专利名称：一种s－腺苷甲硫氨酸生产菌株的构建及大规模发酵的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术工程领域，涉及一种新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶及其应用。
背景技术：
S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl-L-Methionine)，常用缩略为SAM或AdoMet。国外医药商品名有S-Amet(Castejon厂，西班牙)，Samyr(Bioresearch，意大利)。分子式C15H22N6O5S。SAM在1953年为Cantoni所发现。不论是原核细胞还是真核细胞，它都是极为重要的中间代谢物质，在体内主要起转甲基作用，转氨丙基作用以及转硫基作用。
早在70年代末，欧洲已在临床上应用S-腺苷甲硫氨酸，最初作为治疗关节炎的消炎止痛药，后被应用为抗抑郁症药物以及治疗各种肝病。因此早在上世纪八十年代，S-腺苷甲硫氨酸的药用价值就在欧洲得到广泛的承认，1999年进入美国市场后，销售额很快达到近10亿美元。目前中国没有同类产品生产，仅靠进口。随着人们的生活质量的提高，健康概念的更新，预测对S-腺苷甲硫氨酸的需求将会越来越多。
S-腺苷甲硫氨酸的制备方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法3种。化学合成法采用S-腺苷同型半胱氨酸和甲基供体(CH3I)合成，S-腺苷甲硫氨酸有(+)和(-)两种构型，只有(-)构型才有生物活性，但合成产物中含有少量(+)型SAM，且难以分离。
传统的发酵法采用在培养基中添加L-甲硫氨酸，用酵母发酵生产(-)型S-腺苷甲硫氨酸，是上世纪60年代至80年代生产S-腺苷甲硫氨酸的主要方法。Schlenk等发现Candida utilis，Saccharomyces cerevisiae等几种普通酵母，在相对大量的L-甲硫氨酸存在条件下，酵母细胞无论生长、不生长都可积累S-腺苷甲硫氨酸。Shiozaki等从多种微生物中筛选得到一株Saccharomycesake，培养物可积累S-腺苷甲硫氨酸。该菌在10L发酵罐中培养7天后的SAM产量较高。但以L-甲硫氨酸计算，其生产SAM的最大转化率只有20％左右，甚至更低。
酶促转化法与化学合成法、发酵法相比，具有终产物积累量高、分离提纯容易、反应周期短以及无污染等优点，因而是较为有效的工业化生产方法。酶转化法主要利用S-腺苷甲硫氨酸合成酶，催化底物L-甲硫氨酸和ATP生成(-)型S-腺苷甲硫氨酸，且S-腺苷甲硫氨酸合成酶有三磷酸酶活性，使三磷酸分解为焦磷酸和磷酸，酶促反应如下
S-腺苷甲硫氨酸合成酶广泛存在于动、植物和微生物体内。Cantoli首次用从大鼠肝脏中提取出来的S-腺苷甲硫氨酸合成酶，催化底物L-甲硫氨酸和ATP合成出S-腺苷甲硫氨酸。随后又有人从大肠杆菌和酵母中分离S-腺苷甲硫氨酸合成酶并用于S-腺苷甲硫氨酸制备。但是S-腺苷甲硫氨酸合成酶在动、植物和微生物体内含量少、酶活不高，且分离纯化困难，例如400g酵母干细胞只能分离纯化得到8U S-腺苷甲硫氨酸合成酶，比活力为0.05U/mg。因此，用酶促转化法大规模制备S-腺苷甲硫氨酸受到S-腺苷甲硫氨酸合成酶活力和酶量的限制。
利用基因工程手段，将具有高酶活的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因转入适合的表达系统中，构建具有S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因工程菌，是未来生产S-腺苷甲硫氨酸的主要方向。利用重组菌来生产S-腺苷甲硫氨酸主要有两种方式，一种是直接利用重组菌来发酵生产SAM。还有一种是提取S-腺苷甲硫氨酸合成酶，在体外用酶促法合成S-腺苷甲硫氨酸。后一种方法最大的优点在于分离纯化简单，污染少，但由于外源添加的ATP价格较高，使得成本上升。所以从工业化的角度来看，前一种方法更适合规模化生产。
国外从90年代中期就开始了重组基因工程菌表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶的研究。Pajares构建了表达大鼠肝脏S-腺苷甲硫氨酸合成酶的重组大肠杆菌。他们将一段1.2Kb的编码大鼠肝脏S-腺苷甲硫氨酸合成酶的cDNA克隆到pSSRL，插入到含T7启动子的T7-7表达载体中，转入宿主菌E.coli BL21(DE3)。IPTG诱导3h后，菌体内的S-腺苷甲硫氨酸产量比E.coli BL21(DE3)本身的产量有所提高，然而还是不能达到生产所需的水平。
近年来，袁中一等(专利号CN 1357630A，CN1385537A)分别将酿酒酵母来源的sam2基因分别克隆到pPIC3.5K和pGAPZαA，转化毕赤酵母GS115，优化后SAM的产量分别为1.58和2.49g/L。
然而，本领域还需要进一步提高S-腺苷甲硫氨酸合成酶的活性以及S-腺苷甲硫氨酸合成能力，以期大幅度提高S-腺苷甲硫氨酸的产量，推进S-腺苷甲硫氨酸大规模工业化生产进程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶及其应用。
在本发明的第一方面，提高一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白，其酶活性超过25U/mg(如25-40U/mg)，以37℃下反应60分钟催化形成1μmol S-腺苷甲硫氨酸所需要的酶量为1U来计算。
在本发明的另一优选例中，所述蛋白在宿主细胞中的L-甲硫氨酸至S-腺苷甲硫氨酸的转化率以L-甲硫氨酸计达到或超过35％(如35-60％，更优选的如40-50％)。
在本发明的另一优选例中，含有携带所述蛋白编码基因的载体的菌株、或基因组中整合有该蛋白编码基因的菌株在外源添加L-甲硫氨酸的条件下S-腺苷甲硫氨酸的产量超过9g/L(如9-20g/L)。
在本发明的另一优选例中，所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白的氨基酸序列对应于SEQ ID NO2氨基酸序列的第337位由I突变为V。
在本发明的另一优选例中，还包括所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白的氨基酸序列对应于SEQ ID NO2氨基酸序列的第5位由K突变为E。
在本发明的另一优选例中，所述的蛋白是(a)具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性超过25U/mg的由(a)衍生的蛋白。
在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组(i)编码所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白的多核苷酸；或(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
在本发明的另一优选例中，所述的多核苷酸通过DNA Shuffling技术得到。
在本发明的另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽。
在本发明的另一优选例中，该多核苷酸具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
在本发明的另一优选例中，所述的载体为甲醇营养型重组酵母表达载体。
在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。
在本发明的另一优选例中，所述的宿主细胞中含有多拷贝的所述的多核苷酸。
在本发明的另一优选例中，所述的宿主细胞表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶，和/或S-腺苷甲硫氨酸。
在本发明的另一优选例中，所述的宿主细胞为甲醇营养型重组酵母。
优选的，所述的宿主细胞选自重组毕赤酵母(Pichia)、重组汉逊酵母(Hansenula)、重组假丝酵母(Candida)或重组球拟酵母(Torulopsis)。更优选的，所述的宿主细胞为重组毕赤酵母(Pichia)。
在本发明的第五方面，提供一种生产S-腺苷甲硫氨酸合成酶的方法，包括步骤(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离S-腺苷甲硫氨酸酶。
在本发明的第六方面，提供一种生产S-腺苷甲硫氨酸的方法，所述的方法包括步骤(S1)在S-腺苷甲硫氨酸合成酶存在下，使L-甲硫氨酸与ATP反应，获得反应产物；(S2)从反应产物中分离出S-腺苷甲硫氨酸。
在本发明的另一优选例中，在步骤(S1)中，所述的反应在细胞内进行，即在L-甲硫氨酸存在下培养所述的宿主细胞，使之生产S-腺苷甲硫氨酸。
在本发明的另一优选例中，所述的方法包括步骤将所述的宿主细胞加入发酵培养基中，控制培养基中甘油OD600＝120-600，加入甲醇2-6g/L/小时，加入L-甲硫氨酸0.5-2g/L/天，在3-6天(更优选的，为4天)后收集S-腺苷甲硫氨酸。
在本发明的另一优选例中，所述的培养基选自BSM培养液或BMMY培养液。
在本发明的另一优选例中，培养温度为25-35℃。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1所显示的是从三种不同来源微生物中利用PCR方法从总DNA中扩增编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的结果。泳道1代表DL15000；泳道2代表E.colisam2；泳道3代表Streptomyces spectabilis；泳道4代表Saccharomycescerevisiae sam2。
图2显示的是表达质粒pPIC3.5K-SAMrm的质粒图谱。
图3所显示的是重组毕赤酵母表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶的SDS-PAGE。其中，泳道1Marker；泳道2未诱导；泳道3诱导8hr；泳道4诱导16hr；泳道5诱导24hr；泳道6诱导32hr；泳道7诱导40hr；泳道8诱导48hr；泳道9诱导56hr。
图4所显示的是利用HPLC测定S-腺苷甲硫氨酸含量的图谱(保留时间26.944min)。其中，图4A为SAM标品0.6g/L峰面积3800；图4B为重组菌发酵样品(稀释4倍)10.5g/L峰面积16700；图4C为GS115发酵样品0.11g/L峰面积710。
具体实施例方式
本发明人经过长期的研究，获得了一条能够使菌株在外源添加L-甲硫氨酸的条件下大量生产S-腺苷甲硫氨酸的S-腺苷甲硫氨酸合成酶，所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的酶活超过25U/mg培养基。可使菌株的S-腺苷甲硫氨酸的产量超过9g/L，并且L-甲硫氨酸至S-腺苷甲硫氨酸的转化率达到或超过35％。基于此完成了本发明。
如本文所用，所述的“S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性”是以酶的活力单位来定义的。酶的一个活力单位(1U)定义为37℃下反应60分钟催化形成1μmol SAM所需要的酶量。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白或多肽”是指S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白”指具有S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白活性的SEQ ID NO4序列的多肽。该术语还包括具有与S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白相同功能的、SEQ ID NO4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白的活性片段和活性衍生物。最好的，在这些SEQ ID NO4的变异形式中，第5位的氨基酸为E或第337位氨基酸为V。更优选的，这些SEQ ID NO4的变异形式同时满足第5位的氨基酸为E、第337位氨基酸为V。
多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白保守性变异多肽”指与SEQ IDNO4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个(如1个、2个或3个)氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明还提供了编码本发明S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO4的蛋白质，但与SEQ ID NO3所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO4的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％(如85％，90％，95％，99％)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQID NO4所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白的多聚核苷酸。
本发明的S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
作为本发明的一个实例，提供了一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，其序列如SEQ ID NO3所述，其编码的蛋白如SEQ ID NO4所示。
本发明人根据ncbi(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的3种不同来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶E.coli sam2(Genbank登录号AE000377)，Streptomyces spectabilis(Genbank登录号AF117274)，Saccharomycescerevisiae sam2(Genbank登录号M23368))的编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶的DNA序列设计了引物，从其总DNA中扩增出所需的编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶的DNA，通过DNA Shuffling技术得到一系列重组的编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因，并克隆到表达载体上，构建了重组S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表达质粒。将所述表达质粒线性化以后，电转化毕赤酵母GS115，通过His+以及G418筛选高产S-腺苷甲硫氨酸的重组菌株。并从高产菌株中克隆出SAM合成酶基因进行测序，验证，获得具有高的酶活性的且能促使菌株高产S-腺苷甲硫氨酸的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。
DNA Shuffling技术是对一组基因群体(进化上相关的DNA序列或曾筛选出的性能改进序列)进行重组创造新基因的方法。因为该法在DNA片段组装过程中也可能引入点突变，所以它对从单一序列指导进化蛋白质也是有效的。DNAShuffling技术产生的多样性文库，可以有效积累有益突变，排除有害突变和中性突变，同时也可实现目的蛋白多种特性的共进化。正是由于该技术包括了DNA重新组装的过程，使它与以往的诱变技术有了质的不同。
在本发明的一个实例中，使携带所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的高产菌株在5L发酵罐中进行发酵实验，S-腺苷甲硫氨酸的产量在9g/L以上(其它S-腺苷甲硫氨酸产量多在5g/L左右)，L-甲硫氨酸对S-腺苷甲硫氨酸的转化率可以达到或超过35％，远远超出现有的水平(约20％)。
在本发明的一个优选的实例中，利用广泛使用的甲醇营养型重组酵母表达系统，构建含有本发明的重组S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的甲醇营养型重组酵母，并通过外源添加底物L-甲硫氨酸来使该重组菌高效生产S-腺苷甲硫氨酸，解决目前S-腺苷甲硫氨酸生产存在的产量低，成本高，底物转化率低的问题。
当通过菌株表达生产S-腺苷甲硫氨酸时，可将所述的S-腺苷甲硫氨酸基因导入到任何一种可通过外源加入L-甲硫氨酸来生产S-腺苷甲硫氨酸的菌株中。优选的，所述的菌株为采用醇氧化酶启动子PAOX1、PAOX2甲醇营养型酵母。甲醇营养型重组酵母是一种常用的表达系统，具有产量高，成本低廉等特点。
更优选的，所述的菌株如毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、假丝酵母(Candida)或球拟酵母(Torulopsis)等，该重组酵母构建时可采用不同的表达载体(如pPIC3.5K等)，而且载体在酵母内可有不同存在方式(如附加型、整合型等)，该菌可具备不同的表型(Mut+，Muts等)。
作为本发明的另一个实例，通过基因工程手段生产S-腺苷甲硫氨酸合成酶，比如利用任何适宜的基因工程菌生产所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶，分离所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。将所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶用于体外酶促法生产S-腺苷甲硫氨酸。由于本发明的S-腺苷甲硫氨酸合成酶具有很高的酶活性，使得酶促法生产S-腺苷甲硫氨酸的规模大大增加，效率大大提高。
本发明的主要优点为首次获得一条能够使菌株在外源添加L-甲硫氨酸的条件下大量生产S-腺苷甲硫氨酸的腺苷甲硫氨酸合成酶，所述的-腺苷甲硫氨酸合成酶的酶活超过25U/mg，并且L-甲硫氨酸至S-腺苷甲硫氨酸的转化率达到或超过35％。
本发明的S-腺苷甲硫氨酸生产方法与已有的其他方式相比，(1)产量高；(2)原料成本低；(3)工艺简便。因此大幅度降低了生产成本，且更适合于工业化大规模生产S-腺苷甲硫氨酸。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1携带重组S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表达质粒的构建采用常规的方法，分别提取E.coli JM109(购自invitrogen公司)，Streptomyces spectabilis(购自invitrogen 公司)，Saccharomycescerevisiae(购自invitrogen公司)的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板进行PCR，所设计的引物如表2。
表2
PCR得到长约1.2Kb的DNA序列，电泳结果见图1所示。经苯酚-氯仿抽提后用乙醇沉淀回收后，克隆入pGM-T载体(购自天为时代公司)的多克隆位点内(连接条件参照该产品说明书)，构建载体pGM-T-SAMsp1，pGM-T-SAMsp2，pGM-T-SAMsp3。
用EcoRI/NotI双酶切下上述pGM-T-SAMsp1、pGM-T-SAMsp2、pGM-T-SAMsp3上的编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因片断，用DNase I将其降解为小片段，进行自身引物PCR(DNA Shuffling)，从自身引物PCR产物中挑选1.2Kb左右的片段，再次克隆到pGM-T载体上，得到载体pGM-T-SAMrm。
然后，用EcoR I/Not I双酶切pGM-T-SAMrm载体，将pGM-T-SAMrm载体上的重组S-腺苷甲硫氨酸基因克隆到毕赤酵母表达质粒pPic3.5K的EcoRI和Not I位点之间，获得重组质粒pPIC3.5K-SAMrm。其中，重组的pPic3.5K的质粒图谱见图2所示。
实施例2基因工程重组毕赤酵母的构建将所构建的重组质粒pPIC3.5K-SAMrm用Bgl II酶进行线性化，经苯酚-氯仿抽提后用乙醇沉淀回收线性化质粒片断。
纯化回收后的线性化质粒片断按照Invitrogen公司的Multi-copy PichiaExpression Kit说明书上的电转化方法电转毕赤酵母GS115(购自invitrogen公司)，电转的条件按照Bio-RAD公司的MicroPulser电转仪所预设的Pichiapastors程序进行。
电转得到的菌液涂布在MD(1.34％YNB，4×10-5生物素(biotin)，2％葡萄糖)平板上于30℃培养3-4天，筛选基因型His+的重组子，得到的重组子再按照Invitrogen公司的Multi-copy Pichia Expression Kit说明书上的G418筛选方法筛选得到多拷贝(如1-3拷贝)基因插入的重组子GS115/pPIC3.5K-SAMrm，并将不含外源基因的pPIC3.5K质粒按照相同的方法转入GS115，构建对照菌GS115/pPIC3.5K。
实施例3S-腺苷甲硫氨酸高效生产菌的筛选和验证将能抗1.0-1.5mg/ml G418的基因工程重组毕赤酵母单克隆接入含25mlBMGY培养基(1％酵母抽提物(Yeast extract)，2％蛋白胨(peptone)，0.2M PBSpH＝6.0，1.34％YNB，4×10-5生物素(biotin)，1％甘油)的250ml摇瓶进行发酵，培养温度30℃，转速220rpm。
发酵24小时以后5000rpm离心收集菌体，按照1∶1的比例接入含25ml BMMY培养基(1％酵母抽提物(Yeast extract)，2％蛋白胨(peptone)，0.2M PBS pH＝6.0，1.34％YNB，4*10-5生物素(biotin)，0.5％甲醇)的250ml摇瓶中进行诱导表达，并每天补入0.5-1g/L的L-甲硫氨酸以及0.6-1.2％的甲醇。诱导4天以后离心收集菌体，弃去上清，加入等体积的三氯乙酸于4℃抽提胞内的S-腺苷甲硫氨酸。抽提液离心去除沉淀以后用HPLC测定S-腺苷甲硫氨酸的含量，从中筛选获得高产菌株，并通过SDS-PAGE检验S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表达，结果见图3所示。
HPLC条件HPLC仪Agilent 1100series；分离柱Hypersil SCX 5μm 25cm；流动相0.5mol/L甲酸铵(用甲酸调至pH4.0)；检测波长254nm；保留时间大约27min。HPLC谱图如图4所示。
从中筛选获得一株S-腺苷甲硫氨酸产量达到1.4g/L(摇瓶产量，按纯SAM含量算)的菌株，利用常规的PCR技术克隆出了SAM合成酶基因，通过测序得到了新基因的序列。该基因与来源于Saccharomyces cerevisiae的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因相比，有3个位点发生了突变，即第9位G→A，第13位A→G，第1009位A→G，由此造成了编码的蛋白质有2处发生突变，即第5位K→E，第337位I→V。
来源于Saccharomyces cerevisiae的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列如SEQ ID NO1所示atgtccaaga gcaaaacttt cttatttacc tctgaatccg tcggtgaagg tcacccagac60aagatttgtg accaagtttc tgatgctatt ttggacgctt gtttagaaca agatccattc120tccaaggttg cctgtgaaac agctgccaaa actggtatga ttatggtttt cggtgaaatt180accaccaaag ctagacttga ctaccaacaa atagtaagag ataccatcaa gaagattggt240tatgacgatt ctgccaaggg tttcgactac aagacatgta atgttttagt agctatcgaa300caacaatctc cagatatcgc tcaaggtctg cactatgaaa agagcttaga agacttaggt360gctggtgacc aaggtataat gtttggttac gctacagacg aaactccaga agggttacca420ttgaccattc ttttggctca caaattgaac atggctatgg cagatgctag aagagatggt480tctctcccat ggttgagacc agacacaaag actcaagtca ctgtcgaata cgaagacgac540aatggtagat gggttccaaa gaggatagat accgttgtta tttctgctca acatgctgat600gaaatttcca ccgctgactt gagaactcaa cttcaaaaag atattgttga aaaggtcata660ccaaaggata tgttagacga aaataccaaa tatttcatcc aaccatccgg tagattcgtc720atcggtggtc ctcaaggtga cgctggtttg accggtagaa agattattgt cgacgcttac780ggtggtgcct catccgtcgg tggtggtgcc ttctccggta aggactattc caaggtcgat840cgttccgctg cttacgctgc tagatgggtt gccaagtctc tagttgccgc tggtttgtgt900aagagagtcc aagtccaatt ttcatatgct attggtattg ctgaaccatt gtctttacat960gtggacacct atggtacagc tacaaaatca gatgacgaaa tcattgaaat tattaagaag1020
aacttcgact tgagaccagg tgtgttagta aaggaattag atttggctag accaatttac1080ttaccaaccg cttcttatgg tcacttcact aatcaagagt actcatggga aaaaccaaag1140aaattggaat tt1152蛋白序列(SEQ ID NO2)MSKSKTFLFT SESVGEGHPD KICDQVSDAI LDACLEQDPF SKVACETAAK TGMIMVFGEI60TTKARLDYQQ IVRDTIKKIG YDDSAKGFDY KTCNVLVAIE QQSPDIAQGL HYEKSLEDLG120AGDQGIMFGY ATDETPEGLP LTILLAHKLN MAMADARRDG SLPWLRPDTK TQVTVEYEDD180NGRWVPKRID TVVISAQHAD EISTADLRTQ LQKDIVEKVI PKDMLDENTK YFIQPSGRFV240IGGPQGDAGL TGRKIIVDAY GGASSVGGGA FSGKDYSKVD RSAAYAARWV AKSLVAAGLC300KRVQVQFSYA IGIAEPLSLH VDTYGTATKS DDEIIEIIKK NFDLRPGVLV KELDLARPIY360LPTASYGHFT NQEYSWEKPK KLEF 384本发明的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列如SEQ ID NO3所示atgtccaaaa gcgaaacttt cttatttacc tctgaatccg tcggtgaagg tcacccagac60aagatttgtg accaagtttc tgatgctatt ttggacgctt gtttagaaca agatccattc120tccaaggttg cctgtgaaac agctgccaaa actggtatga ttatggtttt cggtgaaatt180accaccaaag ctagacttga ctaccaacaa atagtaagag ataccatcaa gaagattggt240tatgacgatt ctgccaaggg tttcgactac aagacatgta atgttttagt agctatcgaa300caacaatctc cagatatcgc tcaaggtctg cactatgaaa agagcttaga agacttaggt360gctggtgacc aaggtataat gtttggttac gctacagacg aaactccaga agggttacca420ttgaccattc ttttggctca caaattgaac atggctatgg cagatgctag aagagatggt480tctctcccat ggttgagacc agacacaaag actcaagtca ctgtcgaata cgaagacgac540aatggtagat gggttccaaa gaggatagat accgttgtta tttctgctca acatgctgat600gaaatttcca ccgctgactt gagaactcaa cttcaaaaag atattgttga aaaggtcata660ccaaaggata tgttagacga aaataccaaa tatttcatcc aaccatccgg tagattcgtc720atcggtggtc ctcaaggtga cgctggtttg accggtagaa agattattgt cgacgcttac780ggtggtgcct catccgtcgg tggtggtgcc ttctccggta aggactattc caaggtcgat840cgttccgctg cttacgctgc tagatgggtt gccaagtctc tagttgccgc tggtttgtgt900aagagagtcc aagtccaatt ttcatatgct attggtattg ctgaaccatt gtctttacat960gtggacacct atggtacagc tacaaaatca gatgacgaaa tcattgaagt tattaagaag1020aacttcgact tgagaccagg tgtgttagta aaggaattag atttggctag accaatttac1080ttaccaaccg cttcttatgg tcacttcact aatcaagagt actcatggga aaaaccaaag1140aaattggaat tt1152蛋白序列(SEQ ID NO4)MSKSETFLFT SESVGEGHPD KICDQVSDAI LDACLEQDPF SKVACETAAK TGMIMVFGEI60TTKARLDYQQ IVRDTIKKIG YDDSAKGFDY KTCNVLVAIE QQSPDIAQGL HYEKSLEDLG120AGDQGIMFGY ATDETPEGLP LTILLAHKLN MAMADARRDG SLPWLRPDTK TQVTVEYEDD180NGRWVPKRID TVVISAQHAD EISTADLRTQ LQKDIVEKVI PKDMLDENTK YFIQPSGRFV240IGGPQGDAGL TGRKIIVDAY GGASSVGGGA FSGKDYSKVD RSAAYAARWV AKSLVAAGLC300KRVQVQFSYA IGIAEPLSLH VDTYGTATKS DDEIIEVIKK NFDLRPGVLV KELDLARPIY360LPTASYGHFT NQEYSWEKPK KLEF 384实验证明，携带所述新基因的高产菌株的S-腺苷甲硫氨酸产量比利用3种出发S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因构建的生产菌株高出2-8倍。
实施例4酶活的测定将实施例3获得的S-腺苷甲硫氨酸合成酶进行酶活测定，并与其它S-腺苷甲硫氨酸合成酶进行比较。
1.细胞破碎将发酵液离心(3000×10min，4℃)收集菌体，并用裂解缓冲液(含有50mMpH7.4的磷酸钾缓冲液，5％甘油((v/v)，5mM的琉基乙醇和I mm的EDTA)清洗一次。加入菌体一倍体积的酸洗玻璃珠(直径0.1mm)和4倍体积的裂解缓冲液，用超声波(在最大输出，50％的工作周期)于0℃处理10分钟，裂解细胞。玻璃珠和细胞残片4℃下10000g离心15分钟除去。粗抽提液经12000g×30min离心后，上清液即为无细胞酶液。
2.反应体系的建立设定1mL的反应混合物，其中含有20mM的L-甲硫氨酸，20mM的ATP，8mM的还原型谷胱甘肽(GSH)，20mM的MgCL2，100mM的KCL，150mM的pH7.4的Tris-HCL和0.5mL的细胞裂解液，在37℃温育60分钟。不加L-甲硫氨酸的反应作为空白对照。反应结束后，加入0.5mL的20％高氯酸溶液停止反应。离心，除去沉淀，所得的上清通过HPLC分析SAM的含量。酶的一个活力单位为37℃下反应60分钟催化形成1μmol SAM所需要的酶量。
结果发现，本发明的高产菌株的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的活力达到了28.45U/mg，而3种出发S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因构建的生产菌株的活力分别为E.coli sam210.31U/mg；Streptomyces spectabilis sam28.64U/mg；Saccharomyces cerevisiae sam220.24U/mg。
因此可见，本发明构建的高产菌株比利用3种出发S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因构建的生产菌株的S-腺苷甲硫氨酸合成酶活力有显著提高，比Saccharomyces cerevisiae sam2的酶活力还提高了40％多。
实施例5大规模发酵生产1.采用GS115菌株的发酵将实施例3中所得的高产重组酵母菌株按5％的接种量接入含2L BSM(含有0.93g/L CaSO4，18.2g/L K2SO4，4％甘油(glycerol)，4.13g/L KOH，26.7ml/L85％H3PO4，14.9g/L MgSO4·7H2O，12ml/L PTM1，2ml泡敌)培养基的5L罐中进行补料分批高密度发酵，首先等基础料中甘油耗尽后开始流加甘油至OD600＝120-600，然后甲醇诱导，补率2-6g/L/hr，并每天补加0.5-2g/L L-甲硫氨酸。
诱导4天以后，经测定，S-腺苷甲硫氨酸的产量达9g/L以上，L-甲硫氨酸对S-腺苷甲硫氨酸转化率为40％。
2.采用SMD1163菌株的发酵采用前述相同的方法，本发明人将前述S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因导入SMD1163酵母(毕赤酵母的一种，蛋白酶缺陷型；购自invitrogen公司)中。
结果，获得的菌株的S-腺苷甲硫氨酸产量达到9.54g/L，L-甲硫氨酸对S-腺苷甲硫氨酸转化率达35％。
并且，在采用SMD1163菌株的发酵的前体下，本发明人采用如实施例4所述的酶活测定方法测定了S-腺苷甲硫氨酸合成酶的酶活，并与其它S-腺苷甲硫氨酸合成酶进行比较。
结果发现，本发明的高产菌株的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的活力达到了27.20U/mg，显著高于3种出发S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因构建的生产菌株的活力。
因此可见，本发明构建的高产菌株比利用3种出发S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因构建的生产菌株的S-腺苷甲硫氨酸合成酶活力有显著提高。
实施例6本发明的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的变异体1.变异体1此外，在如实施例3所述的筛选中，本发明人还获得了一株S-腺苷甲硫氨酸产量很高的菌株，利用常规的PCR技术克隆出了SAM合成酶基因，通过测序得到了另一条新基因的序列。该基因与SEQ ID NO1所示的序列相比，在第1009位发生A→G突变，由此造成了其编码的蛋白质有1处发生突变，即第337位I→V。
将该基因在GS115中表达，比活为23.17U/mg，5L罐上产量9.21g/L。
2.变异体2本发明人将实施例3获得的新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SEQ ID NO3)进行了定点突变，导致其编码的氨基酸的第33位的A变异为V。之后，采用如前所述的方法，将该定点突变后的基因导入到GS115中，测定其酶活以及L-甲硫氨酸至S-腺苷甲硫氨酸的转化率。
结果发现，经过变异后的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的酶活性和转化率没有发生显著的改变，酶活约28U/mg，转化率40％。
实施例7酶促法生产S-腺苷甲硫氨酸采用常规的体外酶促反应条件，本发明人利用所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶，催化底物L-甲硫氨酸和ATP生成(-)型S-腺苷甲硫氨酸，酶促反应如下
结果发现，S-腺苷甲硫氨酸的得率很高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>华东理工大学<120>一种S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的构建及大规模发酵<130>065752<160>10<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1152<212>DNA<213>Saccharomyces cerevisiae<400>1atgtccaaga gcaaaacttt cttatttacc tctgaatccg tcggtgaagg tcacccagac60aagatttgtg accaagtttc tgatgctatt ttggacgctt gtttagaaca agatccattc120tccaaggttg cctgtgaaac agctgccaaa actggtatga ttatggtttt cggtgaaatt180accaccaaag ctagacttga ctaccaacaa atagtaagag ataccatcaa gaagattggt240tatgacgatt ctgccaaggg tttcgactac aagacatgta atgttttagt agctatcgaa300caacaatctc cagatatcgc tcaaggtctg cactatgaaa agagcttaga agacttaggt360gctggtgacc aaggtataat gtttggttac gctacagacg aaactccaga agggttacca420ttgaccattc ttttggctca caaattgaac atggctatgg cagatgctag aagagatggt480tctctcccat ggttgagacc agacacaaag actcaagtca ctgtcgaata cgaagacgac540aatggtagat gggttccaaa gaggatagat accgttgtta tttctgctca acatgctgat600gaaatttcca ccgctgactt gagaactcaa cttcaaaaag atattgttga aaaggtcata660ccaaaggata tgttagacga aaataccaaa tatttcatcc aaccatccgg tagattcgtc720atcggtggtc ctcaaggtga cgctggtttg accggtagaa agattattgt cgacgcttac780ggtggtgcct catccgtcgg tggtggtgcc ttctccggta aggactattc caaggtcgat840cgttccgctg cttacgctgc tagatgggtt gccaagtctc tagttgccgc tggtttgtgt900aagagagtcc aagtccaatt ttcatatgct attggtattg ctgaaccatt gtctttacat960gtggacacct atggtacagc tacaaaatca gatgacgaaa tcattgaaat tattaagaag1020aacttcgact tgagaccagg tgtgttagta aaggaattag atttggctag accaatttac1080ttaccaaccg cttcttatgg tcacttcact aatcaagagt actcatggga aaaaccaaag1140aaattggaat tt1152<210>2<211>384<212>PRT<213>Saccharomyces cerevisiae<400>2Met Ser Lys Ser Lys Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu1 5 10 15Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu Asp20 25 30Ala Cys Leu Glu Gln Asp Pro Phe Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Ala35 40 45Ala Lys Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala
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<221>MISC_FEATURE<223>突变体<400>4Met Ser Lys Ser Glu Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu1 5 10 15Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu Asp20 25 30Ala Cys Leu Glu Gln Asp Pro Phe Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Ala35 40 45Ala Lys Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala50 55 60Arg Leu Asp Tyr Gln Gln Ile Val Arg Asp Thr Ile Lys Lys Ile Gly65 70 75 80Tyr Asp Asp Ser Ala Lys Gly Phe Asp Tyr Lys Thr Cys Ash Val Leu85 90 95Val Ala Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Leu His Tyr100 105 110Glu Lys Ser Leu Glu Asp Leu Gly Ala Gly Asp Gln Gly Ile Met Phe115 120 125Gly Tyr Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Gly Leu Pro Leu Thr Ile Leu130 135 140Leu Ala His Lys Leu Asn Met Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Gly145 150 155 160Ser Leu Pro Trp Leu Arg Pro Asp Thr Lys Thr Gln Val Thr Val Glu
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<221>misc_feature<223>引物<400>6tatgcggccg cttacttcag accggcagca tc 32<210>7
<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>10taagcggccg caaattccaa tttctttg28
权利要求
1.一种S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白，其特征在于，其酶活性超过25U/mg，以37℃下反应60分钟催化形成1μmol S-腺苷甲硫氨酸所需要的酶量为1U来计算。
2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白的氨基酸序列对应于SEQ ID NO2氨基酸序列的第337位由I突变为V。
3.如权利要求2所述的蛋白，其特征在于，还包括所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白的氨基酸序列对应于SEQ ID NO2氨基酸序列的第5位由K突变为E。
4.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，该蛋白是(a)具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性超过25U/mg的由(a)衍生的蛋白。
5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组(i)编码权利要求1所述的S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白的多核苷酸；或(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQID NO4所示氨基酸序列的多肽。
7.一种载体，其特征在于，它含有权利要求5所述的多核苷酸。
8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求7所述的载体，或基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。
9.一种生产S-腺苷甲硫氨酸合成酶的方法，其特征在于，包括步骤(1)培养权利要求8所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离S-腺苷甲硫氨酸酶。
10.一种生产S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤(S1)在S-腺苷甲硫氨酸合成酶存在下，使L-甲硫氨酸与ATP反应，获得反应产物；(S2)从反应产物中分离出S-腺苷甲硫氨酸。
全文摘要
本发明公开了一种新的S－腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白及其编码基因。本发明还公开了含有所述编码基因的载体。本发明还公开了可用于生产S－腺苷甲硫氨酸的菌株以及生产S－腺苷甲硫氨酸的方法。本发明构建的S－腺苷甲硫氨酸生产菌株的S－腺苷甲硫氨酸产量可达到9g/L以上，L－甲硫氨酸对S－腺苷甲硫氨酸的转化率可达40％。
文档编号C12N15/52GK1948469SQ200610117828
公开日2007年4月18日 申请日期2006年11月1日 优先权日2006年11月1日
发明者储炬, 胡辉, 王勇, 张嗣良, 庄英萍 申请人:华东理工大学, 上海国佳生化工程技术研究中心有限公司