专利名称：壳寡糖/壳低聚体的专一性酶法生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种壳寡糖/壳低聚体的专一性酶法生产工艺。
背景技术：
壳寡糖是氨基葡萄糖聚合度在2≤n≥10范围的可溶性小分子壳聚糖，壳低聚体是聚合度n大于10的可溶性壳聚糖。壳寡糖与壳低聚体是壳聚糖系列应用产品的关键中间体，具备水溶性好、生物活性高、功能作用多样、易被人体吸收，在医药、食品、日化、工农业等领域具有巨大的应用前景，在国内外素有人体第六大生命要素、软黄金之美誉。
目前壳寡糖的制备主要采用化学降解法和非专一性复合酶法。采用化学法降解壳聚糖，产品壳寡糖得率低，产物分离困难，且对环境污染严重，近年已逐渐被淘汰。酶降解法具有反应条件温和，壳寡糖得率高，不造成环境污染等优点，是目前工业化降解壳聚糖生产发展的主要方向。但现有的酶法制备壳寡糖的工艺基本上是采用非专一性复合酶，如脂肪酶、淀粉酶、溶菌酶、蛋白水解酶等，主要缺点是非专一性，降解效率低，壳寡糖产品的分子量分布不均匀，生理活性不一致，达不到国内外食品、医药市场对高品质壳寡糖中间体的需求，因此严重阻碍了壳寡糖的生产、销售与应用。
发明内容
本发明的目的就是提供一种壳寡糖/壳低聚体的专一性酶法生产工艺，该工艺生产过程简单、成本低、壳寡糖得率高、壳寡糖分子大小相对均一、质量可控，且无环境污染。
本发明的壳寡糖/壳低聚体的专一性酶法生产工艺是1、首先将壳聚糖用1～2％的稀醋酸，配成1～6％的壳聚糖溶液；2、根据酶解的需要，加入饱和碳酸氢钠溶液调节pH值至5.8～6；3、加入内切壳聚糖酶进行酶解，内切壳聚糖酶加入量为1～10U/g壳聚糖，所述的内切壳聚糖酶(eCSN，分子量25KDa)是一种来源于真菌的内切壳聚糖酶，可以专一性切断壳聚糖的β-1，4糖苷键，内切壳聚糖酶制剂的型式，可以是游离状态的酶，也可以是固定化的酶，酶解反应温度在30～60℃，酶解反应时间可以为2～12小时(需要壳低聚体的分子量越小，则反应时间越长，可自行调节控制)；4、采用大孔弱酸性阳离子树脂层析柱对降解产品壳寡糖进行分离纯化，具体方法是将酶解液上样到层析柱，上样体积为5％～50％，再采用0～3mol/L氨水洗脱，或者0～3mol/L浓度的盐酸溶液洗脱，回收产品；5、反应结束后，采用筛网过滤的方法回收固定化酶，采用超滤膜过滤的方法回收游离状态的酶，可以反复利用。
本发明的壳寡糖/壳低聚体的专一性酶法生产工艺采用专一性的内切壳聚糖酶，可以对壳聚糖进行高效率的特异性降解，极大的提高了壳寡糖的得率，生产过程简单，生产成本大幅度下降，产物不含单糖(氨基葡萄糖)，有效地提高了壳寡糖产品的质量，整个生产过程为连续化生产，满足了壳寡糖产品的工业化大规模生产的要求。该工艺与化学降解或非专一性酶法降解工艺比较具有极大优势1、酶法生产的壳寡糖分子大小相对均一，质量可控；2、生产条件温和，不污染环境；3、酶法生产的壳寡糖得率高(95.9％)；4、终产品中不含单糖(氨基葡萄糖)。
具体实施例方式
实施例1将3％壳聚糖溶解于1％浓度的醋酸，以饱和碳酸氢钠溶液调节pH至5.8，按5U/g加入固定化内切壳聚糖酶制剂，固定化内切壳聚糖酶制剂由江西师范大学壳聚糖资源开发与利用项目组提供；酶解反应温度为45℃，酶解反应时间为3小时；采用筛网过滤的方法回收固定化酶，并得到酶解上清液；在大孔弱酸性阳离子树脂D155层析柱上端加入30％柱体积的酶解上清液，0～3mol/L氨水梯度洗脱，收集并用DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂检测洗脱液是否含的还原糖；洗脱液中尚未降解成壳寡糖的分子量较大的壳聚糖成分形成的白色沉淀，可以直接过滤回收，重新进行酶解；收集DNS试剂检测阳性的含壳寡糖的洗脱液，洗脱液无色透明，说明大孔弱酸性阳离子树脂D155有吸附色素的能力，故可以省去壳寡糖脱色这一纯化步骤；采用列管式薄膜蒸发器浓缩含壳寡糖的洗脱液，其中的氨为挥发性物质，可以用去离子水吸收再利用；浓缩的壳寡糖溶液喷雾或冷冻干燥，得到壳寡糖产品。
实施例2将3％壳聚糖溶解于1％浓度的醋酸，以饱和碳酸氢钠溶液调节pH至5.8，按5U/g加入游离态的内切壳聚糖酶制剂，游离态的内切壳聚糖酶制剂由江西师范大学壳聚糖资源开发与利用项目组提供；酶解反应温度为45℃，酶解反应时间为3小时；采用超滤膜过滤的方法回收游离状态的酶，并得到酶解上清液；在大孔弱酸性阳离子树脂D155层析柱上端加入30％柱体积的酶解上清液，0～3mol/L氨水梯度洗脱，收集并用DNS试剂检测洗脱液是否含的还原糖；洗脱液中尚未降解成壳寡糖的分子量较大的壳聚糖成分形成的白色沉淀，可以直接过滤回收，重新进行酶解；收集DNS试剂检测阳性的含壳寡糖的洗脱液，洗脱液无色透明，说明大孔弱酸性阳离子树脂D155有吸附色素的能力，故可以省去壳寡糖脱色这一纯化步骤；采用列管式薄膜蒸发器浓缩含壳寡糖的洗脱液，其中的氨为挥发性物质，可以用去离子水吸收再利用；浓缩的壳寡糖溶液喷雾或冷冻干燥，得到壳寡糖产品。
权利要求
1.一种壳寡糖/壳低聚体的专一性酶法生产工艺，其特征在于它包括以下步骤(1)、首先将壳聚糖用1～2％的稀醋酸，配成1～6％的壳聚糖溶液；(2)、根据酶解的需要，加入饱和碳酸氢钠溶液调节pH值至5.8～6；(3)、加入内切壳聚糖酶进行酶解，内切壳聚糖酶加入量为1～10U/g壳聚糖，酶解反应温度在30～60℃，酶解反应时间可以为2～12小时；(4)、采用大孔弱酸性阳离子树脂层析柱对降解产品壳寡糖进行分离纯化，将酶解液上样到层析柱，上样体积为5％～50％，再采用0～3mol/L氨水洗脱，或者0～3mol/L浓度的盐酸溶液洗脱，回收产品；(5)、反应结束后，采用筛网过滤回收固定化酶，采用超滤膜过滤回收游离状态的酶。
2.根据权利要求1所述的壳寡糖/壳低聚体的专一性酶法生产工艺，其特征在于所述的内切壳聚糖酶是eCSN，分子量为25KDa。
3.根据权利要求1或2所述的壳寡糖/壳低聚体的专一性酶法生产工艺，其特征在于所述内切壳聚糖酶的制剂型式是游离状态酶或固定化酶。
全文摘要
一种壳寡糖/壳低聚体的专一性酶法生产工艺，该工艺是首先将壳聚糖配成1～6％的壳聚糖溶液，再加入饱和碳酸氢钠溶液调节pH值，之后加入内切壳聚糖酶进行酶解，然后采用大孔弱酸性阳离子树脂层析柱对降解产品壳寡糖进行分离纯化，反应结束后，采用筛网过滤的方法回收固定化酶，采用超滤膜过滤的方法回收游离状态的酶，可以反复利用。本发明的工艺可以对壳聚糖进行高效率的特异性降解，极大的提高了壳寡糖的得率，生产过程简单，生产成本大幅度下降，产物不含单糖(氨基葡萄糖)，有效地提高了壳寡糖产品的质量，整个生产过程为连续化生产，满足了壳寡糖产品的工业化大规模生产的要求。
文档编号C12P19/00GK101024850SQ20061016659
公开日2007年8月29日 申请日期2006年12月27日 优先权日2006年12月27日
发明者王曼莹, 游清徽 申请人:江西师范大学