专利名称：一种黄绿蜜环菌及其培养方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，尤其是利用生物工程技术高密度培养高原珍稀食用真菌，并利用该培养技术获得高产量的胞外活性多糖。
背景技术：
食药用真菌是对既可食用又可药用一类真菌的统称，而真菌多糖主要是指存在于菌丝体细胞壁内或分泌于细胞外的由十个分子以上的单糖通过糖苷键连接而成的高分子多聚物。
食药用真菌作为药物，在我国已有悠久的历史。早在两千多年前的东汉末期，世界上第一部药物专著《神农本草经》中就记载了灵芝、获荃、猪等等真菌的药效；明代著名医学家李时珍在《本草纲目》中收载了20多种真菌。现有的研究结果表明，已知对肉瘤和艾氏癌抑制率达60％一100％的真菌有近300种，分属51科70多个属，大多数真菌的抗肿瘤活性是具有特定结构的多糖和蛋白质结合多糖体。食药用真菌在我国资源丰富，是寻找新药物的宝贵资源库，国内外对食药用真菌多糖的开发利用发展很快，过去对多糖的研究主要集中在对传统资源的开发、分离纯化方法探讨以及生理活性实验方面。目前以至将来，其热点主要集中在探究多糖活性与构效之间的关系，修饰天然多糖增强其原有活性；研究真菌多糖的免疫作用机理，扩大临床应用领域；多糖高产菌株的选育以及深层发酵调控研究。
食药用真菌多糖是一种能够增强人体免疫功能的生物活性物质，在国际上被称为生物反应调节剂。早在1957年，Benacerraf和Sebestyn发现了静脉注射来自酵母细胞壁的酵母聚糖对吞噬细胞活性有影响。随后人们对酵母聚糖进行了分离纯化，1961年Riggi确定了酵母聚糖中的这种活性成分是葡聚糖，开创了葡聚糖作为免疫活性物质的新纪元。1969年，Chihara等人分别从食药用真菌子实体中分离得到了生物活性物质，并证明了Q-(1-3)-D-葡聚糖是抑瘤作用的主要活性成分。此后，人们陆续从云芝、获荃、猪荃、灵芝等多种食药用真菌中分离出多糖，并对它们的免疫活性和抗肿瘤能力进行了评价。许多活性多糖制剂已广泛应用于临床，在免疫调节、肿瘤治疗等方面取得了令人鼓舞的效果。在食药用真菌多糖的开发利用方面，日本处于领先地位，香菇多糖、云芝多糖、裂褶菌多糖和灰树花多糖等已被广泛地应用于临床，作为癌症的免疫治疗剂，非正式临床应用的猪荃多糖、灵芝多糖、亮菌多糖、猴头菇多糖和银耳多糖等也在研制中。
黄绿蜜环菌属于担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲、伞菌目、白蘑科、蜜环菌属(Armillaria)一种著名的食药用真菌。主要分布于青海、西藏海拔3000～4300m的草原或高山草甸上，单生至群生，形成蘑菇圈。青海主要分布于海北(祁连、海晏、刚察)，黄南(泽库、黄南)，海南(共和、贵德、兴海)，果洛(玛沁、甘德、久治)，玉树(结古、称多、曲麻莱)等地。在天麻(Gastrodia elata Blume)生长过程中，黄绿蜜环菌是必不可少的共生菌。近年来国内外学者对同属的蜜环菌、发光假蜜环菌等研究报道较多，发现蜜环菌菌丝体和发酵液不仅具有与天麻相似的药理作用和临床疗效，而且从蜜环菌菌丝体提取的多糖(MHG)能在体外具有明显的抗突变能力和抑制肿瘤生长的效果。国内对野生黄绿蜜环菌营养成分进行了初步的分析表明，富含氨基酸、蛋白质、多糖类、多肽类物质等营养及药用成分，具有较高保健和药效价值，被公认为最有开发利用价值的野生食药兼用菌类之一。黄绿蜜环菌目前处于完全野生的状态，驯化栽培研究尚属起步阶段，而采用液体深层发酵的方法获得菌丝体和胞外多糖是进行黄绿蜜环菌尽快开发和综合利用的有效途径。目前国内有关开展黄绿蜜环菌的选育和培养技术研究很少，对其活性多糖的开发更是未见报道，因此本发明是基于此基础上开展了黄绿蜜环菌的快速培育和发酵技术，并构建具有高产量胞外多糖的黄绿蜜环菌，为深入研究和开发黄绿蜜环菌资源奠定基础。本专利的发明内容是目前未见报道的。
发明内容
本发明提供一种黄绿蜜环菌及该菌株的培养方法与菌株用途。
一种黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens)ZJUQH CGMCCNo.1884。保藏日期2006年12月8日。保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
该黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens)ZJUQH经过鉴定属于担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycentes)、伞菌目(Agaricales)、白蘑科(Tricholomataceae)、蜜环菌属(Armillaria)一种著名食用菌。该蜜环菌菌株ZJUQH为蜜环菌属，在察氏培养基上，菌株生长较满，形成圆形菌落，具有辐射状沟纹；黄绿蜜环菌菌盖扁平，盖缘始终内卷，新鲜时呈柠檬黄色至硫磺色，在阳光下闪闪发光，干后近白色，不粘，菌盖表皮开裂形成近环状排列的纤毛状厚鳞片，在干燥环境中鳞片明显。子实体中等大，盖宽5～12cm；菌肉厚，肉质，白色至浅黄色，伤后不变色，味道鲜美柔和至甘甜，有特殊茴香气味。菌褶近直生，弯生至短延生，不等长，密，宽，黄色至菌盖色；菌柄圆柱形，长2～8cm，直径2～2.5cm，白色至黄色.菌环以下有黄色鳞片，肉质至纤维质，中突，老后内部松软至中空，菌柄茎部膨大，内菌幕幼时明显，棉絮状至近膜质，黄白色到浅黄色，后形成菌环至消失。菌环中位，单层，菌环以上为白色，菌环以下为黄色。在显微镜下观察，担孢子椭圆形，无色至微黄色，淀粉质，担子棒状，无色，具4个孢子。菌丝具明显锁状联合。
所述的黄绿蜜环菌的培养方法，采用摇瓶发酵培养；培养基葡萄糖15～40g/L、酵母膏1～2g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.45g/L；23℃、120r/min下培养120h小时。
所述的黄绿蜜环菌的培养方法，采用发酵罐发酵培养；培养基葡萄糖浓度31.3g/L，酵母膏浓度1.1g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.45g/L，发酵温度23℃，发酵通气量0.5L/min，发酵培养120小时。
本发明黄绿蜜环菌的产胞外多糖和最大化菌丝体积累的培养条件进行了大量实验，获得了适合工业化生产的最佳培养条件和技术参数，解决了野生黄绿蜜环菌不易人工培养、生长速度慢、容易污染等问题，采用的人工培养方法既能加快真菌菌体生长速度，实现了该菌的人工培养和降低污染机率，同时胞外多糖产量大幅提高，并为开发利用新型食药用食用菌提供新思路和依据。
具体实施例方式
黄绿蜜环菌ZJUQH的筛选分离自青藏高原地区中筛选，主要采用天麻种植的土壤区域中的蜜环菌作为分离样品。将分离样品采用单孢法进行培养，挑取单菌落于初筛培养基上，培养适宜时间后将在初筛培养基上显示蓝色的菌落挑出进行复筛。将发酵复筛得到一株生长速度较快、胞外多糖分泌积累较多的菌株编号为自然分离菌株，其在23℃、pH自然和120r/min下培养5天后菌丝体生物量达到2g/L，胞外多糖积累量为3.5g/L。
经微波和紫外复合诱变，其菌丝体生物量和胞外多糖分泌量分别达到5g/L、5.4-6g/L。突变株的孢子颜色发生显著突变，其它特征并未发生变化，在斜面培养基上生长比未突变株提前24-48小时。
筛选所用培养基及其培养方法富集及斜面培养基(g/L)葡萄糖15g/L，酵母膏2g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.3g/L，维生素B1 50mg，三十烷醇1.5ppm，pH自然。
初筛培养基(g/L)葡萄糖15g/L，酵母膏5g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.3g/L，维生素B1 50mg，三十烷醇1.5ppm，pH自然。
取斜面试管菌种点种于培养皿中，23℃培养5d后，用接种环刮起1块菌块，分别接种于盛有发酵液的100ml/500mL三角瓶中，接种量为2mL种子培养液。在发酵培养基上于23℃下100r/min摇床培养5天，测定多糖含量。
种子斜面及平板培养23℃培养72h。
发酵培养发酵培养基30mL盛于250mL三角瓶中，接种后在旋转式摇床上23℃，转速100r/min，发酵培养120h。
发酵培养基研究发酵培养基100mL盛于500mL三角瓶中，接种用生理盐水冲洗的孢子2ml(孢子数约为106个/ml)，23℃在旋转式摇床上发酵培养120h，转速100r/min。
黄绿蜜环菌ZJUQH的特征描述和鉴定结果该蜜环菌菌株ZJUQH为蜜环菌属，在察氏培养基上，菌株生长较满，形成圆形菌落，具有辐射状沟纹；黄绿蜜环菌菌盖扁平，盖缘始终内卷，新鲜时呈柠檬黄色至硫磺色，在阳光下闪闪发光，干后近白色，不粘，菌盖表皮开裂形成近环状排列的纤毛状厚鳞片，在干燥环境中鳞片明显.子实体中等大，盖宽5～12cm.菌肉厚，肉质，白色至浅黄色，伤后不变色，味道鲜美柔和至甘甜，有特殊茴香气味。菌褶近直生，弯生至短延生，不等长，密，宽，黄色至菌盖色；菌柄圆柱形，长2～8cm，直径2～2.5cm，白色至黄色。菌环以下有黄色鳞片，肉质至纤维质，中突，老后内部松软至中空，菌柄茎部膨大.内菌幕幼时明显，棉絮状至近膜质，黄白色到浅黄色，后形成菌环至消失。菌环中位，单层，菌环以上为白色，菌环以下为黄色。在显微镜下观察，担孢子椭圆形，无色至微黄色，淀粉质，6.4～7.8μm×4.0～5μm。担子棒状，22～28μm×4.0～5.5μm，无色，具4个孢子。菌丝具明显锁状联合。综合其菌落形态、足细胞及分生孢子头的特征，可以鉴定为黄绿蜜环菌，并命名为黄绿蜜环菌ZJUQH。
黄绿蜜环菌ZJUQH发酵产菌丝体和胞外多糖实验发酵液中胞外多糖的提取取一定体积的发酵液在3000rpm下离心10分钟，取20ml上清液50℃浓缩，加3倍体积的95％乙醇沉淀12小时，3000rpm离心20分钟，沉淀用75％的乙醇洗至Molish反应阴性，离心，沉淀用60℃热水充分溶解，离心去沉淀，上清液定容于100ml容量瓶。
多糖的测定采用苯酚-硫酸法进行定量。
菌丝体干重测定取一定量发酵液，进行过滤获得菌丝体，得到菌丝体和滤液，将菌丝体经过多次洗涤，于60℃干燥至恒重称量，以g/L计算菌体干重(DCW)。
摇瓶发酵培养实验一培养基(g/L)葡萄糖和酵母膏的浓度分别为15g/L、2g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.45g/L，pH自然。
发酵培养方法发酵培养基100ml盛于500ml三角瓶中，接1×106的孢子1ml，于23℃、120r/min下培养120h小时后获得的菌丝体生物量为7g/L；培养获得的最大胞外多糖含量为3.1-3.5g/L。
摇瓶发酵培养实验二发酵培养基(g/L)葡萄糖和酵母膏的浓度分别为31.3g/L、1.1g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.45g/L，pH5-6。
发酵培养方法发酵培养基100ml盛于500ml三角瓶中，接1×106的孢子1ml，23℃、120r/min培养120h小时后获得的生物量为8.2g/L；培养获得的最大多糖含量为5.4±0.4g/L。
摇瓶发酵培养实验三发酵培养基葡萄糖34.3g/L，酵母膏1.91g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.45g/L时，pH5-6。
发酵培养方法发酵培养基100ml盛于500ml三角瓶中，接1×106的孢子1ml，23℃、120r/min培养120h小时后获得的最大真菌菌丝体量。获得的最大生物量为9.46g/L。
发酵罐发酵培养实验发酵培养基葡萄糖和酵母膏的浓度分别为31.3g/L、1.1g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.45g/L，pH5-6。
发酵方法5-L自控式生物发酵罐，罐装发酵培养基体积3L，发酵温度23℃，发酵通气量0.5L/min，无搅拌。发酵培养120小时后获得的生物量为10g/L，获得的胞外多糖量为5.8g/L。
粗料摇瓶发酵培养实验发酵培养基麦芽汁(14Bx)10％V/V，葡萄糖15g/L，酵母膏2g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.3g/L时，pH6.2。
发酵培养方法发酵培养基100ml盛于500ml三角瓶中，接1×106的孢子1ml，种龄72小时，23℃、120r/min培养120h小时后获得的菌丝体生物量为10.2±1g/L、胞外多糖含量为12±1.5g/L。
权利要求
1.一种黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens)ZJUQH CGMCCNo.1884。
2.如权利要求1所述的黄绿蜜环菌，其特征在于在察氏培养基上，菌株生长较满，形成圆形菌落，具有辐射状沟纹；黄绿蜜环菌菌盖扁平，盖缘始终内卷，在阳光下闪闪发光，干后近白色，不粘，菌盖表皮开裂形成近环状排列的纤毛；子实体中等大，盖宽5～12cm.菌肉厚，肉质，白色至浅黄色；菌褶近直生，弯生至短延生，不等长，密，宽，黄色至菌盖色；菌柄圆柱形，长2～8cm，直径2～2.5cm，白色至黄色；菌环中位，单层，菌环以上为白色，菌环以下为黄色。
3.如权利要求1所述的黄绿蜜环菌的培养方法，其特征在于采用摇瓶发酵培养；培养基葡萄糖15～40g/L、酵母膏1～2g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.45g/L；23℃、120r/min下培养120h小时。
4.如权利要求1所述的黄绿蜜环菌的培养方法，其特征在于采用发酵罐发酵培养；培养基葡萄糖浓度31.3g/L，酵母膏浓度1.1g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.45g/L，发酵温度23℃，发酵通气量0.5L/min，发酵培养120小时。
5.如权利要求1所述的黄绿蜜环菌在发酵产胞外多糖中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种黄绿蜜环菌(Armillaria luteo－virens)ZJUQHCGMCC No.1884，在察氏培养基上，菌株生长较满，形成圆形菌落，具有辐射状沟纹；黄绿蜜环菌菌盖扁平，盖缘始终内卷；子实体中等大，盖宽5～12cm。菌肉厚，肉质，白色至浅黄色；菌褶近直生，弯生至短延生，不等长，密，宽，黄色至菌盖色；菌柄圆柱形，长2～8cm，直径2～2.5cm，白色至黄色；菌环中位，单层，菌环以上为白色，菌环以下为黄色。本发明解决了野生黄绿蜜环菌不易培养、生长速度慢、容易污染等问题，并为开发利用新型食药用食用菌菌体或代谢产物提供新思路和依据。
文档编号C12P19/00GK1986771SQ200610155189
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月13日 优先权日2006年12月13日
发明者陈启和 申请人:浙江大学