专利名称：：一种测定土壤微生物生物量碳的方法一种测定土壤微生物生物量碳的方法
技术领域：
本方法涉及土壤中微生物生物量碳的测定，具体的说是一种改进土壤微生物生物量碳的测定方法。技术背景土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5^11113-10^113活的微生物总量，其养分占土壤中相应元素的比例很小，但在评价其对作物营养的作用时意义很大。因为它非常活跃并可迅速参与养分循环，既是养分循环过程的动力和迸入土壤的有机物质的"转化者"，又是土壤能量和养分特别是C、N、P、S等元素内部供应机制的"源"和"库"(文献l:JenkinsonDS，LaddJN，Microbialbiomassinsoil:Measurementandturnover,SoilBiochemistry,1981，(5):415-471)。微生物生物量碳在土壤全碳中所占比例很小，一般只占土壤有机碳全量的1%-4%，但对土壤有效养分而言，却是一个很大的给源和库存,因为它是土壤有机质中最为活跃的部分，可反映土壤养分有效状况和生物活性，能在很大程度上反应土壤微生物数量，是评价微生物量和活性的参数指标。微生物量碳转化迅速，能在检测到土壤总量碳变化之前反映土壤有机质的变化，是更具敏感性的土壤质量指标(文献2:樊军，郝明德，长期轮作施肥对土壤微生物碳氮的影响，水土保持研究，2003，10(1):85-87)。微生物量碳对不同土壤培肥措施非常敏感，不受无机氮的直接影响，这是微生物量碳用作土壤生物学评价指标的一大优势(文献3:宋秋华，李凤民，刘洪升，王俊，李世清，黄土区地膜覆盖对麦田土壤微生物体碳的影响，应用生态学报，2003，14(9):1512-1516)，通常被用于估计土壤生物状态，对评价土壤质量状况至关重要。现阶国内外测定土壤微生物量碳的方法多采用氯仿熏蒸浸提法，主要步骤包括①熏蒸-浸提取新鲜土壤30g(相当于干土25g左右)于小烧杯中，放入装有30ml氯仿(带沸石)、30mlNaOH和湿润滤纸的真空干燥器中，密闭抽气至氯仿沸腾3min，关闭阀门。在25t:黑暗条件下培养24h，打开干燥器检验是否漏气，若不漏气，取出氯仿和NaOH，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止。另作不熏蒸作为对照。将熏蒸和不熏蒸土样用100ml硫酸钾溶液振荡浸提30min，过滤。②测定(重络酸钾法)吸取浸提液5.0ml，K2Cr2O72.0ml，HgO0.07g，双酸溶液15ml放入消煮瓶中，缓慢加热沸腾回流30min，冷却后，力fll滴邻啡啰啉指示剂，用FeS04滴定剩余的&20207(文献4:鲁如坤，土壤农业化学分析方法，北京中国农业科技出版社，2000:228-233)。使用该方法对土壤微生物量碳进行测定有以下缺点①消煮瓶底部面积大，而加入的样品溶液及其他溶液体积少，加热的边缘效应很大，而且其坐入炉体后，不容易观察到沸腾回流现象。②加热方式过于笼统，对消煮过程来说，沸腾和回流是两个过程，且回流要先于沸腾，通过多次实验发现，以沸腾计时和以回流计时30min都不能取得良好的实验结果，况且沸腾现象比较明显，计时误差较小，而回流现象不明显，计时误差较大。③回流需要冷凝装置，试验操作比较繁琐，且对大批样品来说，设置回流步骤既耗时又费事。
发明内容本发明的目的是提供一种重复性好，重现性高，并且简单易行的测定土壤中微生物生物量碳的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下熏蒸步骤不变(见文献4)，测定时改用消煮仪作为消煮加热装置，消煮管代替消煮瓶盛装试样和试剂溶液，采用梯度升温的方式实现缓慢加热的目的，使用消煮仪对消煮管进行加热时，消煮管上方盖一尾部弯曲的小漏斗，溶液沸腾后再次调整温度并开始计时，50min后，将消煮管取下，冷却。最后用FeS04反滴定剩余的K2Cr207。一种测定土壤微生物生物量碳的方法，1)采用熏蒸-浸提的方法对土样进行处理，以不熏蒸土样为对照组；将熏蒸和不熏蒸土样分别用4倍重量体积的硫酸钾溶液振荡浸提，过滤；2)重铬酸钾法测定向消煮管中一次加入浸提液5.0ml，K2Cr2070.5-5.0ml，HgO0.05-0.1Og，双酸112804-11304溶液10-20ml，并在消煮管上方加盖一尾部弯曲的小漏斗；3)采用梯度升温的方式对溶液进行加热，溶液于40-5(TC时开始梯度升温，加热于6-8min内升温至70-80"C，恒温2-3min;加热于8-10min内升温至95-105°C，恒温2-3min;加热于10-13min内升温至120-130°C，恒温2-3min;加热于13-15min内升温至140-155°C，恒温2-3min;加热于15-18min内升温至170-180。C，溶液开始沸腾并计时；恒温180"C、50min后，冷却；4)将消煮管中的溶液倒入容器中，用10-30ml蒸馏水分2-3次冲洗试管，加入一滴邻菲啰啉指示剂，用FeS04进行滴定；1)计算FeS04溶液浓度其中^2&2。7—^0"207溶液浓度，~.祸一&0207溶液体积，CF,—FeS04溶液浓度，^,。^"FeS04溶液体积。2)计算回收率回收率％=_——-xioo%n标准物质xV标淮物质其中Vea—滴定空白时所消耗的FeS04溶液体积，V旨,一滴定乙酰苯胺标准溶液时消耗的FeS04溶液体积，n标准物质一标准物质的浓度，V标准物质的体积。3)有机碳含量的计算CV未豕a—V駭)xCV战4x3xtsx1000其中V未熏『滴定未熏蒸样品时所消耗的FeS04溶液体积，V熏蒸一滴定熏蒸样品时所消耗的FeS04溶液体积，ts—样品的稀释倍数，m—烘干土质量。ts—稀释倍数m—烘干土质量4)微生物生物量碳的计算其中Ec—薰蒸土样有机碳量与未薰蒸土样有机碳量之差，KEc—氯仿薰蒸杀死微生物体中的碳被浸提出来的比例。采用熏蒸-浸提的方法对土样进行处理过程为取土壤25g，放入带沸石的装有25-40ml氯仿、20-40mlNaOH和湿润滤纸的真空干燥器中，密闭抽气至氯仿沸腾3-5min，关闭阀门；在室温黑暗条件下培养24-48h，打开干燥器检验是否漏气，若不漏气，取出氯仿和NaOH，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止；另作不熏蒸作为对照；将熏蒸和不熏蒸土样用100ml硫酸钾溶液振荡浸提30min，过滤。使用改进方法对土壤微生物生物量碳进行测定，有如下优点1.加热效果理想。消煮瓶底面积大，加热的边缘效应很大，其坐入炉体后不易观察少量液体样品的沸腾和回流，使用消煮管却可以克服这一难题。在消煮管中加入上述液体后，液体的液面正好与铝锭平面平行。我们对铝锭加热模块进行随机测温试验发现，不同位置的铝锭加热模块之间温度相差不超过±0.5°C，温度计显示温度与设定温度相差不超过士0.8°C,说明消煮仪将待加热的液体包裹后，对液体的加热均匀，液体几乎是同时沸腾，减小了加热过程中可能出现的边缘差异，较消煮瓶加热效果更加理想。2.精度高，准度度好。改进的方法还试验了不同的升温方式对试验结果可能产生的影响。如果将初始温度定在175。C，消煮仪显示恒温后，溶液尚不能沸腾，至溶液沸腾，所需时间有时长，有时短，测定结果也不稳定。改用梯度升温，溶液升温至175。C后l-3min，溶液一定沸腾，且测定结果精确度高，准确度好。3.仪器简单，操作简便。加热回流需要冷凝装置，这本身就加大了试验的成本以及复杂程度。本方法改用尾部弯曲的小漏斗盖在消煮管顶部，以代替冷凝装置。因为在该实验中，没有在18(TC以下挥发损失的物质，这样就可以省略使用冷凝装置。盖上小漏斗的作用有两个一是减小热量散失，起到保温的作用；二是起到部分回流的作用。具体实施方式实施例1对比原有的方法和改进的方法测定乙酰苯胺标准溶液中的碳含量，以及不同的加热方式对以乙酰苯胺标准溶液中碳含量测定结果的影响。参照文献4，使用改进的重铬酸钾法对进口乙酰苯胺标准溶液中的碳含量进行测定(文献4:鲁如坤，土壤农业化学分析方法，北京中国农业科技出版社，2000:228-233)。向消煮管中依次加入乙酰苯胺标准溶液5.0ml，0.0667mol/l的K2Cr2070.5-5.Oml，催化剂HgO0.07g，浓112804:浓H3P04体积比为2:1的双酸溶液10-20ml，并在消煮管上方加盖一尾部弯曲的小漏斗。采用梯度升温的方式对溶液进行加热，至溶液沸腾，调温计时，50min后，停止加热，冷却。将试管中的溶液倒入锥形瓶中，用20ml蒸馏水分两次冲洗试管，加入一滴邻菲啰啉指示剂，用FeS04进行滴定。具体过程如下1)配制乙酰苯胺标准溶液取德国进口乙酰苯胺试剂0.1407克，加二次蒸馏水溶解，定容至1000ml容量瓶中，此溶液含有有机碳100mg/l。将该储备液按一定倍数稀释，得到一定浓度的溶液。2)向消煮管中依次加入乙酰苯胺标准溶液5.0ml，氧化剂K2Cr2072.0ml(氧化剂K2Cr207的加入量不固定，若样品中含碳量高，则需多加入氧化剂，若样品中含碳量低，则可少加氧化剂，只要保证熏蒸、不熏蒸的成对样品加入的氧化剂量一致即可)，催化剂HgO0.07g，双酸溶液(H2S04-H3P04)15ml，并在消煮管上方加盖一尾部弯曲的小漏斗。3)采用梯度升^的方式对溶液进行加热，即从40-5(TC开始升温，加热6-8min，消煮仪显示温度至70-80°C，保持2-3min后调温，再经过8-10min，消煮仪显示温度至95-105。C继续保持2-3min，调温，再经过10-13min后，消煮仪显示温度至120-13(TC后，保持2-3min，再调温，加热13-15min后，至温度升至145-155°C，保持2-3min，再调温，加热15-18min左右，温度升至170-175。C。溶液开始沸腾，再次调温至180。C，计时。50min后，关闭消煮仪，将消煮管取下，冷却。4)将试管中的溶液倒入锥形瓶中，用20ml蒸馏水分两次冲洗试管，加入一滴邻菲啰啉指示剂，用FeS04进行滴定。本方法的原理如下1)有机碳与重铬酸钾在加热的条件下发生反应2K2Cr207+8H2S04+3C=2K2S04+2Cr2(S04)3+3C02T+8H202)滴定时剩余的重铬酸钾与滴定剂硫酸亚铁在常温下反应K2Cr207+6FeS04+7H2S04=Cr2(S04)3+K2S04+3Fe2(S04)3+7H203)到达滴定终点时稍微过量的F^+与邻啡啰啉生成红色络合物，显示滴定终点的到达Fe2++3C12H8N2=Fe(C12H8N2)32+试验结果的计算1)计算FeS04溶液浓度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>利用消煮瓶加热回流方法和发明的改进方法对乙酰苯胺标准溶液中的碳进行测定，回收率和精密度结果列于表l。由结果可以看出，使用消煮瓶加热回流测定结果既不稳定也不准确，而改进方法灵敏度高准确性也好。表l原方法与改进方法测<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本文还实验了不同加热方式对溶液中有机碳测定结果的影响，回收率和精密度结果见表2。实验结果显示，由本发明采用的梯度加热方式，可以很好的控制温度升高，使全部溶液沸腾的时间间隔不超过2min，这在一般的加热过程中很难做到，说明使用梯度加热可以很好的抑制边缘效应，使测定结果更加稳定准确。表2不同加热方式对测定结果的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注使;甲改进的方法测定乙酰苯胺中碳含量的差异源于每次加热的方式不尽相同编号l:从40"C开始升温，7min至消煮仪显示温度为7(TC，保持3min后调温，再经过8min，消煮仪显示温度至95"C继续保持3min调温，再经过10min后，消煮仪显示温度至12(TC后，保持2min，再调温，加热13min后，至温度升至155。C，保持3min，再调温，加热16min左右，温度升至175°C，溶液开始沸腾，调温度至18(TC并计时。50min后，关闭消煮仪，冷却。编号2:从4(TC开始升温，加热7min，消煮仪显示温度至70°C，保持3min后调温，再经过9min，消煮仪显示温度至IO(TC继续保持2min调温，再经过llmin后，消煮仪显示温度至12(TC后，保持2min，再调温，加热13min后，至温度升至155i:，保持2min，再调温，加热18min左右，温度升至175'C，溶液开始沸腾，调温度至180。C并计时。50min后，关闭消煮仪，将消煮管取下，冷却。编号3:从45。C开始升温，加热7min，消煮仪显示温度至75°C，保持3min后调温，再经过8min，消煮仪显示温度至95"C继续保持3min调温，再经过10min后，消煮仪显示温度至120。C后，保持3min，再调温，加热13min后，至温度升至145。C，保持2min，再调温，加热17min左右，温度升至175。C。溶液开始沸腾，调温度至18(TC并计时。50min后，关闭消煮仪，将消煮管取下，冷却。编号4:从40。C开始升温，加热8min，消煮仪显示温度至80°C，保持2min后调温，再经过8min，消煮仪显示温度至95"C继续保持3min调温，再经过10min后，消煮仪显示温度至120。C后，保持2min，再调温，加热13min后，至温度升至155'C，保持3min，再调温，加热16min左右，温度升至175。C，溶液开始沸腾，调温度至18(TC并计时。50min后，关闭消煮仪，冷却。编号5:从50。C开始升温，加热6min，消煮仪显示温度至70°C，保持3min后调温，再经过8min，消煮仪显示温度至95"C继续保持3min调温，再经过10min后，消煮仪显示温度至12(TC后，保持2min，再调温，加热13min后，至温度升至155。C，保持3min，再调温，加热16min左右，温度升至175"，溶液开始沸腾，调温度至18(TC并计时。50min后，关闭消煮仪，冷却。编号6:从45。C开始升温，加热7min，消煮仪显示温度至75°C，保持3min后调温，再经过8min，消煮仪显示温度至95。C继续保持2min调温，再经过llmin后，消煮仪显示温度至12(TC后，保持3min，再调温，加热13min后，至温度升至145。C，保持2min，再调温，加热17min左右，温度升至175t:。溶液开始沸腾，调温度至18(TC并计时。50min后，关闭消煮仪，将消煮管取下，冷却。编号7:从45。C开始升温，加热7min，消煮仪显示温度至75°C，保持3min后调温，再经过8min，消煮仪显示温度至95。C继续保持2min调温，再经过12min后，消煮仪显示温度至12(TC后，保持2min，再调温，加热15min后，至温度升至155。C，保持2min，再调温，加热17min左右，温度升至175。C。溶液开始沸腾，调温度至18(TC并计时。50min后，关闭消煮仪，将消煮管取下，冷却。编号8:从4(TC开始升温，加热8min，消煮仪显示温度至80°C，保持2min后调温，再经过8min，消煮仪显示温度至95。C继续保持3min调温，再经过10min后，消煮仪显示温度至122。C后，保持3min，再调温，加热13min后，至温度升至145。C，保持3min，再调温，加热17min左右，温度升至175。C，溶液开始沸腾，调温度至18(TC并计时。50min后，关闭消煮仪，冷却。编号9:从5(TC开始升温，加热7min，消煮仪显示温度至75°C，保持3min后调温，再经过8min，消煮仪显示温度至95°(3继续保持3min调温，再经过10min后，消煮仪显示温度至12(TC后，保持2min，再调温，加热13min后，至温度升至155。C，保持3min，再调温，加热17min左右，温度升至175'C，溶液开始沸腾，调温度至18(TC并计时。50min后，关闭消煮仪，冷却。编号10:从5(TC开始升温，加热7min，消煮仪显示温度至75°C，保持3min后调温，再经过8min，消煮仪显示温度至95。C继续保持3min调温，再经过10min后，消煮仪显示温度至120。C后，保持2min，再调温，加热13min后，至温度升至155。C，保持3min，再调温，加热16min左右，温度升至175。C，溶液开始沸腾并，调温度至1S0。C并计时。50min后，关闭消煮仪，冷却。编号ll:从45"C开始升温，加热7min，消煮仪显示温度至75°C，保持3min后调温，再经过8min，消煮仪显示温度至95"继续保持2min调温，再经过13min后，消煮仪显示温度至123。C后，保持2min，再调温，加热15min后，至温度升至155。C，保持2min，再调温，加热17min左右，温度升至175"。溶液开始沸腾，调温度至18(TC并计时。50min后，关闭消煮仪，将消煮管取下，冷却。编号12:从45。C开始升温，加热7min，消煮仪显示温度至75°C，保持3min后调温，再经过8min，消煮仪显示温度至95X:继续保持2min调温，再经过13min后，消煮仪显示温度至123。C后，保持2min，再调温，加热16min后，至温度升至157'C，保持2min，再调温，加热17min左右，温度升至175。C。溶液开始沸腾，调温度至18(TC并计时。50min后，关闭消煮仪，将消煮管取下，冷却。编号13:从50。C开始升温，加热6min，消煮仪显示温度至70°C，保持3min后调温，再经过8min二消煮仪显示温度至95。C继续保持3min调温，再经过10min后，消煮仪显示温度至12(TC后，保持2min，再调温，加热13min后，至温度升至155"C，保持2min，再调温，加热17min左右，温度升至175。C，溶液开始沸腾，调温度至18(TC并计时。50min后，关闭消煮仪，冷却。编号14:从5(TC开始升温，加热6min，消煮仪显示温度至70°C，保持3min后调温，再经过8min，消煮仪显示温度至97'C继续保持2min调温，再经过10min后，消煮仪显示温度至12(TC后，保持2min，再调温，加热15min后，至温度升至160。C，保持2min，再调温，加热17min左右，温度升至175'C，溶液开始沸腾，调温度至18(TC并计时。50min后，关闭消煮仪，冷却。编号15:从5(TC开始升温，加热8min，消煮仪显示温度至80°C，保持2min后调温，再经过8min，消煮仪显示温度至95"继续保持3min调温，再经过10min后，消煮仪显示温度至120。C后，保持2min，再调温，加热13min后，至温度升至155。C，保持2min，再调温，加热17min左右，温度升至175'C，溶液开始沸腾，调温度至18(TC并计时。50min后，关闭消煮仪，冷却。编号16:从45'C开始升温，加热7min，消煮仪显示温度至70°C，保持3min后调温，再经过8min，消煮仪显示温度至95'C继续保持3min调温，再经过10min后，消煮仪显示温度至12(TC后，保持2min，再调温，加热13min后，至温度升至155。C，保持2min，再调温，加热18min左右，温度升至175i:，溶液开始沸腾，调温度至18(TC并计时。50min后，关闭消煮仪，冷却。实施例2使用改进的方法测定土壤中微生物生物量碳的含量。具体实施过程试验步骤为1)熏蒸-浸提取新鲜土壤30g(相当于干土25g左右)于小烧杯中，放入装有30ml氯仿(带沸石)、30mlNaOH和湿润滤纸的真空干燥器中，密闭抽气至氯仿沸腾3min，关闭阀门。在25"C黑暗条件下培养24h，打开干燥器检验是否漏气，若不漏气，取出氯仿和NaOH，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止。另作不熏蒸作为对照。将熏蒸和不熏蒸土样用100ml硫酸钾溶液振荡浸提30min，过滤。2)测定(重铬酸钾法)向消煮管中一次加入浸提液5.0ml，K2Cr2072.0ml，HgO0.07g，双酸溶液15ml，并在消煮管上方加盖一尾部弯曲的小漏斗。3)采用梯度升温的方式对溶液进行加热，即以5(TC开始升温，加热8min，消煮仪显示温度至75。C，保持2min后调温，再经过9min，消煮仪显示温度至10(TC继续保持2min，调温，再经过12min后，消煮仪显示温度至125。C后，保持2min，再调温，加热13min后，至温度升至15(TC，保持2min，再调温，加热15min左右，温度升至175°C。溶液开始沸腾并计时。50min后，关闭消煮仪，将消煮管取下，冷却。4)将试管中的溶液倒入锥形瓶中，用20ml蒸馏水分两次冲洗试管，加入一滴邻菲喂啉指示剂，用FeS04进行滴定。试验结果的计算1)计算FeS04溶液浓度:2)计算回收率n标准物质xV标推物质3)有机碳含量的计算xl00%0(C)=x3xtsxl0004)微生物生物量碳的计算使用改进的化学分析方法与仪器分析方法测定土壤中微生物生物量碳含量结果如表3所示，经t-检验比较，两组结果平均值之间不存在显著性差异，说明以所改进的方法测定土壤中微生物生物量碳结果准确可靠。表3化学分析方法和仪器分析方法测定土壤中微生物量碳结果比较(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1.一种测定土壤微生物生物量碳的方法，其特征在于1)采用熏蒸-浸提的方法对土样进行处理，以不熏蒸土样为对照组；将熏蒸和不熏蒸土样分别用4倍重量体积的硫酸钾溶液振荡浸提，过滤；2)重铬酸钾法测定向消煮管中一次加入浸提液5.0ml，K2Cr2O70.5-5.0ml，HgO0.05-0.10g，双酸H2SO4-H3PO4溶液10-20ml，并在消煮管上方加盖一尾部弯曲的小漏斗；3)采用梯度升温的方式对溶液进行加热，溶液于40-50℃时开始梯度升温，加热于6-8min内升温至70-80℃，恒温2-3min；加热于8-10min内升温至95-105℃，恒温2-3min；加热于10-13min内升温至120-130℃，恒温2-3min；加热于13-15min内升温至140-155℃，恒温2-3min；加热于15-18min内升温至170-180℃，溶液开始沸腾并计时；恒温180℃、50min后，冷却；4)将消煮管中的溶液倒入容器中，用10-30ml蒸馏水分2-3次冲洗试管，加入一滴邻菲啰啉指示剂，用FeSO4进行滴定；试验结果的计算1)计算FeSO4溶液浓度2.按照权利要求l所述的方法，其特征在于采用熏蒸-浸提的方法对土样进行处理过程为，取土壤25g，放入带沸石的装有25-40ml氯仿、20-40mlNaOH和湿润滤纸的真空干燥器中，密闭抽气至氯仿沸腾3-5min，关闭阀门；在室温黑暗条件下培养24-48h，打开干燥器检验是否漏气，若不漏气，取出氯仿和NaOH，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止；另作不熏蒸作为对照；将熏蒸和不熏蒸土样用100ml硫酸钾溶液振荡浸提30min，过滤。3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述双酸H2S04-H3P04溶液为浓H2S04:浓H3P04体积比为2:1。全文摘要本方法涉及土壤中微生物生物量碳的测定，具体的说是改进土壤微生物生物量碳的测定方法。本发明改用消煮仪作为消煮加热仪器，消煮管代替消煮瓶盛装试样和试剂溶液，采用梯度升温的方式实现缓慢加热的目的，使用消煮仪对消煮管进行加热时，消煮管上方盖一尾部弯曲的小漏斗，溶液沸腾后开始计时，50min后停止加热，冷却，最后用FeSO<sub>4</sub>反滴定剩余的K<sub>2</sub>Cr<sub>2</sub>O<sub>7</sub>。本发明精密度高，准确性好，而且仪器简单，操作简便。文档编号G01N21/77GK101210882SQ20061013511公开日2008年7月2日申请日期2006年12月27日优先权日2006年12月27日发明者桦周,宇万太,璐张,强马申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所