水初期的叶片中提取的总RNA反转录得到的cDNA为模板，利用这对引物对进行PCR扩增，获得了一个741bp的片段，克隆测序后，该片段为糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的5’端序列，将该片段与其3’端序列进行拼接，获得了含有1293bp的糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长cDNA序列。该cDNA序列含有5’端非翻译区的两个核苷酸，3’端非翻译区的103个核苷酸，编码区为1188个核苷酸，编码396个氨基酸。通过软件预测，该蛋白的等电点为5.50，分子量为43243.02，定位在细胞骨架里。
本发明的糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表达模式，经RT-PCR分析表明，该基因在正常情况下表达，在干旱胁迫下(土壤相对含水量为36％)诱导上调表达，重度胁迫下(土壤相对含水量24％)表达水平下降，复水后2h再次上调表达，且表达量最高，随后下降到正常水平。表明该基因主要参与干旱胁迫初期信号传导过程，调控相关干旱防御和复水生长的功能基因，是糜子抗旱的关键基因，利用它构建表达载体转化小麦、玉米等作物或其它植物，提高其抗旱性和水分利用效率，具有很大的应用潜力。
图1是本发明的糜子抗旱S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长cDNA序列及推导的该基因编码蛋白质的氨基酸序列；图2是糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的保守结构域；图3是几种植物S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列的多重比较；图4是几种植物S-腺苷甲硫氨酸合成酶的氨基酸序列的系统进化树；图5是糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因在不同水分处理和复水条件下表达的RT-PCR分析。
以下结合附图和发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式
1.糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase，SAMS)催化甲硫氨酸和ATP反应生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，S-腺苷甲硫氨酸参与甲硫氨酸的生物合成，甲硫氨酸是乙烯及多胺的前体，同时SAM还具有转甲基、转硫、转氨丙基等作用，是一种重要的代谢中间物质。
本发明通过抑制减法杂交(SSH)技术分别构建了糜子抗旱种质的复水与干旱、复水与正常灌水的cDNA文库，对文库中所获克隆进行了随机测序，分离获得的糜子复水EST中有一条(RS-162，GenBank收录号DW177307)与水稻的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有较高的同源性，氨基酸一致性为148/157(94％)，该EST包含有该基因的3’端序列。根据水稻及大麦的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的核酸序列，设计了一条简并的上游引物(5-AGATGGCYGMASTTGAWACC-3)，根据糜子的该EST序列设计了下游引物(5-TGAGGTCCACCGATGACAAA-3)。以糜子抗旱种质复水初期的叶片中提取的总RNA反转录得到的cDNA为模板，利用这对引物对进行PCR扩增，获得了一个741bp的片段，克隆测序的序列分析表明该片段为糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的5’端序列，将该片段序列与3’端序列进行拼接，获得了一个含有1293bp的糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长cDNA序列。
20μL PCR反应体系中包括cDNA第一链模板1μL，10×PCR Buffer 2μL，dNTP(2mmol/L)2μL，正向引物(10mmol/L)1μL，反向引物(10mmol/L)1μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，ddH2O补齐至20μL。
PCR反应程序为95℃预变性3min，接着进行95℃40s，55℃40s，72℃90s，共35个循环；最后于72℃延伸8min，反应后于4℃保温。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
获得的糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长cDNA序列为1293bp，含有5’端非翻译区的两个核苷酸，3’端非翻译区的103个核苷酸，该基因编码396个氨基酸(附图1)。通过软件预测，该蛋白的等电点为5.50，分子量为43243.02，定位在细胞骨架里。
2.糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因编码的氨基酸序列的初步分析利用http//wolfpsort.seq.cbrc.jp/对该基因编码的氨基酸序列进行亚细胞定位分析，结果表明，该糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶定位在细胞骨架里。
利用NCBI的rpsblast对该糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因编码的氨基酸序列进行保守结构域比对分析，结果表明该基因含有S-腺苷甲硫氨酸合成酶的三个典型的结构域，N端结构域、中间结构域及C端结构域(附图2)。
对来源于马铃薯(Solanum tuberosum)、拟楠芥菜(Arabidopsisthaliana)、甜菜(Beta vulgaris)、大麦(Hordeum vulgare)、荔枝(Litchichinensis)、番茄(Lycopersicon esculentum)、水稻(Oryza sativa)及糜子(Panicum miliaceum)等8种植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因进行了氨基酸序列的多重比较(见附图3)，结果表明，不同植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因相似程度较高。
系统进化树显示，这8种植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因相似性在92％-97％，该基因在植物的进化中非常保守(见附图4)。
3.糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因表达的RT-PCR分析以珍珠粟(Pennisetum glaucum(L.)R.Br，pearl millet)组成型表达的肌动蛋白(actin)基因片段序列为依据，合成了一对扩增糜子组成型表达的肌动蛋白(actin)基因片段的引物，对糜子的mRNA进行RT-PCR扩增获得了一个171bp的产物，测序比对表明，该片段与水稻肌动蛋白(actin)具有较高的同源性，为糜子actin基因片段，可以此作为内参确定不同处理的模板量。
采用引物(5-GCTGCCAAGAGCATTGTT-3和5-TGATAAGCGTGACAGACCA-3)，分别对糜子抗旱种质材料植株在土壤相对含水量为75％、36％、24％和复水后2h、6h、12h的叶片样品提取的mRNA进行RT-PCR分析。
20μL反应体系中包括经内参调整的适宜体积的cDNA模板，10×PCRBuffer 2μL，dNTP(2mmol/L)2μL，正向引物(10mmol/L)0.5μL，反向引物(10mmol/L)0.5μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，ddH2O补齐至20μL。
PCR反应程序为95℃预变性3min，接着进行95℃40s，55℃45s，72℃40s，共35个循环；72℃延伸8min，反应后于4℃保温。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
RT-PCR分析表明(见附图5)，该糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因在正常情况下有一定量的表达，在干旱胁迫下(土壤相对含水量为36％)诱导表达，重度胁迫下(土壤相对含水量24％)表达受到抑制，复水后2h表达量最高，随后下降到比正常生长还低的水平。说明该基因主要参与干旱胁迫初期信号传导过程，从而调控相关干旱防御的功能基因。
本发明的糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因来源于最抗旱的禾本科作物糜子，为改良禾本科作物的抗旱性和水分利用效率提供了更好的基因。
该基因属于信号传导相关基因，可以启动下游一系列与抗旱及水分高效利用基因的表达，更便于应用到植物抗旱性和水分利用效率的改良，有效地提高植物的抗旱性和水分利用效率。
发明人给出了以下具体的实施例。
实施例1以该基因与含有相应植物启动子(如CaMV 35，actin启动子等)的表达载体连接，构建糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表达载体，转化大肠杆菌等获得含有该基因的菌株；或者将该基因与含有相应植物启动子(如CaMV 35，actin启动子等)的T-DNA双元载体等连接，构建糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的T-DNA表达载体，转化大肠杆菌等获得含有该基因的菌株，与相应的农杆菌株系进行融合，获得含有该基因的农杆菌菌株。
实施例2对实施例1中获得的大肠杆菌菌株或农杆菌菌株进行繁殖，提取含有糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表达载体的DNA或直接利用繁殖获得的菌液，采用本领域工作人员共知的方法(如花粉管通道法、基因枪法、农杆菌介导法等)转化小麦、玉米等作物或其它植物；筛选获得该基因恰当表达的转基因植株，改良现有作物或植物品种的抗旱性和水分利用效率。
糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的cDNA序列1 AG GCTGAAGTTGAAACCTTCCTCTTCACCTCGGAGTCTGTGAACGAGGGACACCCTGAC63AAGCTCTGCGATCAGGTCTCAGATGCCGTGCTCGACGCTTGCCTTGCTGAGGACCCTGAC123 AGCAAGGTTCCTTGCGAGACATGCACCAAGACTAACATGGTCATGGTCTTTGGTGAGATC183 ACCACCAAGGCCAATGTCGACTACGAGAAGATTGTCAGGGAGACTTGCCGCAACATTGGT243 TTCGTGTCAGCAGATGTTGGGCTTGACGCTGACCACTGCAAGGTGCTCGTGAACATTGAG303 CAGCAGTCCCCTGATATTGCTCAGGGTGTGCATGGTCACTTCACAAAGCGCCCTGAGGAG363 ATTGGAGCTGGTGACCAGGGACACATGTTTGGGTATGCGACTGATGAAACCCCTGAGCTG423 ATGCCCCTCAGCCATGTCCTTGCAACCAAGCTTGGTGCTCGCCTCACTGAGGTGCGCAAG483 AACGGGACCTGCCCCTGGCTCAGGCCTGATGGAAAGACCCAGGTGACTGTTGAGTACCGC543 AATGAGGGTGGTGCCATGGTGCCCATCCGCGTCCACACTGTCCTCATCTCTACCCAGCAC603 GACGAGACAGTCACCAACGATGAGATTGCCGCTGACCTCAAGGAGCACGTCATCAAGCCT663 GTCATCCCTGAGCAGTACCTTGATGAGAAGACCATCTTCCACCTTAACCCATCTGGTCGC723 TTTGTCATCGGTGGACCTCATGGTGATGCTGGTCTCACTGGCCGGAAGATCATCATTGAT783 ACCTATGGTGGCTGGGGAGCCCACGGTGGTGGTGCTTTCTCTGGCAAGGACCCGACCAAG843 GTTGACCGCAGTGGAGCCTACATTGCAAGGCAGGCTGCCAAGAGCATTGTTGCTAACGGC903 CTTGCTCGCCGCGCCATCGTCCAGGTCTCCTACGCCATTGGTGTGCCAGAGCCGCTCTCC963 GTGTTTGTGGACACATACGGCACTGGCACGATCCCCGACAAGGAGATCCTCAAGATTGTG1023 AAGGAGAACTTTGACTTCAGGCCTGGCATGATCATCATCAACCTCGACCTCAAGAAAGGT1083 GGCAACGGGCGCTACCTTAAGACAGCGGCCTACGGTCACTTCGGAAGGGATGACCCTGAC1143 TTCACCTGGGAGGTGGTGAAGCCCCTCAAGTGGGAGAAGCCTTCTGCC GGTGCCCTT1203 TTGGAAGAAGCTTTTGGTCTGTCACGCTTATCATGTTTTGTGGCTTCTGTGTTGTGCTTC1263 TTGATCTGCCCCTTGCTGTCATTTGTATTGT
权利要求
1.糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，其特征在于，编码该基因的cDNA序列为1293bp，含有5’端非翻译区的两个核苷酸，3’端非翻译区的103个核苷酸，编码框为1188个核苷酸，编码396个氨基酸；该基因的cDNA序列为 63AAGCTCTGCGATCAGGTCTCAGATGCCGTGCTCGACGCTTGCCTTGCTGAGGACCCTGAC123 AGCAAGGTTCCTTGCGAGACATGCACCAAGACTAACATGGTCATGGTCTTTGGTGAGATC183 ACCACCAAGGCCAATGTCGACTACGAGAAGATTGTCAGGGAGACTTGCCGCAACATTGGT243 TTCGTGTCAGCAGATGTTGGGCTTGACGCTGACCACTGCAAGGTGCTCGTGAACATTGAG303 CAGCAGTCCCCTGATATTGCTCAGGGTGTGCATGGTCACTTCACAAAGCGCCCTGAGGAG363 ATTGGAGCTGGTGACCAGGGACACATGTTTGGGTATGCGACTGATGAAACCCCTGAGCTG423 ATGCCCCTCAGCCATGTCCTTGCAACCAAGCTTGGTGCTCGCCTCACTGAGGTGCGCAAG483 AACGGGACCTGCCCCTGGCTCAGGCCTGATGGAAAGACCCAGGTGACTGTTGAGTACCGC543 AATGAGGGTGGTGCCATGGTGCCCATCCGCGTCCACACTGTCCTCATCTCTACCCAGCAC603 GACGAGACAGTCACCAACGATGAGATTGCCGCTGACCTCAAGGAGCACGTCATCAAGCCT663 GTCATCCCTGAGCAGTACCTTGATGAGAAGACCATCTTCCACCTTAACCCATCTGGTCGC723 TTTGTCATCGGTGGACCTCATGGTGATGCTGGTCTCACTGGCCGGAAGATCATCATTGAT783 ACCTATGGTGGCTGGGGAGCCCACGGTGGTGGTGCTTTCTCTGGCAAGGACCCGACCAAG843 GTTGACCGCAGTGGAGCCTACATTGCAAGGCAGGCTGCCAAGAGCATTGTTGCTAACGGC903 CTTGCTCGCCGCGCCATCGTCCAGGTCTCCTACGCCATTGGTGTGCCAGAGCCGCTCTCC963 GTGTTTGTGGACACATACGGCACTGGCACGATCCCCGACAAGGAGATCCTCAAGATTGTG1023 AAGGAGAACTTTGACTTCAGGCCTGGCATGATCATCATCAACCTCGACCTCAAGAAAGGT1083 GGCAACGGGCGCTACCTTAAGACAGCGGCCTACGGTCACTTCGGAAGGGATGACCCTGAC 1203 TTGGAAGAAGCTTTTGGTCTGTCACGCTTATCATGTTTTGTGGCTTCTGTGTTGTGCTTC1263 TTGATCTGCCCCTTGCTGTCATTTGTATTGT。
2.权利要求1所述的糜子抗旱基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，用于与相应的植物启动子连接，构建糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表达载体或转化获得糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的宿主菌的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，通过基因枪、农杆菌介导或花粉管通道等方法进行遗传转化将糜子S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表达载体导入小麦、玉米等作物或其它植物，获得抗旱性和水分利用效率得到改良的转基因植物细胞系及转基因植株。
全文摘要
本发明公开了糜子抗旱基因S－腺苷甲硫氨酸合成酶基因及其用途，该基因的cDNA序列为1293bp，包含5’端非翻译区的两个核苷酸，3’端非翻译区的103个核苷酸，编码396个氨基酸。该基因编码蛋白的等电点为5.50，分子量为43243.02，定位在细胞骨架里。RT－PCR表达模式分析表明，该基因在正常情况下有一定量的表达，在干旱胁迫下(土壤相对含水量为36％)诱导表达，重度胁迫下(土壤相对含水量24％)表达受到抑制，复水后2h表达量最高，随后下降到正常生长水平。表明该基因主要参与干旱胁迫和复水初期的信号传导过程，调控与干旱防御和复水生长相关的功能基因，是糜子抗旱的关键基因，利用其转化小麦、玉米等作物和其它作物，提高其水分利用效率，具有很大的应用潜力。
文档编号C12N9/00GK1908173SQ20061010447
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月7日 优先权日2006年8月7日
发明者胡银岗, 林凡云 申请人:西北农林科技大学