专利名称：利用金磁微粒分离mRNA的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种利用金磁微粒分离mRNA 的方法。
技术背景从组织或细胞中分离mRNA，是分子生物学、遗传工程领域的一项基本 技术。典型哺乳动物一个细胞中只有大约10 pg的RNA，而mRNA则仅占 总RNA的1一5X。常用的mRNA的分离方法有(1) oligo(dT)—纤维素柱 层析法，基于oligo(dT) —纤维素亲和色谱柱对PolyA+ mRNA的专一吸附， 然后经洗脱缓冲液洗脱获得PolyA+mRNA。 (2) oligo(dT)—纤维素液相离心 法，即用oligo(dT) —纤维素直接加人到总的RNA溶液中使PolyA+mRNA与 oligo(dT)—纤维素结合，离心收集寡聚(dT)—纤维素/mRNA复合物，再用洗 脱液分离mRNA，然后离心除去oligo(dT)—纤维素。这两种方法的过程均比 较复杂，费时、费力。目前mRNA分离试剂盒多基于亲和色谱法原理，这 些试剂盒的主要特点是用微粒状的digo(dT)吸附剂代替纤维状的oligo(dT) 纤维素，用旋转柱法取代统的柱色谱法。应用亲和色谱法进行mRNA分离 时，仍存在亲和柱流速慢、易堵塞、mRNA产量低，容易发生非特异性偈连 等缺点。磁性复合微粒，以超顺磁性纳米微粒与有机或无机材料，通过包覆、交 联、修饰而制备的纳米级或微米级复合微粒。磁性复合微粒具有超顺磁性、 较大的比表面积、良好的生物相容性、丰富的表面功能基团及其他荧光、发 光等理化特性，因而被广泛应用于生物分子标记、生物分离、生物检测、靶向治疗等领域。利用磁性微粒分离mRNA的研究和应用也非常活跃，其原理为将 oligo(dT)偶联于磁粒上,基于mRNA的PolyA尾巴与之相配对的原理,使 mRNA结合于磁粒上，通过外加磁场将携带有mRNA的磁粒与体系中的鸯质 分离，最后将mRNA从磁粒上洗脱下来。Invitrogen、 Promega等国外公司已 有相应mRNA分离产品上市，但其价格昂贵，不利于一般实验室的普遍使用。组装型磁性复合微粒和核/壳型超顺磁性复合微粒的制备方法以及结构 组成已经在中国专利ZL 03153486.4和ZL 03124061.5分别进行了公开，但 其应用中主要包括分子固定以及相关检测的内容，未涉及到对mRNA进行 分离的方法。
发明内容
本发明利用金磁微粒作为反应和分离的固相载体，提供一种成本低廉、 简便、快捷的分离mRNA的方法。本发明的技术解决方案是本发明为一种利用金磁微粒分离mRNA的方 法，其特殊之处在于该方法包括以下步骤1) 链亲和素一金磁微粒的制备；1.1)取金磁微粒，以偶联缓冲液平衡1 3次，按20 50(Hig/ (mg磁 粒)的比例加入链亲和素，在20 4(TC的条件下充分混匀，反应5min 2h， 用清洗缓冲液清洗，除去未结合的链亲和素，加入保存缓冲液保存备用；2) 将生物素标记的oligo(dT)探针和链亲和素一金磁微粒混合，通过链 ，亲和素-生物素的结合，将生物素化的oligo(dT)探针固定于磁粒表面，作为 反应和分离的固相载体；2.1)取链亲和素一金磁微粒，以偶联缓冲液平衡1 3 欠，按0.5 6nmo1/ (mg磁粒)加入生物素标记的oligo(dT)探针，在20 4(TC的条件下充分混 匀，反应5min 2h，用清洗缓冲液清洗，除去未结合的探针；2.3)加入封闭剂在20 4(TC的条件下充分混匀，反应30 min 12 h， 封闭磁粒，然后用清洗缓冲液充分洗涤磁粒，除去未结合的封闭剂，加入保 存缓冲液保存备用；3) 将RNA溶于无核糖核酸酶(RNase)的水中，在50 70°C的条件 下放置3 15min，立即加入高盐溶液，使高盐终浓度达到0.1 2 M，混匀 后按10 1000 pg总RNA/ (mg磁粒)加入到用杂交缓冲液平衡的固定有 oligo(dT)探针的金磁微粒中，在20 40°C的条件下放置3 15 min，使 oligo(dT)探针和mRNApolyA发生特异性杂交，磁性分离，弃上清；
4) 加入清洗缓冲液清洗磁粒，除去杂质；5) 加入洗脱缓冲液，洗脱mRNA;上述步骤l.l)之后还包括有步骤1.2)测定链亲和素固定化前后在280 nm的OD值，计算链亲和素在金 磁微粒表面的偶联效率及固定化量。上述步骤2.1)、 2.3)之间还包括有步骤2.2)测定生物素标记oligo(dT)探针固定化前后在260nm的OD值，计 算生物素标记0ligo(dT)探针在链亲和素一金磁微粒表面的偶联效率及固定上述步骤3)之前需对总RNA进行质控实验，包括电泳检测及紫外检上述步骤5)之后还包括步骤6):对分离后的mRNA进行质控实验，...包 括电泳检测、紫外检测及反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。上述金磁微粒为核壳型金磁微粒或组装型金磁微粒。上述偶联缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液(0.005 M 1 M， pH7.0 9.0)， 碳酸盐缓冲液(0.005 M 1 M， pH9.0 11.0)，醋酸盐缓冲液(0.005 M l M, pH5.6)，柠檬酸盐缓冲液(0.005M 1 M，pH3.0 7.0)， TBS缓冲液(0.005 M 1 M， pH7.0 9.0)，STE缓冲液(0.1x 10x，pH7.0 9.0)，TE缓冲液(0.005 M l M, pH3.0 7.0)， PBS缓冲液(0.5x 10x , pH5.0 8.0)， SSC缓冲液 (0.1x 20x， pH7.0 9.0)， SSPE缓冲液(0,lx 20x， pH7.0 9.0);上述清洗缓冲液为上述偶联缓冲液； ，上述封闭剂为含1 10%牛血清白蛋白(BSA)，赖氨酸(Lys)，乙醇胺， 小牛血清，山羊血清等动物血清的一种或多种成分的上述偶联缓冲液；上述保存缓冲液为上述偶联缓冲液或加入防腐剂(如0.01 0.1%的叠氮 钠或0.01 0.1°/。的硫柳汞等)和保护剂(如0.05 1。/。BSA， 0.05 1%的动 物血清，蛋白酶抑制剂,核酸酶抑制剂等)的上述偶联缓冲液；上述杂交缓冲液为含0.005 M 0.5 M的Tris-HCl (pH7.0 9.0)和0.03 M 1 M的NaCl的缓冲液,或10x 20x的SSC缓冲液(pH7.0 9.0);上述高盐溶液为1 5 M的NaCl溶液；
' 上述洗脱缓冲液为0.001 M 0.1 M的TE缓冲液(pH7.0 8.0)或无核 糖核酸酶(RNase)的水。 上述步骤1)中，优选的偶联缓冲液是O.OlMTris-HCl (pH8.0)缓冲液； 优选的保存缓冲液是含0.0P/oNaN3， 1% BSA的2xSTE (pH8.0)缓冲液；优选的清洗缓冲液是2xSTE (pH8.0)缓冲液； 上述步骤2)中，优选的偶联缓冲液是2xSTE (pH8.0)缓冲液； , 优选的清洗缓冲液是2xSTE (pH8.0)缓冲液；优选的封闭剂为含3%的脱脂奶粉的0.01 MTris-HCl (pH8.0)缓冲液； 上述步骤3)中，优选的杂交缓冲液是含0.01M的Tris-HCl (pH8.5)和0.1M的NaCl 的缓冲液；优选的高盐溶液是3M的NaCl溶液； 上述步骤4)中，优选的清洗缓冲液是2xSTE (pH8.0)缓冲液； 上述步骤5)中，优选的洗脱缓冲液是DEPC (二乙基焦碳酸，用于灭活核糖核酸酶 、(RNase))处理水。上述步骤1.1)和2.1)中，优选的反应条件为在摇床中37。C, 180r/min的条件下反应10min; 上述步骤2.3)中，优选的反应条件为在摇床中37。C, 180r/min的条件下反应1 h; 上述步骤3)中，加入高盐溶液的优选的反应条件为将总RNA样品在65°C的条件下水 浴5min后立即加入高盐溶液，使高盐终浓度为0.3M。本发明利用金磁微粒作为分离mRNA的载体，同时利用生物素与亲和 素具有高度的特异亲和性进行mRNA的分离，因此本发明具有如下优点1)探针固定化操作简单方便，固定容量高，用较少金磁微粒即可完成
mRNA的分离，降低分离成本。本发明中采用的链亲和素一金磁微粒的制备 过程快速、简便，利用链亲和素和生物素的特异结合将oligo(dT)探针固定于 金磁微粒表面，使探针的固定化操作更为省时、省力，而且对探针的固定化 容量高，是已商品化的Dynabeads M-270 Streptavidin的6 7倍，用较少的 金磁微粒即可完成mRNA的分离，降低分离成本。2) 整个mRNA分离过程无需离心和沉淀，操作快速简捷，整个分^过 '程可在短时间内完成。3) 洗脱体积小，可得到高纯度、高浓度的mRNA，而且可根据后续实 验要求调整洗脱体积，分离的mRNA可直接应用于下游实验。
图1为本发明中的mRNA分离原理图；图2为本发明实施例1中金磁微粒固定链亲和素前后的紫外吸收曲线； 图3为本发明实施例2中链亲和素一金磁微粒固定生物素标记的寡核苷酸探针前后的紫外吸收曲线；图4为链亲和素一金磁微粒和Dynabeads M-270 Streptavidin磁性#粒'对生物素标记的寡核苷酸探针固定化量的比较；图5为本发明实施例3中经金磁微粒纯化获得的mRNA的电泳检测图； 图6为本发明实施例3中经金磁微粒纯化获得的mRNA的紫外检测图； 图7为本发明实施例3中经金磁微粒纯化获得的mRNA的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测图。
具体实施方式
参见图l，本发明的具体方法流程如下 1)链亲和素一金磁微粒的制备；1.1) 取1 mg金磁微粒，用0.01MTris-HCl (pH8.0)平衡两次，加入5(K) ^g链亲和素，反应体积500 nl，在摇床中37°C, 180r/min的条件下反应20 min，反应完毕，用2xSTE (pH8.0)缓冲液清洗三次；1.2) 紫外-可见分光光度计测定链亲和素固定化前后及清洗后上清液在 280nm的OD值，计算链亲和素在金磁微粒表面的偶联效率及固定化量，加 入1 ml含0.01。/。NaN3， 1% BSA的2xSTE (pH8.0)缓冲液，在4°C的条件
下保存备用；
2) 将生物素标记的oligo(dT)探针和链亲和素一金磁微粒混合，通i^链 亲和素一生物素的结合，将生物素化oligo(dT)探针固定于磁粒表面，作为反 应和分离的固相载体；
2.1) 取1 mg包被链亲和素的金磁微粒，以2xSTE (pH8.0)缓冲液平 衡三次，磁性分离后，加入3.5nmol生物素标记的oligo(dT)探针，在摇床中 37°C,180 r/min的条件下反应10 min;
2.2) 反应结束后，磁性分离，以2xSTE (pH8.0)缓冲液充分洗涤，测 定生物素标记的oligo(dT)探针在固定化前后以及清洗后上清液在260 nm的 OD值，计算生物素标记的oligo(dT)探针在金磁微粒表面的偶联效率及固定
2.3) 用含3%的脱脂奶粉的0.01M Tris-HCi (pH8.0)缓冲液在摇床中 '37°C， 180 r/min的条件下反应1 h封闭磁粒，然后用2xSTE (pH8.0)充分 洗涤磁粒三次，加入终浓度0.1XDEPC，在摇床中37。C、 180r/min的条 件下振荡lh后，在4X:的条件下保存备用。
3) 对RNA进行质控实验，包括电泳检测及紫外检测，将达到实验标准 的RNA用于以下操作。
以下步骤适用于500 ng偶连有oligo(dT)探针的链亲和素一金磁微粒从 100 pg总RNA中纯化mRNA的实验操作，可以按比例扩大或縮小纯化规模。
取500 pg金磁微粒于RNase-free (无核糖核酸酶)的离心管中，用含 0.01 M的Tris-HCl (pH8.5)和0.1 M的NaCl的缓冲液平衡2 3次后，悬 '浮于100 ^含0.01 M的Tris-HCl (pH8.5)和0.1 M的NaCl的缓冲液中；将 总RNA样品100 |ig溶于90 (il DEPC处理水中，65。C水浴后立即加入10 |il、 3 M的NaCl溶液，混匀，将处理后的总RNA溶液100 pl立即加入预处理的 金磁微粒溶液中，用移液器吹打均匀，室温反应5min，磁性分离，弃上清。
4) 向上步得到的金磁微粒中加入200pl2xSTE (pH8.0)缓冲液，用移 液器吹打均匀，磁性分离，弃上清。此步骤操作3次。
5) 向金磁微粒中加入100 ^的DEPC处理水或所需体积的DEPC处理 水，用移液器吹打均匀，磁性分离，上清即为纯化的mRNA。
6)对分离后的mRNA进行质控实验，包括电泳检测、紫外检测，及反 转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。
金磁微粒为核壳型金磁微粒或组装型金磁微粒。 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明 实施例1
本实施例为本发明中链亲和素在金磁微粒表面固定化的过程。
取1 mg金磁微粒，用0.01 MTris-HCl (pH8.0)平衡两次，加入200 pg 链亲和素，反应体积500 pl。在摇床中37°C， 180 r/min的条件下反应10 min， 反应完毕，用2xSTE (pH8.0)缓冲液洗三次，每次500 ^1。紫外-可见分光 '光度计测定链亲和素固定化前后及清洗后上清液在280 nm的OD值，计算 链亲和素在金磁微粒表面的偶联效率及固定化量。加入1 ml含0.01%NaN3， P/。BSA的2xSTE (pH8.0)缓冲液，4。C保存备用。
金磁微粒偶联链亲和素前后的紫外吸收曲线如图2所示，其中曲线1为 链亲和素溶液的紫外吸收曲线；曲线2为和金磁微粒结合后溶液的紫外吸收 曲线；曲线3为清洗溶液的紫外吸收曲线。图中结果表明，链亲和素溶液在 被固定化前在280nm处具有明显的光吸收，而固定化后及清洗后在280nm 处没有明显的光吸收,说明链亲和素几乎全部被固定在金磁微粒表面。
实施例2
' 本实施例为本发明中生物素标记的寡核苷酸探针在链亲和素一金磁微 粒表面固定化的过程。
取250 pg链亲和素一金磁微粒，以2xSTE缓冲液平衡三次，磁性分离， 加入150 pl生物素标记的寡核苷酸(溶于2xSTE中，含862.5 pmol寡核苷 酸)，在摇床中37。C， 120r/min的条件下反应10min，反应结束后，磁性分 离，以2xSTE缓冲液充分洗涤，测定固定化前后以及清洗后上清液在260 nm 的OD值，计算生物素标记寡核苷酸在金磁微粒表面的偶联效率及固定化量。
链亲和素一金磁微粒固定生物素标记的寡核苷酸探针前后的紫外吸收 曲线如图3所示，曲线1为生物素标记寡核苷酸溶液的紫外吸收曲线；曲线 '2为和链亲和素一金磁微粒结合后的剩余溶液的紫外吸收曲线；曲线3为清 洗溶液的紫外吸收曲线。图中结果表明，生物素标记寡核苷酸探针溶液在被
ii
固定化前在260nm处具有明显的光吸收，而固定化后及清洗后在260nrn处 没有明显的光吸收，说明生物素标记寡核苷酸探针几乎全部被固定在链亲和 素一金磁微粒表面；
链亲和素一金磁微粒和已商品化的Dynabeads M-270 Streptavidin磁性 微粒对生物素标记的寡核苷酸探针偶联量的比较结果如图4所示，其中区块 ,1为Dynabeads M-270 Streptavidin的偶联量，区块2为链亲和素一金磁微粒 的偶联量。图中结果表明，链亲和素一金磁微粒对生物素标记的寡核苷酸探 针的固定化容量是已商品化的Dynabeads M-270 Streptavidin磁性微粒的 6 7倍。
本实施例为本发明中偶连有oligo(dT)探针的链亲和素一金磁微粒纯化 mRNA的过程。
以下步骤适用于500 偶连有oligo(dT)探针的链亲和素一金磁微粒 (以下简称金磁微粒)从100 pg总RNA中纯化mRNA的实验操作，可以
.按比例扩大或縮小纯化规模。 1、金磁微粒的预处理
1.1将金磁微粒摇匀后，用移液器移取500 ^于RNase-free的离心管中， 将离心管置于磁性分离器中磁性分离2 min，在磁性分离器上用移液器移取 上清弃去；
1.2将200 pi含0.01 M的Tris-HCl (pH8.5)和0.1 M的NaCl的缓冲液 加入上步的金磁微粒中，轻摇重悬磁粒，磁性分离，弃上清，此步骤操作2
1.3加入100 pi含0.01 M的Tris-HCl (pH8.5)和0.1 M的NaCl的缓冲
液，轻摇重悬磁粒，备用； 2、 mRNA纯化
2.1总RNA样品溶于90 |nl的DEPC处理水中，放入65 。C水浴5 min; 2.2取出离心管，立即加入10pl的3M的NaCl溶液，混匀； _ 2.3将处理后的总RNA溶液100 pl立即加入步骤1.3预处理的金磁微粒 溶液中，用移液器吹打均匀，室温反应5min，磁性分离，弃上清。
实施例3
2.4向上步得到的金磁微粒中加入200 pl的2xSTE (pH8.0)缓冲液， 用移液器吹打均匀，磁性分离，弃上清，此步骤操作3次； . 2.5向金磁微粒中加入100 ^的DEPC处理水或所需体积的DEPC处理 水，用移液器吹打均匀，磁性分离，上清即为纯化的mRNA。
经金磁微粒纯化获得的mRNA经电泳检测的结果如图5所示，图中可 清楚的看到一抹被纯化的mRNA条带；
经金磁微粒纯化获得的mRNA的紫外检测结果如图6所示，图中结果 表明，被纯化mRNA在260nm处具有明显的光吸收，从100pg总RNA中 可纯化获得2 pg左右的mRNA;
经金磁微粒纯化获得的mRNA经RT-PCR检测的结果如图7所示，图中 结果表明，以纯化mRNA为摸板，经过RT-PCR， (3-actin基因被很好的扩增 出来，说明纯化的mRNA具有良好的完整性及反转录活性，可直接应用于 下游实验。
金磁微粒是指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面 包覆单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也指以磁性纳米粒子或 磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的 磁性复合微粒。所述磁性纳米粒子包括Fe304、 Y-Fe203等铁的氧化物粒子， 单质Fe、 Co、 Ni粒子，或由Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子；磁性 纳米粒子的聚集体是指经修饰后形成的Fe304、 Y - Fe203等铁的氧化物粒子 聚集体，经修饰后形成的单质Fe、 Co、 Ni粒子聚集体，或经修饰后形成的 .Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子聚集体。
权利要求
1、一种利用金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)链亲和素-金磁微粒的制备；1.1)取金磁微粒，以偶联缓冲液平衡1～3次，按20～500μg/(mg磁粒)的比例加入链亲和素，在20～40℃的条件下充分混匀，反应5min～2h，用清洗缓冲液清洗，除去未结合的链亲和素，加入保存缓冲液保存备用；2)将生物素标记的oligo(dT)探针和链亲和素-金磁微粒混合，通过链亲和素-生物素的结合，将生物素化的oligo(dT)探针固定于磁粒表面，作为反应和分离的固相载体；2.1)取链亲和素-金磁微粒，以偶联缓冲液平衡1～3次，按0.5～6nmol/(mg磁粒)加入生物素标记的oligo(dT)探针，在20～40℃的条件下充分混匀，反应5min～2h，用清洗缓冲液清洗，除去未结合的oligo(dT)探针；2.3)加入封闭剂在20～40℃的条件下充分混匀，反应30min～12h，封闭磁粒，然后用清洗缓冲液充分洗涤磁粒，除去未结合的封闭剂，加入保存缓冲液保存备用；3)将RNA溶于无核糖核酸酶的水中，在50～70℃的条件下放置3～15min，立即加入高盐溶液，使盐终浓度达到0.1～2M，混匀后按10～1000μg总RNA/(mg磁粒)加入到用杂交缓冲液平衡的固定有oligo(dT)探针的金磁微粒中，在20～40℃的条件下放置3～15min，使oligo(dT)探针和mRNA polyA发生特异性杂交，磁性分离，弃上清；4)加入清洗缓冲液清洗磁粒，除去杂质；5)加入洗脱缓冲液，洗脱mRNA。
2、 根据权利要求l所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于 所述步骤l.l)之后还包括有步骤1.2) 测定链亲和素固定化前后在280 nm的OD值，计算链亲和素在金 !^微粒表面的偶联效率及固定化量。
3、 根据权利要求1所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于 所述步骤2.1)、 2.3)之间还包括有步骤2.2)测定生物素标记oligo(dT)探针固定化前后在260nm的OD值，计 算生物素标记oligo(dT)探针在金磁微粒表面的偶联效率及固定化量。
4、 根据权利要求1所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于 所述步骤3)之前需对总RNA进行质控实验，包括电泳检测及紫外检测。
5、 根据权利要求l所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于所 述步骤5)之后还包括步骤6):对分离后的mRNA进行质控实验，包括电泳 检测、紫外检测及反转录聚合酶链式反应。
6、 根据权利要求1至5任一权利要求所述的金磁微粒分离mRNA的方 法，其特征在于所述金磁微粒为核壳型金磁微粒或组装型金磁微粒。
7、 根据权利要求6所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于-所述偶联缓冲液可以是0.005 M 1 M， pH7.0 9.0的Tris-HCl缓冲液，0.005 M 1M， pH9.0 11.0的碳酸盐缓冲液，0.005 M 1M， pH5.6的醋酸盐缓 冲液，0.005 M 1 M，pH3.0 7.0的柠檬酸盐缓冲液，0.005 M 1 M，pH7.0 9.0的TBS缓冲液，0.1x 10x， pH7.0 9.0的STE缓冲液，0.005 M 1M， pH3.0 7.0的TE缓冲液，0.5x 10x ， pH5.0 8.0的PBS缓冲液，0.1x 20x, pH7.0 9.0的SSC缓冲液，0.1x 20x， pH7.0 9.0的SSPE缓冲液;所述清洗缓冲液为上述偶联缓冲液；所述封闭剂为含1 10%牛血清白蛋白，赖氨酸，乙醇胺，小牛血清，-山羊血清等动物血清的一种或多种成分的上述偶联缓冲液；所述保存缓冲液为上述偶联缓冲液或加入防腐剂0.01 0.1%的叠氮钠 或0.01 0.1°/。的硫柳汞和保护剂0.05 1% BSA， 0.05 1%的动物血清，蛋 白酶抑制剂，核糖核酸酶抑制剂的上述偶联缓冲液；所述杂交缓冲液为含0.005 M 0.5 M、 pH7.0 9.0的Tris-HCl和0.03 M 1 M的NaCl缓冲液或10x 20x， pH7.0 9.0的SSC缓冲液；所述高盐 溶液为1 5M的NaCl溶液；所述洗脱缓冲液为0.001 M 0.1 M， pH7.0 8.0的TE缓冲液或无核糖 核酸酶的水。 -
8、 根据权利要求6所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于 所述步骤1)中，优选的偶联缓冲液是0.01 M， pH8.0的Tris-HCl缓冲液； 优选的保存缓冲液是含0.01。/。NaN3， 1Q/。BSA的pH8.0的2xSTE缓冲液；优选的清洗缓冲液是pH8.0的2xSTE缓冲液； 所述步骤2)中，优选的偶联缓冲液是pH8.0的2xSTE缓冲液； 优选的清洗缓冲液是pH8.0的2xSTE缓冲液；优选的封闭剂为含3%的脱脂奶粉的pH8.0的0.01 MTris-HCl缓冲液； 所述步骤3)中，优选的杂交缓冲液是含O.Ol M、 pH8.0的Tris-HCl和0.1 M的NaCl缓冲液；优选的高盐溶液是3M的JSfaCl溶液； 所述步骤4)中，优选的清洗缓冲液是pH8.0的2xSTE缓冲液； 所述步骤5)中，优选的洗脱缓冲液是DEPC处理水。
9、根据权利要求6所述的金磁微粒分离mRNA的方法，其特征在于 所述步骤1.1)和2.1)中，优选的反应条件为在摇床中37°C， 180r/min反应10min; 所述步骤2.3)中，优选的反应条件为在摇床中37。C，180r/min反应lh; 所述步骤3)中，加入高盐溶液的优选的反应条件为将总RNA样品在65°C的条件下水 浴5min后立即加入高盐溶液，使高盐终浓度为0.3M。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种利用金磁微粒分离mRNA的方法。其技术解决方案为该方法包括以下步骤1)链亲和素-金磁微粒的制备；2)将生物素标记的oligo(dT)探针和链亲和素-金磁微粒混合，通过链亲和素-生物素的结合，将生物素化的oligo(dT)探针固定于磁粒表面，作为反应和分离的固相载体；3)使oligo(dT)探针和mRNA polyA发生特异性杂交，磁性分离，弃上清；4)加入清洗缓冲液清洗磁粒，除去杂质；5)加入洗脱缓冲液，洗脱mRNA。本发明具有成本低廉、简便、分离快捷的优点。
文档编号C12N15/10GK101165183SQ20061010475
公开日2008年4月23日 申请日期2006年10月19日 优先权日2006年10月19日
发明者桉 于, 崔亚丽, 张战凤, 超 陈 申请人:陕西西大北美基因股份有限公司