检测bk病毒的方法和组合物的制作方法

专利名称：检测bk病毒的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及BK病毒的检测。 交叉引用本申请要求2005年8月2日提交的美国临时申请60/705,217号和2005年 10月6日提交的美国专利申请11/246,904号的权益，这些申请通过引用其全部内 容并入本文。
背景技术：
人多瘤病毒BK型(Human polymavirus type BK)(BK病毒)是具有大约 5,300bp的环状双链DNA基因组的无包被病毒。在1971年，BK病毒在从肾移植 受体的尿中分离后，被首次承认为多瘤病毒家族的成员。随后的研究表明，全世 界成人的血清阳性率为80%以上。 一般地，BK病毒的原发感染在儿童时期通过呼 吸道发生，随后病毒潜伏在泌尿生殖道中。尿中病毒的无症状再活化和间歇性脱 落在具有免疫能力的人中自然发生，但是在那些细胞免疫改变的人如孕妇、正在 接收化疗的癌症患者、感染HIV-1的个体和肾或其它同种异体移植的受体中频率 更高。BK病毒感染引起的明显临床疾病很少，并且与免疫抑制的程度明显相关。
BK病毒相关性肾病已经越来越多地被认为是肾移植患者肾功能障碍的原 因。根据回顾性研究，在l-5y。的肾移植受体中发生BK病毒性肾病，在多达45% 的被感染患者中发生同种异体移植功能损耗。尽管得不到BK病毒特异性的抗病毒 治疗，但在一些情况下，可以通过降低维持免疫抑制的水平控制BK病毒复制。最 近的证据表明，BK病毒DNA的检测紧密跟随BK病毒性肾病的过程，并且可以 作为用于诊断和监测的非侵入性手段。因此，肾移植患者的BK病毒负荷的定量化 对于诊断BK病毒性肾病和监测对治疗的反应即免疫抑制的减低二者，都将是有用 的。另外，BK病毒涉及了其它疾病，如前列腺癌。因此，需要开发出可靠的诊断试验，以便以能够检测低滴度的病毒的灵敏 度来检测BK病毒，以及用于检测不同的BK病毒基因型。另外，需要可靠的诊断 试验，以便区分BK病毒和其它多瘤病毒如JC病毒。这样的检测对于防止病毒通 过血液和血浆衍生物或者通过密切的身体接触传播是重要的。本发明致力于这些 需要。文献值得注意的文献包括美国专利5,213,796号；6,605,602号；WO 92/19774; Watzinger等，Journal of Clinical Microbiology, 42(11): 5189-5198 (2004); Anna Marta Degener等，J Medical Virology 58:413 (1999);和Stoner等，American J of Kidney Diseases. 33:1102 (2002)。
发明概述本发明提供了用于快速、灵敏和高度特异性地基于核酸(例如，基于DNA) 检测样品中的BK病毒的方法和组合物。 一般地，所述方法涉及检测具有BK病毒 基因组保守区域的靶序列的靶核酸。本发明也表征了用于本发明方法的组合物和 试剂盒，所述组合物包括引物、探针。本发明的一个优点是，它提供用于BK病毒的检测，同时避免了遗传上密 切相关的病毒的检测。因此，本发明减少了假阳性的发生。本发明的另一个优点是，它减少了可以由于不能检测BK病毒的遗传变体
(如，不同基因型或者毒株的BK病毒)而导致的假阴性结果的发生。另一个优点是，本发明包括只需要检测相对短的靶序列的实施方式。这对
利用基于扩增的技术如实时PCR的检测可以具有特别的优势。本发明可以被发展为检验(assays)或者制造为试剂盒，以在相关实验室或者
医院中用于诊断BK病毒。所述检验也可以在用于治疗BKV感染导致的疾病的治
疗药物的开发和临床实验中使用。这些优点和其它优点对于阅读本说明书后的普通技术人员来说将是显而易 见的。
附图简述

图1A-图1AAA显示了 32个BK病毒基因型的核酸序列的比对。用于检测 根据本发明的BK病毒(BKV)的靶核酸区域一所述区域被命名为BK1、 BK2、 BK3、 BK4和BK5(本文也分别称为靶区域I、 II、 III、 IV和V)，如以下划线字体和起始 及结束箭头表示。图右侧的编号系统表示各基因型的序列编号一其根据各基因型的各自的 Genbank登录号(GenBank Accession Numbers),或者被测序基因组的编号。如没有 另外说明，本文对序列编号的所有引用都是基于Genbank登录号AY628224的序 列编号。适合用于本发明方法的靶区域I-V中的示例性引物和探针用黑体表示。适 合用于本发明的探针包括位于用两条选择引物(selected primer)产生的扩增产物序 列中的任何序列。图2是显示BK1、 BK2、 BK3、 BK4和BK5中的每一个的Taqman实时检测的标准曲线的图。模板浓度范围是每个反应50个拷贝至每个反应50,000个拷贝。 一式两份进行所有检测。对于BK1检测斜率=-3.58，截距=43.428， R2 =0.997。 对于BK2检领ij:斜率=-3.48，截距=44.053， R2 =0.999。对于BK3检领lj:斜率=-3.49， 截距=44.819， R2 =0.999。对于BK4检测斜率=-3.21,截距=41.466, R2 =0.999。 对于BK5检测斜率=-3.61,截距=47.324， R2 =0.994。
定义如本文所用的术语"BK病毒"或者"BKV"指来自与肾病和肾功能障碍相 关的多瘤病毒家族的病毒。BK病毒是小的无包被病毒，其基因组包括大约5,300 bp 的环状、双链DNA分子。术语"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核酸"和"核酸分子"在本文中可 互换使用，包括聚合形式的核苷酸，或是核糖核苷酸或是脱氧核糖核苷酸。该术 语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链DNA，以及三链、 双链和单链RNA。其也包括修饰，如通过甲基化和/或通过加帽，和未修饰形式的 多核苷酸。更具体地，术语"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核酸"和"核酸分 子"包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)、 为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷的任何其它形式的多核苷酸、和含有非核苷 酸骨架的其它聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸(PNAs))和聚吗啉(可商业得自 Anti-Virals,Inc.,CorvaIlis，Oreg.，为Neugene)聚合物、和其它合成的序列特异性核 酸聚合物一只要这些聚合物含有处于允许碱基配对和碱基堆积的构型中的核碱 基，如在DNA和RNA中所见的。除非另外具体说明，术语"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核酸"和"核 酸分子"在长度上没有预期的不同，并且这些术语将被相互交换使用。这些术语 仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括，例如，3'-脱氧-2'，5'-DNA、寡脱氧核 糖核苷酸N3'P5'氨基磷酸酯、2'-0-烷基取代的RNA、双链和单链DNA、以及双链 和单链RNA、 DNA: RNA杂合体(hybrids)、和PNAs与DNA或者RNA之间的杂 合体；也包括已知类型的修饰，如本领域已知的标记，甲基化，"帽"，用类似 物取代一个或多个天然发生的核苷酸，核苷酸间修饰如，例如那些带有不带电的 连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带有负电荷连 接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、和带有正电荷连接(例如，氨烷基氨基 磷酸酯、氨烷基磷酸三酯)的修饰，那些含有悬垂部分(pendantmoieties)如例如蛋白 质(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)的修饰，那些具有嵌入剂(例 如，吖啶、补骨脂素等)的修饰，那些含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、 氧化性金属等)的修饰，那些含有烷化剂的修饰，那些具有修饰连接(例如，a端基 异构核酸等)的修饰；以及未修饰形式的多核苷酸或寡核苷酸。特别地，DNA是脱 氧核糖核酸。
在整个说明书中，应用縮写指代核苷酸(也指代为碱基)，其包括指代多个核 苷酸的縮写。如本文所用，0=鸟嘌呤，八=腺嘌呤，丁=胸腺嘧啶，C-胞啼啶、和 11=尿嘧啶。另外，R-嘌呤核苷酸(A或者G); Y^密啶核苷酸(A或者T(U)); S=C 或者G; W^A或者T(U); M-A或者C; K=G或者T(U); V=A、 C或者G;和 N—壬何核苷酸(A、 T(U)、 C或者G)。各处的核苷酸可以应用小写字母或大写字母 表示。也理解，在说明书中，提供用于DNA的核苷酸序列也代表RNA的核苷酸 序列，其中T替换为U。如本文所用的术语"脱氧核糖核酸"和"DNA"意味着由脱氧核糖核苷酸 组成的聚合物。如本文所用的术语"核糖核酸"和"RNA"指由核糖核苷酸组成的聚合物。 其中核酸序列用DNA序列的核苷酸提供，可以理解，这样的序列包括互补DNA 序列，也进一步包括基于给出的DNA序列或者其互补序列的RNA序列，其中尿 嘧啶(U)取代了 DNA序列或其互补序列中胸腺嘧啶(T)。当其分子共享碱基对结构同源性时，两个核苷酸序列是彼此"互补的"。"互 补的"核苷酸序列在合适的杂交条件下将会特异地结合形成稳定的双链体。例如， 当部分第一序列能够以反向平行方向结合到部分第二序列，其中每条序列的3'-端 结合到另一序列的5'-端并且随后一条序列的每个A、 T(U)、 G和C分别匹配另一 序列的T(U)、 A、 C和G时，则两条序列是互补的。RNA序列也可以包括互补的 G^或者l^G碱基对。因此，在本发明下，两条序列不必具有完全的同源性以便 是"互补的"。通常，当在规定长度的分子中，至少大约85%(优选地，至少大约 卯％，最优选地，至少大约95%)的核苷酸具有碱基对结构时，两条序列充分互补。
如本文所用，术语"分离的"当用在分离化合物的情况下时，是指目标化 合物处于与该化合物在其中天然发生的环境不同的环境中。"分离的"意味着包括 大量富含目标化合物、和/或者其中目标化合物被部分或者基本纯化的样品内的化 合物。术语"分离的"包括这样的情况其中所述材料不伴有在其天然状态下通 常与之结合的至少一些材料，优选地，构成给定样品总蛋白重量的至少大约0.5%， 更优选地，至少大约5%。例如，关于多核苷酸的术语"分离的" 一般是指，完全 或者部分地缺乏通常在天然状态下与其结合的序列的核酸分子；或者如其天然存 在、但具有与其结合的异源序列的序列；或者从染色体解离的分子。
如本文的所用的"纯化的"意味着，所述材料包括总材料重量的至少大约 75%，优选至少大约80%，特别优选至少大约90%。如本文所用，术语"基本纯 的"是指化合物从其天然环境移去并且至少60%、优选75%、和更优选90%不含 有与其天然结合的其它成分。"衍生自"或者"特异于(对…具有特异性)"指定序列一如靶核酸的靶序列 一的多核苷酸是指这样的多核苷酸序列，其包括与指定的核苷酸序列的区域对应， 即相同或者互补的大约至少约6个核苷酸，优选地，至少大约8个核苷酸，更优选地，至少大约10-12个核苷酸，甚至更优选地，至少大约15-20个核苷酸的连续 序列。衍生的多核苷酸不必物理上来自目标核苷酸序列，而是可以以许多方式产 生，包括但不限于化学合成、复制、反转录或者转录，这基于该多核苷酸从其衍 生的区域或对其具有特异性的区域(一个或多个)中的碱基序列提供的信息。"衍生 自"或者"特异于"指定序列的多核苷酸包括相对于原始多核苷酸为有义或者反 义取向的多核苷酸。"同源性"指两个多核苷酸或者两个多肽部分之间的相似性百分数。当两 个DNA或者两个多肽序列在限定长度的分子上显示至少大约50%，优选地至少大 约75%，更优选地至少大约80%，至少大约85%，优选地至少大约90%，最优选 地至少大约95%或者至少大约98%的序列相似性时，所述序列是彼此"基本上同 源的"。如本文所述，基本上同源也指序列显示出与指定的DNA或者多肽序列完 全的同一性。 —般，"同一性"是指两个多核苷酸或者多肽序列分别具有精确的核苷酸-核苷酸或者氨基酸-氨基酸一致性。同一性百分数可以通过比对序列进行两个分子 之间的序列信息的直接比较，计数两个比对序列之间的匹配的精确数目，除以较 短序列的长度、和将结果乘以100来确定。在同源性和同一性分析中，可以使用容易获得的计算机程序加以辅助，如 来自DNASTAR， Inc.的Lasergene，禾卩ALIGN, Dayhoff， M. O.， Atlas of Protein Sequence and Structure M. 0. Dayhoff ed.， 5 Suppl. 3:353-358， National biomedical Research Foundation, Washington, DC，其采用Smith and Waterman Advance， Appl. Math. 2:482-489, 1981的局部同源性算法进行肽分析。确定核苷酸序列同源性的程 序可在Wisconsin序歹U分析软件包版本8( Wisconsin Sequence Analysis Package Version 8，从Genetics Computer Group, Madison， Wis.获得)中获得，例如，BESTFIT、 FASTA和GAP程序，它们也依赖于Smith and Waterman算法。这些程序容易应 用制造商推荐的和在上述Wisconsin序列分析软件包中描述的缺省参数而使用。 例如，用Smith and Waterman同源性算法和缺省评分表和六核苷酸位置(six nucleotidepositions)空位罚分，可以确定特定核苷酸序列与参照序列的同源性百分 数。在本发明的背景中，确立同源性百分数的另一方法是用MPSRCH程序包， University of Edinburgh拥有其版权，由John F. Collins和Shane S. Sturrok开发，由 IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, Calif.)分销。依据该组程序包，可以使用 Smith-Waterman算法，其中评分表使用缺省参数(例如，空位开放罚分12，空位延 伸罚分1和空位(gap)6)。从所产生的数据，"匹配"值反映了"序列同源性"。用于计 算序列之间的同一性或者相似性百分数的其它合适的程序在本领域中一般是已知 的，例如，另一个比对程序是使用缺省参数的BLAST。例如，可以用以下缺省参 数使用BLASTN和BLASTP:遗传密码=标准，过滤器(filter"无，链=双链，截断(cutof;t)=60，期望(expect)-10，矩阵二BLOSUM62，描述(Descriptions)-50个序列， 筛选(sort by"高分，数据库-非冗余的，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。这些程序的细节可以在因特网上、 在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 和美国国立医学图书馆(National Library of Medicine)主办的网站上找到(见万维网 站ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST)。可选地，通过在同源区域之间形成稳定双链体的条件下杂交多核苷酸，接 着通过用单链特异性核酸酶(一种或者多种)消化，和确定消化片段的大小，可以确 定同源性。基本同源的DNA序列可以在例如，该具体系统规定的严格条件下、以 DNA杂交(Sourthernhybridization)实验鉴定。限定合适的杂交条件在本领域的技术 范围内。参见例如，Sambrook等人，见上；DNA Cloning,见上；Nucleic Acid Hybridization见上。如本文所用描述核酸分子的"重组的"是指，根据其来源或者操作，或者 二者，基因组多核苷酸、cDNA多核苷酸、哺乳动物多核苷酸、细菌多核苷酸、病 毒多核苷酸、半合成多核苷酸、合成多核苷酸或者其它来源的多核苷酸不与在天 然状态下与其结合的全部或者部分多核苷酸结合。如针对蛋白或者多肽所用的术 语"重组的"是指通过重组多核苷酸的表达产生的多肽。
"控制元件"是指帮助与其连接的核苷酸序列的转录和/或者翻译的多核苷 酸序列。该术语包括启动子、转录终止序列、上游调节域、聚腺苷酸化信号、非 翻译区包括5'-UTRs和3'-UTRs、和适当时包括前导序列和增强子，其共同提供用 于宿主细胞中编码序列的转录和翻译或者协助宿主细胞中编码序列的转录和翻 译。"依赖DNA的DNA聚合酶"是从DNA模板合成互补DNA拷贝的酶。例 子包括来自大肠杆菌(E. cdi)的DNA聚合酶I和噬菌体T7 DNA聚合酶。所有已知 的依赖DNA的DNA聚合酶需要互补引物来起始合成。在合适的条件下，依赖DNA 的DNA聚合酶可以从RNA模板合成互补的DNA拷贝。如本文所述，术语"耙核酸区域"或者"靶核酸"或者"靶分子"是指具 有待检测(例如，通过扩增)的"靶序列"的核酸分子。靶核酸可以是单链的或者双 链的，并且可以包括或者可以不包括除靶序列之外的其它序列(例如，靶核酸可以 包括或者可以不包括上游核酸序列或者5'侧翼序列，可以包括或者可以不包括下 游序列或者3'侧翼序列，在一些实施方式中，可以不包括相对于靶序列为上游(5') 或者下游(3')的核酸序列)。当采用扩增检测时，靶序列以外的这些其它的序列可 以随耙序列扩增或者可以不随靶序列扩增。术语"耙序列"或者"靶核酸序列"指待检测(例如，通过扩增)的靶核酸的 特定核苷酸序列。靶序列可以包括靶分子内包含的探针杂交区域，探针与该区域 在期望的条件下会形成稳定的杂合体。"靶序列"也可以包括寡核苷酸引物与其复合并以靶序列作为模板被延伸的复合序列(complexing sequence)。当靶核酸为单链 时，术语"靶序列"也指与如存在于靶核酸中的"靶序列"互补的序列。如果"耙 核酸"最初是双链的，术语"靶序列"是指正链(+)和负链(-)。本发明也考虑具有 本文提供的序列全长的靶区域，以及这样的靶区域的片段或者子序列，和其互补 序列。术语"片段"和"子序列"在该情况下可互换。而且，在本文提供"靶序 列"的序列时，可以理解，该序列可以是DNA或者RNA。因此，在提供DNA序 列时，RNA序列也被考虑，并且通过用"U"取代DNA序列的"T"以提供RNA 序列而被容易地提供。如本文所用的术语"引物"或者"寡核苷酸引物"是指，在被置于其中引 物延伸产物的合成被诱导的条件下时，例如，在核苷酸和聚合-诱导剂如DNA或 者RNA聚合酶存在和在合适的温度、pH、金属浓度和盐浓度下，发挥作用以起始 互补核酸链的合成的寡核苷酸。引物的长度一般是与其在引物延伸产物合成中的 应用相适合的长度，长度范围通常在8至100个核苷酸之间，如10至75、 15至 60、 15至40、 18至30、 20至40、 21至50、 22至45、 25至40等，更典型地， 在18-40、 20-35、 21-30个核苷酸长的范围，和在所述范围之间的任何长度。典型 地，引物可以是10-50个核苷酸长的范围，如15-45、 18-40、 20-30、 21-25等，以 及在所述范围之间的任何长度。在一些实施方式中，引物通常不超过大约IO、 12、 15、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65或者70个核苷酸的长度。为了获得最大的扩增效率，引物通常是单链的，但是可以可选地是双链的。 如果引物是双链的，在用于制备延伸产物之前，引物通常首先被处理以分开其链。 该变性步骤典型地通过热引起，但可以可选地用碱进行，随后中和。因此，"引物" 与模板互补，并且通过氢键或者杂交与模板复合以形成引物/模板复合物，用于起 始通过聚合酶的合成，在DNA合成过程中，引物通过添加共价结合的碱基而延伸， 所述碱基在其3'端连接，与模板互补。本文所用的"引物对"是指具有适合于靶核酸的基于核酸扩增的核酸序列 的第一引物和第二引物。这样的引物对一般包括第一引物一其具有与靶核酸的第 一部分序列相同或者相似的序列，和第二引物一其具有与靶核酸的第二部分互补 的序列，以提供用于扩增靶核酸或者其片段。除非另外特别指出，本文对于"第 一"和"第二"引物的引用是随意的。例如，第一引物可以被设计为"正向引物" (其引发从靶核酸的5'端的核酸合成)或者"反向引物"(其引发从正向引物引发的 合成产生的延伸产物从5'端的核酸合成)。同样，第二引物可以被设计为正向引物 或者反向引物。如本文所用，本文可互换使用的术语"探针"或者"寡核苷酸探针"是指 由如上定义的多核苷酸构成的结构，其含有与靶核酸序列分析物(例如，核酸扩增 产物)中存在的核酸序列互补的核酸序列。探针的多核苷酸区域可以由DNA和/或RNA和/或合成的核苷酸类似物构成。探针一般具有与其在靶核酸的所有或部分靶 序列的具体检测中的应用相适应的长度，其范围通常在8至100个核苷酸长度之 间，如8至75、 10至74、 12至72、 15至60、 15至40、 18至30、 20至40、 21 至50、 22至45、 25至40等，更典型的在18-40、 20-35、 21-30个核苷酸长之间 的范围，和在上述范围之间的任何长度。典型的探针是10-50个核苷酸长之间的范 围，如15-45、 18-40、 20-30、 21-28、 22-25等，以及在所述范围之间的任何长度。 在一些实施方式中，引物通常不超过大约10、 12、 15、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65或者70个核苷酸的长度。
本文考虑的探针包括含有可检测标记的探针。例如，当"寡核苷酸探针" 被用于5'核酸酶分析如TaqManTM分析时，所述探针包括至少一种荧光剂和至少一 种被反应中使用的聚合酶的5'内切核酸酶活性消化的猝灭剂，以检测任何扩增的靶 寡核苷酸序列。在这种情况下，寡核苷酸探针将具有足够数目的邻近其5'端的磷酸 二酯键，这样所应用的5'到3'核酸酶活性能够有效地降解所结合的探针，以分离荧 光剂和猝灭剂。当寡核苷酸探针用于TMA技术时，它将被适当地标记，如下所述。
如本文所述，术语"标记"和"可检测标记"指能够检测的分子，包括但 不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、 酶抑制剂、生色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素、亲和素、 链霉亲和素或半抗原)等。术语"荧光剂(fluorescer)"是指能够显示可检测范围荧
光的物质或者其部分。术语"杂交"(hybridize)和"杂交"(hybridization)是指，在通过Watson-Crick
碱基配对充分互补形成复合物的核苷酸序列之间形成复合物。当引物与靶(模板) "杂交"时，这样的复合物(或者杂合体)足够稳定以发挥如DNA聚合酶起始DNA
合成所需的引发功能。术语"严格条件"是指这样的条件在该条件下，引物将优选地与其互补 结合配偶体(partner)杂交或特异性结合，并较少程度地与其它序列杂交或结合、或 者根本不与其它序列杂交或结合。换言之，本文所用的术语"严格杂交条件"是
指这样的条件其适合于在互补结合成员之间一例如，在探针和样品中的互补靶 之间一的阵列(array)表面上产生双链体，例如，核酸探针双链体，如DNA探针和 样品中存在的它们的相应核酸靶，例如，样品中存在的它们相应的mRNA分析物。
如本文所用，术语"结合对"是指彼此特异性结合的第一分子和第二分子， 如能够形成核酸双链体的互补多核苷酸对。结合对的第一成员与样品中结合对的 第二成员的"特异性结合"通过第一成员以比对样品中其它成分的结合更大的亲
和力和特异性结合于第二成员而证明，或者反之亦然。结合对成员之间的结合一 般是非共价的。"选择性结合"意味着，分子优选地结合到目标靶或者以比与其它分子的 结合更大的亲和力结合到靶上。例如，DNA分子会结合到基本互补的序列但不会结合到非相关序列。在核酸杂交情况下(例如，如在阵列，DNA杂交或者RNA杂交中)，"严格 杂交"和"严格杂交洗脱条件"是序列依赖性的，在不同的环境参数下是不同的。能 够用于鉴定本发明的范围内的核酸的严格杂交条件可以包括，例如，在包括50% 甲酰胺、5xSSC和1% SDS的缓冲液中在42'C下杂交，或者在包括5xSSC和1% SDS 的缓冲液中在65'C下杂交，二者都用0.2xSSC和0.1。/。 SDS在65'C下洗脱。示范 性严格杂交条件也可以包括在40%甲酰胺、1 MNaCl和P/。SDS的缓冲液中在37'C 下杂交，并在lxSSC中在45r下洗脱。可选地，可以采用在0.5MNaHPO4、 7% 十二垸基硫酸钠(SDS)、 1 mnM EDTA中在65。C下与滤膜上结合的DNA杂交，并 在O.lxSSC/0.1% SDS中在68。C下洗脱。再其它的严格杂交条件包括在60'C或者 更高的温度下和3xSSC (450 mM氯化钠/45 mM柠檬酸钠)中杂交或者在42'C下在 含有30%甲酰胺、1MNaCl、 0.5%肌氨酸钠、50mMMES， pH6.5的溶液中温育。 本领域普通技术人员将容易知道，可以利用可选而相当的杂交和洗脱条件以提供 相似严格性的条件。在某些实施方式中，洗脱条件的严格性阐明了确定核酸是否与探针特异性 杂交的条件。用于鉴定核酸的洗脱条件可以包括，例如pH 7、盐浓度大约0.02 摩尔、和温度至少大约5(TC或者大约55'C到大约6(TC;或者，盐浓度为大约0.15 MNaCl、 72'C，进行大约15分钟；或者，盐浓度大约为0.2xSSC，温度至少大约 50'C或者大约55'C到大约60°C ，进行大约15到大约20分钟；或者，用具有含0.1% SDS的大约2xSSC盐浓度的溶液在室温下洗脱杂交复合物15分钟两次，随后用含 有0.1。/。SDS的0.1xSSC在68'C下洗脱15分钟2次；或者等同条件。用于洗脱的 严格条件也可以是，例如，在42'C下、0.2xSSC/0.1% SDS。在核酸分子是脱氧寡 核苷酸("寡核苷酸(oligos)")的情况下，严格条件可以包括，在6xSSC/0.05n/。焦磷酸 钠中在37'C下(对14个碱基的寡核苷酸)、48'C下(对17个碱基的寡核苷酸)、55'C 下(对20个碱基的寡核苷酸)和6(TC下(对23个碱基的寡核苷酸)洗脱。等同的杂交 和洗脱条件和试剂与缓冲液如SSC缓冲液和等同的试剂和条件的详细描述参见 Sambrook、 Ausubel或者Tijssen (下文引用)。严格杂交条件是至少如上述代表性条件那样严格的杂交条件，其中如果杂 交条件具有上述具体的严格条件的至少大约80%，典型地至少大约90%的严格性，
则认为该条件是至少严格的。其它的严格杂交条件是本领域已知的，也可以被适 当采用。双链DNA的"解链温度"或者"Tm"被定义为，由于热或者例如通过酸 或碱处理或类似处理造成的碱基对之间氢键的其它解离，失去一半DNA螺旋结构 时的温度。DNA分子的Tm依赖于其长度和其碱基组成。富含GC碱基对的DNA 分子比那些具有大量AT碱基对的DNA分子具有更高的Tm。当温度降低到Tm以 下时，分开的DNA互补链自发地重缔合或者退火形成双链DNA。最高的核酸杂交率发生在低于Tm大约25摄氏度下。Tm可以用以下关系式估计Tm =69.3+0.41 (GC)。/。(Marmur等人，(1962) ， J. Mol. Biol. 5:109-118)。如本文所用，"生物样品"是指从对象分离的组织或者流体样品，其在本发 明的背景下， 一般是指被怀疑为含有BK病毒的核酸和/或病毒颗粒的样品，该样 品在任选地操作后，可以在体外试验中进行分析。典型的目标样品包括但不限于， 呼吸道分泌物(例如，从鼻道、肺等的流体或组织获得的样品)、血液、血浆、血清、 血细胞、脑脊液、粪便物、尿、眼泪、唾液、乳、器官、活组织检査和肠道与呼 吸道的分泌物。样品也包括体外细胞培养物组分样品，其包括但不限于由培养基 中的细胞和组织生长得到的条件培养基，例如重组细胞和细胞组分。
术语"评价"包括任何形式的测定，并包括确定一个要素存在与否。术语 "确定"、"测定"、"评估"、"评价"和"检测(分析，试验)"可互换使用，包括定 量和定性测定。评价可以是相对的或者绝对的。"评价存在"包括确定存在物的量， 和/或确定其存在与否。如本文所用，术语"确定"、"测定"和"评价"和"检测(分 析，试验)"可互换使用，并包括定量和定性测定。在涉及基于核酸扩增靶序列的方法的背景下，术语"参照范围"是指来自 BK病毒明性祥品的Ct (循环阀值)值的范围，其代表了被认为表明样品(例如，患 者样品)是BK病毒阴性的结果。在涉及基于核酸扩增靶序列的方法的背景下，术语"报告范围"指BK病 毒阳性样品产生的Ct僮的范国，其代表了被报告为BK病毒阳性患者样品的结果。
如本文所用的"检测特异性"是指检测系统特异性地检测靶病毒、和不检 测其它相关病毒或者正被验证的样本类型中发现的病原或者共生群系(flora)的能 力。例如，关于利用BK病毒引物和探针进行检测的"检测特异性"是指，检测系 统特异性地扩增和检测靶病毒和不检测其它相关病毒或者正被验证的样本类型中 发现的病原或者共生群系的能力。在涉及基于核酸扩增耙序列的方法的背景下，"检测灵敏度"是指对每个被
验证的样品类型，能够被检测的BK病毒靶DNA的最低可检测量。"精密度"是指检测对给定样品能够重复产生相同或者相当的结果的能力。"准确度"是指检测正确地测定含有阳性和阴性二种样品的盲组(blinded
panel)中的靶分子的能力。进一步指出的是，可以起草权利要求以排除任何任选的要素。同样地，该 陈述旨在充当使用与叙述权利要求要素相关的排除性术语如"独有地"、"仅仅" 等的先行基础，或者使用"负"限定的先行基础。在进一步描述本发明前，可以理解本发明不限于所述的具体实施方式
，同 样地，当然可以变化。也可以理解，本文所用的术语仅仅是为了描述具体的实施 方式，并不意图于是限制性的，因为本发明的范围仅由所附权利要求所限制。
当值的范围被提供时，可以理解，如果上下文没有清楚地说明，在该范围的上限和下限之间的每个中间值到下限的十分位(tenth of the unit of the lower limit) 和所述范围内的任何其它陈述值或中间值，都包括在本发明内。这些较小范围的 上和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也包括在发明内，适用于所述范 围中任何特别排除的限值。当所述范围包括一个或者两个限值时，排除那些被包 括的限值的任一或者两个的范围也包括在本发明中。除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普 通技术人员通常所理解的意义相同的意义。尽管与本文所述的方法和材料相似或 者等价的任何方法和材料也可以用于本发明实践或检测，但现在描述优选的方法 和材料。本文提及的所有出版物通过引用包含在此，以便公开和描述与所引用的 出版物相关的方法和/或材料。必须注意，如本文和所附权利要求所用，除非上下文另外清楚地说明，单 数形式"一个或一种(a)"、"一个或一种(an)"和"该(the)"包括复数的所指对象。 因此，例如，对"寡核苷酸引物"的提及包括多个这样的引物，对"引物"的提 及包括指代一条或者多条引物和本领域技术人员已知的其等同物等。
本文所述的出版物被提供只是因为它们在本申请提交日之前公开。本文中 的任何出版物都不被解释为承认本发明由于现有发明而没有资格先于这些出版 物。而且，所提供的出版日期可能与实际的出版日期不同，这可能需要单独地证 实。除非另外指出，本发明的实施将利用本领域技术内的常规的化学、生物化 学、重组DNA技术和病毒学方法。这样的技术在文献中被充分地解释。例如，见 Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.); A. L丄ehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook，等 人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed.， 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)。
现在本发明将被更加详细地陈述。
发明详述本发明基于发现包括耙核酸序列(本文也称为靶序列)的BK病毒(BKV)基因 组中的共有靶核酸区域，用于具有特异性和灵敏度地检测样品、尤其是生物样品 中的BKV。特别地，检测一个或者多个靶核酸序列区域一般允许检测样品中的 BKV，而也能够区分，例如BKV与JC病毒(JCV)和/或BKV与SV40。这些检测 的特异性和简便性促进了用于一般性地测定BKV的快速、可靠和廉价的检测。本 发明在多种不同应用中具有用处，包括研究、医疗、药品开发和诊断应用。
—般地，本方法提供用于通过检测BKV基因组的靶核酸区域来检测样品如 生物样品中的BKV。本文描述了 5个这样的靶核酸区域，分别称为靶区域I-V，如图l所指明。在一些实施方式中，本方法提供用于检测样品如生物样品中的任何BKV分 离物。在这样的实施方式中，本方法通过应用相应于耙区域中的序列的引物和探 针检测靶核酸区域或其片段。适用于本发明方法的靶区域I-V内的示例性引物提供 在表1中。适用于本发明的探针包括位于用选择引物产生的扩增产物序列内的任 何序列。选择适用于这样的实施方式的探针，以便其对应于待测的不同BKV分离 物之间的共享核苷酸序列的区域。我们注意到，本文提供的序列，尤其是共有序列被提供为DNA序列。可以
理解，提供的DNA序列可以是单链的或者双链的，同样地，下文对DNA序列的
描述也旨在同时提供互补序列。现在更加详细地描述本发明的组合物和方法。
靶核酸区域通过比对不同的BKV分离基因组鉴定靶核酸序列区域。本发明提供用于通 过检测一个或者多个耙核酸区域或者其部分鉴定样品如生物样品中的BKV。 一般 地，检测通过核酸扩增进行，在一些实施方式中，随后用杂交探针检测扩增产物。 下文进一歩具体描述靶核酸区域。可以理解，由于BKV含有在病毒复制期间从其中产生RNA的双链DNA 基因组，本文所述的引物和探针包括那些具有本文所述核酸序列的引物和探针， 以及具有这些核酸序列的互补序列的引物和探针。而且，可以理解，用于本发明的引物对包括具有与本文提供的BKV序列相 同或者相似的序列的第一引物和具有与本文提供的BKV序列互补的序列的第二引 物，以便提供用于扩增本文所述的BKV靶核酸区域或者其片段(例如，第一引物 是"正向"引物和第二引物是"反向"引物)。进一步理解的是，用于本发明的引 物对也包括具有与本文提供的BKV序列互补的序列的第一引物和具有与本文提供 的BKV序列相同或者相似的序列的第二引物，以便提供用于扩增本文所述的BKV 耙核酸区域或者其片段(例如，第一引物是"反向"引物和第二引物是"正向"引 物)。也将理解，本文所述的探针的核酸序列可以与所提供的BKV序列或者其互 补序列的核酸序列相同或者相似。另外，本文所述的引物也可以被用作探针，例 如，以便检测扩增产物。 靶区域I(BK1)在一个实施方式中，本发明提供用于检测样品如生物样品中的BKV，通过 检测如下靶核酸序列区域I(图1，靶区域I(也称为BK1)，基于Genbank登录号 AY628224的编号的比对位置435-585):GCTTTACCTGCTGTAAAAGACTCTGTAAAAGACTCCTAGGTAAGTAAT (SEQ IDNO:Ol)
或者其互补序列，或者其片段实施，其中核酸的5邻3'端包含在SEQ IDNO:Ol中。 BKV基因组中的该保守序列显示在图1中的比对中。在尤其值得注意的一个实施 方式中，靶区域是靶区域I的子序列，如
CTTTACCTGCTGTAA (SEQ ID NO:55)
或者其互补序列，或者其片段。适于设计用于扩增靶区域I核酸的引物和适用于本发明方法的示例性核酸 序列在图1中用下划线字体表示。用于扩增靶区域I核酸的引物的合适序列对应于 SEQIDNO:Ol的核苷酸序列的核苷酸1-26和94-119，或其互补序列。
适用于本发明的探针可以从位于用两条选择引物产生的扩增产物序列内的 任何序列设计。用作检测耙区域I核酸的探针的合适序列对应于SEQIDNO:Ol的 核苷酸序列的核苷酸57-90,或其互补序列。在一个实施方式中，靶区域I核酸的检测包括产生SEQ ID NO:Ol的至少 151、至少145、至少140、至少135、至少130、至少125、至少120、至少115、 至少IIO、至少105、至少100、至少95、至少90、至少85、至少80、至少75、 至少70、至少65、至少60、至少55、至少50、至少45、至少40、至少35、至 少30、至少28、至少26、至少24、至少22,至少20个连续核苷酸的扩增产物。
本发明的方法可以包括单独检测耙区域I核酸或者联合检测本文所述的靶 区域II-V中的一个或多个。例如，本发明的方法可以包括检测靶区域I(BK1)和靶 区域II(BK2)，耙区域I(BK1)和靶区域III(BK3)，靶区域I(BKl)和靶区域IV(BK4)， 耙区域I(BKl)和耙区域V(BK5)，靶区域1(BK1)、靶区域H(BK2)和靶区域UI(BK3)， 靶区域I(BKl)、靶区域IV(BK4)和靶区域V(BK5)，靶区域I(BKl)、靶区域IU(BK3) 和耙区域V(BK5)等。可以理解，检测靶区域I-V的所有组合为本方法所预期。
下面更加详细地讨论示例性引物和探针。 靶区域IKBK2)在一个实施方式中，本发明提供用于检测样品如生物样品中的BKV，通过 检测如下耙核酸序列区域II(图1，靶区域II(也称为BK2),基于Genbank登录号 AY628224的编号的比对位置1418-1545):
ACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)
或者其互补序列，或者其片段实施，其中核酸的5'和3'端包含在SEQIDNO:02中。 BKV基因组中发现的这一保守序列在图1中的比对中说明。在尤其值得注意的一个实施方式中，靶区域是靶区域II的子序列，如
ACTTCTAGGCCTGTACGGGA (SEQ ID NO:56)
或者其互补序列，或者其片段。适于设计用于扩增靶区域II核酸的引物和适用于本发明方法的示例性核酸 序列在图1中用下划线字体表示。用于扩增靶区域II核酸的引物的适当序列对应 于SEQ ID NO: 02的核苷酸序列的核苷酸33-50和82-104，或其互补序列。
适用于本发明的探针可以从位于用两条选择引物产生的扩增产物序列内的 任何序列设计。用作检测靶区域II核酸的探针的合适序列对应于SEQ ID NO:02 的核苷酸序列的核苷酸52-80，或其互补序列。
在一个实施方式中，靶区域 II核酸的检测包括产生SEQIDNO:02的至少128、至少120、至少110、至少100、 至少90、至少80、至少75、至少70、至少65、至少60、至少55、至少50、至 少45、至少40、至少35、至少30、至少28、至少26、至少24、至少22,至少 20个连续核苷酸的扩增产物。本发明方法可以包括单独检测耙区域II核酸或者联合检测本文所述的耙区 域I和III-V中的一个或者多个。例如，本发明方法可以包括检测靶区域H(BK2) 和靶区域I (BK1)，靶区域11(BK2)和靶区域in(BK3)，靶区域11(BK2)和靶区域 IV(BK4)，耙区域II(BK2)和耙区域V(BK5)，耙区域I(BK1)、耙区域II(BK2)和耙 区域ni(BK3),耙区域H(BK2)、靶区域IV(BK4)和耙区域V(BK5)，或靶区域 11(BK2)、靶区域III(BK3)和靶区域V(BK5)等。可以理解，检测靶区域I-V的所有 组合为本方法所预期。下面更加详细地讨论示例性的引物和探针。 耙区域HI(BK3)在另一个实施方式中，本发明提供用于检测样品如生物样品中的BKV，通 过检测如下靶核酸序列区域III(图1 ，靶区域m(也称为BK3)，基于Genbank登录 号AY628224的编号的比对位置4097-4560):
AGCTCCACCAGGACTCCCACTCTTCTGTTCCATAGGTTGGCACCTATAA (SEQ ID NO:03)
或者其互补序列，或者其片段实施，其中核酸的5'和3'端包含在SEQ IDNO:03中。BKV基因组中的这一保守序列显示在图l三个基因组的比对中。在尤其值得注意的一个实施方式中，所述耙区域是靶区域III的子序列，如
TTGAGAATCTGCTGTTGCTTCTTCATCACTGGCAAACATATCTTCATG(SEQ IDNO:57)
或者其互补序列，或者其片段。适于设计用于扩增靶区域III核酸的引物和适用于本发明方法的示例性核酸序列在图1中用下划线字体表示。用于扩增靶区域III核酸的引物的序列对应于SEQ ID NO: 03核苷酸序列的核苷酸280-306和355-380，或其互补序列。
适用于本发明的探针能够从位于用两条选择引物产生的扩增产物序列内的任何序列设计。用作检测靶区域III核酸的探针的合适序列对应于SEQ ID NO:03的核苷酸序列的核苷酸330-354，或者其互补序列。在一个实施方式中，靶区域III核酸的检测包括产生SEQIDNO:03的至少464、至少425、至少400、至少375、至少350、至少325、至少300、至少275、至少250、至少225、至少200、至少175、至少150、至少125、至少120、至少115、至少IIO、至少100、至少95、至少卯、至少85、至少80、至少75、至少70、至少65、至少60、至少55、至少50、至少45、至少40、至少35、至少30、至少28、至少26、至少24、至少22,至少20个连续核苷酸的扩增产物。
本发明的方法可以包括单独检测靶区域III核酸或者联合检测本文所述的靶区域I-II和IV-V中的一个或者多个。例如，本发明方法可以包括检测靶区域IU(BK3)和耙区域IV(BK4)，靶区域IU(BK3)和靶区域V(BK5)，靶区域IH(BK3)和靶区域I(BKl)，靶区域m(BK3)和靶区域H(BK2)，靶区域I (BK1)、靶区域II(BK2)和靶区域IH(BK3)，耙区域m(BK3)、靶区域IV(BK4)和靶区域V(BK5)，或者靶区域m(BK3)、靶区域I (BK1)和靶区域V(BK5)等。可以理解，检测靶区域I-V的所有组合为本方法所预期。下面更加详细地讨论示例性的引物和探针。耙区域IV(BK4)在另一个实施方式中，本发明提供用于检测样品如生物样品中的BKV，通过检测如下靶核酸序列区域IV(图1，靶区域IV(也称为BK4)，基于Genbank登录号AY628224编号的比对位置612-864):
TAATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTTAA(SEQ ID NO:04)
或者其互补序列，或者其片段实施，其中核酸的5'和3'端包含在SEQ IDNO:04中。BKV基因组中的这一保守序列显示在图1三个基因组的比对中。在尤其值得注意的一个实施方式中，靶区域是靶区域IV的子序列，如
CTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGG(SEQ ID NO:58)
或者其互补序列，或者其片段。适于设计用于扩增靶区域IV核酸的引物和适用于本发明方法的示例性核酸序列在图1中用下划线字体表示。用于扩增耙区域IV核酸的合适引物的序列对应于SEQ ID NO: 04的核苷酸序列的核苷酸1-19和76-95，或其互补序列。
适用于本发明的探针可以从位于用两条选择引物产生的扩增产物序列内的任何序列设计。用作检测靶区域IV核酸的探针的合适序列对应于SEQ ID NO:04的核苷酸序列的核苷酸36-62，或其互补序列。在一个实施方式中，靶区域IV核酸的检测包括产生SEQ ID NO:04的至少253、至少250、至少225、至少200、至少175、至少150、至少125、至少120、至少115、至少IIO、至少IOO、至少95、至少90、至少85、至少80、至少75、至少70、至少65、至少60、至少55、至少50、至少45、至少40、至少35、至少30、至少28、至少26、至少24、至少22,至少20个连续核苷酸的扩增产物。
本发明的方法可以包括单独检测靶区域IV核酸或者联合检测本文所述的耙区域I-III和V中的一个或者多个。例如，本发明的方法可以包括检测靶区域IV(BK4)和耙区域I(BKl)，靶区域IV(BK4)和靶区域H(BK2)，靶区域IV(BK4)和靶区域III (BK3)，靶区域IV(BK4)和靶区域V(BK5),靶区域I (BK1)、靶区域I1 (BK2)和靶区域IV(BK4)，靶区域III(BK3)、靶区域IV(BK4)和靶区域V(BK5)，或者靶区域I (BK1)、耙区域IV (BK4)和耙区域V(BK5)等。可以理解，检测靶区域I-V的所有组合为本方法所预期。下面更加详细地讨论示例性的引物和探针。耙区域V在另一个实施方式中，本发明提供用于检测样品如生物样品中的BKV，通过检测如下靶核酸序列区域V(图1，靶区域V(也称为BK5)，基于Genbank登录号AY628224编号的比对位置2810-2895):
CTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC(SEQ ID NO:05)或者其互补序列，或者其片段，其中核酸的5'和3'端包含在SEQ ID NO:05中。BKV
基因组中的这一保守序列显示在图1三个基因组的比对中。在尤其值得注意的一个实施方式中，耙区域是耙区域V的子序列，如
TTGATCCATGTC (SEQ ID NO:59)
或者其互补序列，或者其片段。
适于设计用于扩增靶区域V核酸的引物和适用于本发明方法的示例性核酸序列在图1中用下划线字体表示。用于扩增靶区域V核酸的合适引物的序列对应于SEQ ID NO: 05的核苷酸序列的核苷酸2-18和47-64，或其互补序列。
适用于本发明的探针可以从位于用两条选择引物产生的扩增产物序列内的任何序列设计。用作检测靶区域V核酸的探针的合适序列对应于SEQ ID NO:05的核苷酸序列的核苷酸19-41，或其互补序列。在一个实施方式中，靶区域V核酸的检测包括产生SEQIDNO:05的至少86、至少80、至少75、至少70、至少65、至少60、至少55、至少50、至少45、至少40、至少35、至少30、至少28、至少26、至少24、至少22,至少20个连
续核苷酸的扩增产物。本发明的方法可以包括单独检测耙区域V核酸或者联合检测本文所述的靶区域I-IV中的一个或者多个。例如，本发明方法可以包括检测靶区域V(BK5)和靶区域I (BK1)，靶区域V(BK5)和靶区域11(BK2)，靶区域V(BK5)和靶区域III(BK3)，耙区域IV(BK4)和耙区域V(BK5)，耙区域V(BK5)、耙区域II (BK2)禾口靶区域III(BK3)，耙区域III(BK3)、耙区域IV(BK4)和靶区域V(BK5)，或者靶区域I(BK1)、耙区域III (BK3)和耙区域V(BK5)等。可以理解，检测靶区域I-V的所有组合为本方法所预期。下面更加详细地讨论示例性的引物和探针。引物和探针如上述，耙核酸序列区域I-V是不同的BKV基因型中的保守核酸区域。用于这些检测的引物和探针优选地来自如上述的靶核酸序列区域I-V。在一个尤其值得注意的实施方式中，本检测使用的引物和探针从靶核酸序列区域I-V的高度保守的核苷酸序列设计。 —般地，引物提供用于扩增靶核酸以产生靶核酸扩增产物(也称为"扩增子")。引物可以，并且优选地与探针结合使用。5'引物一般结合到一个区域以提供用于耙核酸的扩增，并且优选地结合到靶序列的5'部分，如图1所示。3'引物一般结合到与从5'引物延伸产生的核酸的3'部分互补的序列，如图1所示。5'和3'引物可以被大约IO、 20、 30或者40个相邻的核苷酸、通常是大约30个相邻的核苷酸分开。在某些实施方式中，设计引物以便具有与靶区域序列中的一个或多个变异核苷酸互补的序列，和/或具有与靶区域序列的变异核苷酸相邻的3端。 一般地，设计探针以便具有与靶区域序列内的一个或多个变异核苷酸互补的序列。在一些涉及基于扩增的检测的实施方式中，设计探针以便具有与下述序列互补的序列所述序列的侧翼是与用于扩增的一条或者多条引物互补的序列。
本文检测中应用的引物和探针是基于本文公开的序列设计的，并且通过标准的技术容易合成，例如通过亚磷酰胺化学的固相合成，如通过引用包含在本文中的美国专禾U 4,458,066和4,415,732号；Beaucage等(1992) Tetrahedron48:2223-2311;禾卩Applied Biosystems User Bulletin No. 13 (1 Apr. 1987)中公开。其 它的化学合成方法包括，例如，Narang等，Meth. Enzymol. (1979) 68:90中所述的 磷酸三酯法和Brown等，Meth. Enzymol. (1979) 68:109中所述的磷酸二酯法。聚 腺苷酸(Poly(A))或者聚胞苷酸(poly(C))或者其它非互补核苷酸延伸物(extensions) 可以用这些相同方法包含到探针中。六氧化乙烯(Hexaethylene oxide)延伸物可以通 过本领域己知的方法被偶联到探针上。Cload等(1991) J. Am. Chem. Soc. 113:6324-6326;Levenson等的美国专利4,914,210号；Durand等(1990) Nucleic Acids Res. 18:6353-6359;和Horn等(1986) Tet. Lett. 27:4705-4708。
典型地，引物序列的长度范围是10-75个核苷酸之间，如10至70、 12至 65、 15至60、 20至55、 25至50、 30至45等。更典型地，引物的长度范围是18 至40、 19至35、 20至30、 21至29、 22至28、 23至27、 24-25个核苷酸之间， 和所述范围之间的任何长度。尤其值得注意的是长度大约20至22个核苷酸的引 物。典型的探针的长度范围是10-50个核苷酸之间，如10至50、 12至45、 15 至40、 20至35、 25至30等。更典型地，探针的长度范围是18至40、 19至35、 20至30、 21至29、 22至28、 23至27、 24-25个核苷酸之间，和所述范围之间的 任何长度。尤其值得注意的是长度大约20至22个核苷酸的探针。
在一些实施方式中，本方法提供用于检测样品如生物样品中的任何BKV 基因型。在这样的实施方式中，本方法通过用与靶区域内的序列对应的引物和探 针检测靶核酸区域或者其片段。靶区域I-V内的适用于本发明方法的示例性引物用 黑体在图1中指出。适用于本发明的探针可以从位于用两条选择引物产生的扩增 产物序列内的任何序列设计。选择适用于这样的实施方式的探针，使其对应于待 检测的不同BKV基因型之间的共享核苷酸序列的区域。在其它实施方式中，本方法提供用于检测和区分样品如生物样品中的不同 基因型。在这样的实施方式中，本方法通过应用与靶区域内的序列对应的引物和 探针检测耙核酸区域或者其片段。靶区域I-V内的适用于本发明方法的示例性引物 用黑体在图1中指出。适用于本发明的探针可以从位于用两条选择引物产生的扩 增产物序列内的任何序列设计。在这样的实施方式中，选择探针序列，以便使其 对应于待检测的不同BKV基因型之间的一个或者多个核苷酸序列不同的区域。
适合用作本发明检测中的引物和探针的BKV基因型的示例性核酸序列在 表1中描述。表1中示出的序列编号是图1中GenBank登录号AY628224的编号。
表l:用于检测BKV核酸的靶区域I-V的示例性引物和探针序列(序列基于BKV 基因组序列提供；序列编号基于图1中的GenBaiik登录号AY628224的编号)SEQIDNO.: 起点终点长度序列5'到3'
靶区域I (BK1)(对应于AY628224的核苷酸435-585)
SEQIDNO:06 F 43546026 AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTT SEQIDNO:07 R 52755226 AAGTACCACTGCTTTACCTGCTGTAA SEQIDNO:08 P 4卯52434 TTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGG
AAAAA
靶区域II (BK2)(对应于AY628224的核苷酸1418-1545) SEQIDNO:09F 1450 1467 18 TTGCCCCAGGAGGTGCTA SEQIDNO:IO R 1498 1520 23 TTTACTTCTAGGCCTGTACGGGA SEQIDNO:llP1469 1497 29 TCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGC
靶区域III (BK3)(对应于AY628224的核苷酸4097-4560)
SEQIDNO:12F 4375 4404 27 GGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTACCTTT SEQIDNO:13R 4452 4478 26 TCATCACTGGCAAACATATCTTCATG SEQIDNO:14 P 4426 4450 25 GTGTTGAGAATCTGCTGTTGCTTCT
靶区域IV (BK4)(对应于AY628224的核苷酸612-864) SEQIDNO:15F 612620 19 ATGGGTGCTGCTCTAGCAC SEQEDNO:16 R 67769620 GTGGCTGAAATTGCTGCTGG SEQIDNO:17 P 64666327 TGCCAGTGTATCTGAGGCTGCTGCTGC
靶区域V (BK5)(对应于AY628224的核苷酸2810-2895) SEQIDNO:18F 2811 2827 17 GGGCTGAAGTATCTGAG SEQIDNO:19 R 2856 2873 18 CAGTGCTTGATCCATGTC SEQIDNO:20 P 2828 2950 23 CTTGGGAAGAGCATTGTGATTGG ~""F"指正向引物，"R"指反向引物，"P"指探针。探针可以被偶联到标记上用于检测。已知有几种方法和组合物用于用允许 加入标记的活性官能团衍生寡核苷酸。例如，有几种方法可用于生物素化探针， 以便使放射性标记、荧光标记、化学发光标记、酶标记、或者电子致密标记能够 通过亲和素被连接。例如，见Broken等，Nucl. Acids Res. (1978) 5:363-384，其公 开了铁蛋白-亲和素-生物素标记的使用；和Chollet等，Nucl. Acids Res. (1985) 13: 1529-1541，其公开了寡核苷酸5'端经氨垸基磷酰胺连接臂的生物素化。也有几种 可用于合成氨基衍生的寡核苷酸的方法，所述寡核苷酸容易通过荧光或者其它类 型的由氨基活性基团衍生的化合物标记，如异硫氰酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺或类 似物，例如，见Connolly (1987) Nucl. Acids Res. 15:3131-3139, Gibson等，(1987) Nucl. Acids Res. 15:6455-6467和Miyoshi等，美国专利4,605,735号。也可以利用合成巯基衍生的寡核苷酸的方法，所述寡核苷酸能够与硫羟-特异性标记反应，例 如，参见Fung等，美国专利4,757,141号，Connolly等，(1985) Nuc. Acids Res. 13:4485-4502和Spoat等，(1987) Nucl. Acids Res. 15:4837-4848。在Matthews等， Anal. Biochem. (1988) 169:1-25中提供了用于标记DNA片段的方法的综述。
例如，通过将荧光分子连接到探针的非连接端，可以对探针进行荧光标记。 用于选择合适的荧光标记的指南可以在Smith等，Meth. Enzymol. (1987) 155:260-301; Karger等,Nucl. Acids Res. (1991) 19:4955-4962; Haugland (1989) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.)中找到。优选的荧光标记包括如在美国专利4,318,846号和Lee等, Cytometry (1989) 10:151-164中公开的荧光素及其衍生物，禾卩6-FAM、 JOE、 TAMRA、 ROX、 HEX-I、 HEX-2、 ZOE、 TET-1或NAN-2等。
另外，探针可以用吖啶酯(Acridinium Ester, AE)标记。目前的技术允许AE 标记位于探针内的任何位置。例如，参见Nelson等(1995)在Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing, Kricka L. J. (ed) Academic Press, San Diego, Calif.中的 "Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence"; Nelson等(1994)在The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al, (eds.) Birkhauser, Boston, Mass.中的 "Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR"; Weeks等，Clin. Chem. (1983) 29:1474-1479; Berry等，Clin. Chem. (1988) 34:2087-2090。 AE分子可 以用基于非核苷酸的连接臂化学被直接连接到探针上，其允许将标记放在探针内 的任何位置，例如，参见，美国专利5,585,481和5,185,439号。
如果在检测中使用固相支持物(例如，利用探针捕获靶核酸的扩增子)，则 寡核苷酸探针可以用不同的方式被连接到固相支持物上。例如，通过将探针的3' 或者5'端核苷酸连接到固相支持物，可以将探针连接到固相支持物上。更优选地， 探针通过起到将探针与固相支持物隔开作用的接头被连接到固相支持物上。接头 通常为至少15-30个原子的长度，更优选地，至少15-50个原子的长度。接头的期 望长度将取决于所应用的具体固相支持物。例如，当应用高度交联的聚苯乙烯作 为固相支持物时，6个原子的接头通常是足够的。本领域已知众多的接头，它们可以用于将寡核苷酸探针连接到固相支持 物。接头可以由不显著干扰靶序列与连接到固相支持物上的探针杂交的任何化合 物形成。接头可以由能够通过自动合成容易地加到接头上的同聚寡核苷酸形成。 可选地，聚合物如官能化聚乙二醇可以被用作接头。这样的聚合物比同聚寡核苷 酸优选，因为它们不明显地干扰探针与靶寡核苷酸的杂交。聚乙二醇特别优选。
在碱性条件和高温下，在去除碱基保护基期间，固相支持物、接头和探针 之间的连接通常不被切割。优选的连接的例子包括氨基甲酸酯和酰胺键。
用于固定寡核苷酸探针的优选类型的固相支持物的例子包括可控孔度玻 璃、玻璃板、聚苯乙烯、亲和素包被的聚苯乙烯珠子、纤维素、尼龙、丙烯酰胺凝胶和活化葡聚糖。在某些实施方式中，加入内参照(internal control, IC)或者内标(internal standard)作为对照，以便说明任何阴性结果不是因为检测失败所引起。IC的使用 使得能够控制分离过程、扩增过程和检测系统，并且使得能够监控检测行为和对 样品(一个或多个)进行定量。IC可以在任何合适的点被包含，例如，在裂解缓冲液 中。在一个实施方式中，IC包括噬菌体核酸。当在检测中使用固相支持物时，固 相支持物可以另外包括特异于内标的探针(IC探针)，从而在使用IC探针时协助捕 获。IC探针可以任选地与不同于靶序列的可检测标记的可检测标记偶联。在可检 测的标记是荧光团的实施方式中，IC可以通过分光光度法和通过探测限研究(limit of detection studies)定量。 检测样品中的BKV在一个方面，检测测定样品中BKV的存在。在这样一个方面，检测是利 用简并引物和探针的基于扩增的检测，其中引物和探针被设计以便提供用于扩增 BKV基因组的靶核酸序列区域。如上述，检测测定一个或者多个靶核酸区域(例如，靶区域I-V)或者其部 分的存在。靶核酸序列区域I-V是在不同的BKV基因型中的保守核酸区域。这些 检测中使用的引物和探针优选地来自上述靶核酸序列区域I-V。本检测中使用的特 别优选的引物和探针设计自耙核酸序列区域I-V的高度保守的核苷酸序列。
如上所述，在一个实施方式中，引物和/或探针被设计进行基于核酸的检 领'J，特别是扩增方法，测定具有上述靶核酸序列例如靶核酸序列区域I-V的靶核酸。 即，在这样的实施方式中，引物被设计以便扩增具有上述核酸序列的核酸序列的 耙序列，例如靶核酸序列区域I-V。在另一个实施方式中，引物和/或探针被设计进行基于核酸的检测，特别 是扩增方法，测定具有为上述靶核酸序列例如靶核酸序列区域I-V的片段的核酸序 列的耙核酸。即，在这样的实施方式中，引物被设计以便扩增具有比上述完整核 酸序列例如靶核酸序列区域I-V小的部分的核酸序列的靶序列。
样品中BKV核酸的具体检测一般通过检测靶序列区域I-V中的一个或者 多个、或者其片段来完成。在一个实施方式中，通过用根据靶序列区域V的序列 设计的引物和探针检测BKV靶核酸。在特别值得注意的实施方式中，用具有序列ATGGGTGCTGCTCTAGCAC (5'引物)(SEQ IDNO: 15)、 GTGGCTGAAATTGCTGCTGG (3'引物)(SEQIDNO: 16)的引物检测靶序列，具有序列TGCCAGTGTATCTGAGGCTGCTGCTGC (SEQ IDNO:n)的探针特别值得注意。在另一个特别值得注意的实施方式中，用具有序列 GGGCTGAAGTATCTGAG (5'引物)(SEQ ID NO: 18)、 CAGTGCTTGATCCATGTC (3'引物)(SEQ ID NO: 19)的引物检测靶序列，具有序列CTTGGGAAGAGCATTGTGATTGG (SEQ ID NO:20)的探针特别值得注意。
特别值得注意的是在实时RT-PCR方法中使用这些引物和探针和使用双标 记的TaqMan探针检测样品中的BKV。 检测方法本发明提供基于DNA的检测，用于测定样品中的BKV。检测可以用各种 方法进行，包括直接测序、用序列特异性寡聚体杂交、凝胶电泳和质谱。这些方 法可以使用不同类或者同类的方式，同位素或者非同位素标记，以及根本无标记。
优选地，所述方法涉及扩增来自样品的核酸。如果获得诊断核酸，就表明 样品中存在BKV。 一般地，所述方法涉及用检测引物和至少一条其它引物扩增来 自样品的核酸，如上述，和评价扩增的核酸。尽管检测可受线性范围检测的限制， 但所述方法高度灵敏，并可以检测每个反应少至5个拷贝的BKV，其相当于每mL 样品中200个拷贝的DNA。因此，本发明一般性地提供用于检测样品中的BKV， 其中存在的BKV为每mL样品中至少200个拷贝的DNA。如本领域所知，可以通过许多方法评价扩增的核酸，包括例如，确定核酸 的存在或者不存在，确定核酸的大小或者确定核酸相对于另一扩增的核酸的丰度。 在大多数实施方式中，用凝胶电泳、核酸杂交、测序和/或检测结合到扩增核酸的 标记的信号评价扩增的核酸。扩增核酸的方法(例如，通过聚合酶链反应)、进行引 物延伸的方法、和评价核酸的方法一般为本领域公知(例如，见Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed" Wiley & Sons, 1995禾口 Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (2001) Cold Spring Harbor, N. Y.)，不需要任何更详细的描述。例如，上述引物和探针可以用在基于聚合酶链反应(PCR)的技术中，以检 测生物样品中的BKV。 PCR是用于扩增包含在核酸分子或者分子混合物中的期望 靶核酸序列的技术。在PCR中，使用过量的引物对与靶核酸序列的互补链杂交。 引物利用靶核酸作为模板通过聚合酶被各自延伸。延伸产物从原始靶链上解离后 本身成为靶序列。随后新的引物被杂交并通过聚合酶延伸，该循环被重复以便几 何学地增加耙序列分子的数目。用于扩增样品中靶核酸序列的PCR方法为本领域 公知，并已经在如I皿is等人(eds.) PCR Protocols (Academic Press, NY 1990); Taylor (1991) Polymerase chain reaction: basic principles and automation, PCR， A Practical Approach, McPherson等人(eds.) IRL Press, Oxford; Saiki等人(1986) Nature 324:163; 以及在美国专利4,683,195, 4,683,202和4,889,818号中被描述，所有这些文献通过 引用其全部被包含在本文中。特别地，PCR使用位于待扩增的靶核苷酸序列两侧的相对短的寡核苷酸引 物，其方向是它们的3'端互相面对，每条引物朝着另一引物延伸。提取多核苷 酸样品和优选地通过热变性，并与存在的摩尔数过量的第一和第二引物杂交。在 存在四种脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs-dATP、 dGTP、 dCTP禾Q dTTP)时，用引物和模板依赖性多核苷酸聚合剂催化聚合，所述聚合剂如任何能够产生引物延伸产 物的酶，例如，大肠杆菌(E. coli)DNA聚合酶I、 DNA聚合酶I的Klenow片段、 T4 DNA聚合酶、从水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)分离的热稳定性DNA聚合 酶，它们从各种来源获得(例如Perkin Elmer)，嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(United States Biochemicals)、 嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stereothermophilus)(Bio-Rad)或者海滨热球菌(Thermococcus litoralis)("Vent"聚合酶， New England Biolabs)。这得到两个"长的产物"，它们在其5'端含有各自的引物， 共价连接到新合成的原始链的互补链上。随后将反应混合物例如通过降低温度、失活变性剂或者加入更多的聚合酶 返回聚合条件，起始第二循环。第二循环提供两条原始链，来自第一循环的两条 长产物，从原始链复制的两条新的长产物、和从长产物复制的两条"短产物"。短 产物具有靶序列的序列，每端含有引物。在每个附加循环中，产生附加的两个长 产物，和与前一循环结束时保留的长产物和短产物的数目相等的许多短产物。因 此，含有耙序列的短产物数随着每一循环呈指数增长。优选地，PCR应用商业可 得的热循环仪如Perkin Elmer进行。被称为TAQMANTM分析(Perkin-Elmer)的荧光5'核酸酶分析(fluorogenic 5， nuclease assay),是强大的和多用途的基于PCR的核酸靶检测系统。关于 TAQMANtm分析、其中使用的试剂和条件的具体描述，参见，如Holland等人， Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. (1991) 88:7276-7280;美国专利5,538,848、 5,723,591 和5,876,930号，所有文献通过引用其全部被包含于本文中。因此，来自本文所述 BKV基因组区域的引物和探针可以用于TAQMANtm分析，以检测生物样品中感 染的存在。结合热循环通过监测荧光信号的产生进行分析。所述分析系统不需要 凝胶电泳分析，并且具有产生允许测定靶拷贝数的定量数据的能力。
应用例如AMPLITAQ GOLD DNA聚合酶可以方便地进行荧光5'核酸酶 分析，所述聚合酶具有5'核酸内切酶(endogenous 5' nuclease)活性以消化用荧光报 告染料和猝灭剂二者标记的内部寡核苷酸探针(见，Holland等人，Proc. Natl. Acad.Sci. USA (1991) 88:7276-7280，禾卩Lee等人，Nucl. Acids Res. (1993) 21:3761-3766)。通过测量扩增循环中发生的荧光改变检测分析结果，所述改变是 由于荧光探针被消化、染料和猝灭剂标记解偶联和引起荧光信号增加，所述增加 与耙核酸的扩增成正比。扩增产物可以在溶液中被检测或者用固相支持物检测。在该方法中，设计 taqmantm探针使其与期望PCR产物内的靶序列杂交。TAQMANtm探針的5'端 含有荧光报告染料。探针的3'端被封闭以阻止探针的延伸，并且含有会猝灭5'荧光 团的荧光的染料。在随后的扩增中，如果反应中存在具有5'外切核酸酶活性的聚合 酶，5'荧光标记就被切割掉。5'荧光团的切除导致荧光增加，其能够被检测。
特别地，构建寡核苷酸探针，这样，当探针未杂交时，其以至少一种单链构象存在，其中猝灭剂分子距报告分子足够近以猝灭报告分子的荧光。当寡核苷 酸探针杂交到靶多核苷酸时，其也可以以至少一种构象存在，这样猝灭剂分子不 位于与报告分子足够近以猝灭报告分子的荧光的位置。通过采用这些杂交和未杂 交构象，当探针杂交和未杂交时，探针上的报告分子和猝灭剂分子显示不同的荧 光信号强度。结果，基于报告分子、猝灭剂分子或者其结合的荧光强度的改变， 可以确定探针是否杂交或者未杂交。另外，因为探针能够被设计为当探针未杂交 时猝灭剂分子猝灭报告分子，所以探针能够被设计为使报告分子显示有限的荧光 一除非探针被杂交或者消化。因此，本发明涉及应用具有5'到3'核酸酶活性的核酸聚合酶、能够杂交到 耙BKV序列或者其延伸产物的一种或者多种引物、和能够杂交到相对于引物3' 端的耙BKV序列的寡核苷酸探针扩增靶BKV核苷酸序列的方法。在扩增过程中， 当寡核苷酸探针杂交到靶序列上时，聚合酶消化寡核苷酸探针，从而将报告分子 与猝灭剂分子分开。随着扩增的进行，监测报告分子的荧光，荧光相应于核酸扩 增的发生。报告分子优选为荧光染料，猝灭剂分子优选为罗丹明染料。
另一个检测方法涉及利用靶序列特异性寡核苷酸探针，其含有与上述靶序 列互补的区域。所述探针可以用于杂交保护实验(hybridization protection assays, HPA)。在该实施方式中，探针被方便地标记有高度化学发光分子吖啶酯(AE)。例 如见Nelson等(1995) "Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence", Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing, Kricka L. J. (ed) Academic Press, San Diego， Calif.; Nelson等(1994) "Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR", The Polymerase Chain Reaction, Mullis等人(eds.) Birkhauser, Boston, Mass.; Weeks等，Clin. Chem. (1983) 29:1474-1479; Berry等,Clin. Chem. (1988) 34:2087-2090。用基于非核苷酸的连接臂化学将一个AE分子直接连接到探针上， 所述连接臂化学允许将标记放在探针内的任何位置。例如，见美国专利5,585,481 和5,185,439号。化学发光通过与碱性过氧化氢的反应触发，该反应产生激发态的 N-甲基吖啶酮，其随后衰落到基态发出光子。另外，AE引起酯水解，这产生了非 化学发光-甲基吖啶羧酸。当AE分子被共价连接到核酸探针上时，在弱碱性条件下水解是快速的。 当AE标记的探针精确地与靶核酸互补时，AE水解的速度被大大降低。因此，杂 交和未杂交的AE标记的探针可以直接在溶液中检测，不需要物理分离。
HPA—般由以下步骤组成(a)在溶液中将AE标记的探针与靶核酸杂交 大约15到大约30分钟。接着加入弱碱性溶液，水解偶联到未杂交的探针上的AE。 这个反应大约需要5到10分钟。检测剩余的杂合体结合的AE作为存在的靶量的 度量。该步骤大约需要2到5秒。优选地，在与杂交步骤相同的温度下， 一般是 50到70摄氏度下，进行差示水解(differential hydrolysis)步骤。可选地，可以在室 温下进行第二差示水解步骤。这允许使用例如范围在10-11的增加的pH值，这在杂交和未杂交的AE标记的探针之间产生了更大的水解速率差异。HPA在例如美 国专利6,004,745、 5,948,899和5,283,174号中被详细描述，其公开内容通过引用 其全部被包含在本文中。本发明的寡核苷酸分子也可以用在基于核酸序列的扩增(NASBA)中。该方 法是启动子指导的酶法，其诱导特定核酸的体外连续、均一和等温地扩增，以提 供核酸的RNA拷贝。进行NASBA的试剂包括具有含启动子的5'尾的第一 DNA 引物、第二DNA引物、反转录酶、RNAse-H、T7RNA聚合酶、NTP(多种)和dNTP(多 种)。利用NASBA从单链RNA或者DNA，或者双链DNA产生大量的单链RNA。 当RNA待被扩增时，ssRNA充当模板，通过延伸含有RNA聚合酶识别位点的第 一引物，合成第一条DNA链。该DNA链又充当模板，通过延伸第二引物合成第 二条互补的DNA链，产生了双链活性RNA聚合酶启动子位点，并且第二条DNA 链作为模板，在RNA聚合酶的帮助下，用于合成大量的第一模板ssRNA。NASBA 技术为本领域已知，并在如欧洲专利329,822号、国际专利申请号WO 91/02814 和美国专利6,063,603、 5,554,517和5,409,818号中描述，所有文献整体并入本文。
本文所述的BKV序列也用于使用分支DNA分子的核酸杂交和扩增技术 中。在基本的核酸杂交试验中，单链分析物核酸被杂交到标记的单链核酸探针， 并检测产生的标记双链体。已经开发出该基本方法的变化方法，以便将待检测的 双链体从异物中分离和/或扩增被检测的信号。 一种用于扩增信号的方法应用为多 核苷酸的扩增多聚体，其带有特异性杂交于分析物核酸或与分析物结合的核酸链 的第一片段和特异性杂交于标记探针的重复的第二片段。所述扩增在理论上与第 二片段的重复数目成正比。所述多聚体可以是线性的或者分支的。在这些技术中 使用两种一般类型的分支多聚体叉状和梳状。制备和使用分支核酸分子的方法 为本领域已知，并在如美国专利5,849,481号中描述，其通过引用其全部被包含在 本文中。显而易见的是，对本文所述的试验设计可以进行很多改变，并且许多形式 是本领域已知的。上述描述仅仅作为指南提供，本领域技术人员能够用本领域公 知的技术容易地修改上述方案。 试剂盒与本发明结合使用的试剂盒也被提供。试剂盒中可以提供上述检测试剂， 包括引物、探针、带有结合探针的固相支持物、以及其它检测试剂，和适当的说 明书和其它需要的试剂，以便进行如上述的检测。通常，试剂盒在单独的容器中 包含引物和探针的结合(或是已经结合到固相支持物；或是单独地，带有将它们 结合到基质的试剂)、对照配制物(阳性和减阴性)、标记试剂一当检测形式需要时、 和信号产生试剂(例如酶底物)一如果标记不直接产生信号。进行检测的说明书(例 如，书写的、磁带、VCR、 CD-ROM等)通常包含在试剂盒中。根据所应用的具体 检测，所述试剂盒也可以包含其它的包装试剂和材料(即，洗脱缓冲液等)。用这些试剂盒可以进行标准的检测，如上述检测。说明书一般记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以被印刷在基底如 纸或者塑料等上。同样地，说明书可以作为包装插页(packageinsert)存在于试剂盒 中、在试剂盒或其组分的容器的标签(例如，与包装或者分包装相连)中等。在其它 的实施方式中，说明书作为合适的计算机可读存储介质上的电子存储数据文件存 在，所述介质例如CD-ROM、磁盘等，包括其上存在程序的相同介质。
在另外的实施方式中，试剂盒中不存在说明书本身，但提供了从远的来源 例如经因特网获得说明书的手段。该实施方式的一个例子是包括网址的试剂盒， 其中说明书可从所述网址阅读或者说明书可从所述网址下载。
更进一步地，试剂盒可以是其中说明书得自或下载自遥远来源如因特网或 万维网的试剂盒。可以应用一些形式的访问安全或者识别协议以限制那些有权使 用本发明的人的访问。根据本教导，获得说明书和/或程序设计的方法一般记录在 合适的记录介质上。 —般，本发明的试剂盒包括至少一种引物、通常至少两种引物(5'引物和3' 引物)，通常是至少两种引物和探针，如上述。试剂盒也可以含有说明书，用于使 用试剂盒，用上述方法、包括上述的PCR方法检测样品中BKV。本试剂盒中也可 以包括缓冲液、dNTPs和对照(例如，阳性和阴性对照核酸)，用于实施本方法。本 试剂中的引物可以被可检测地标记或者不标记。
实施例提出以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供如何进行和应用本发明 的完全公开和描述，其意图不是限制发明者认为是其发明的范围，也不是表明下 面的实验是进行的所有实验或者仅仅进行的实验。已经做出努力确保关于所用数 字的准确性(例如，量、温度等)，但是应该存在一些实验误差和偏差。除非另外说 明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或者 接近大气压。 材料和方法在以下实施例中使用下面的方法和材料。样品类型和处理。用于检测本发明所述的BKV的样品可以是任何合适的 生物样品，如血清、血浆、羊水和组织样品。组织样品应该在-20士l(TC下冷冻贮 藏在盐水或者磷酸缓冲盐水中(PBS)中。血清、血浆和羊水应该在-20ilO'C下冷冻 贮藏。所有上述样品类型可以根据需要经隔夜快运在干冰上运输。
引物和探针。利用标准的程序(Primer Express, Applied Biosystems)，通过 计算机分析，设计寡核苷酸引物和探针并分析它们对于PCR和杂交的适用性。寡 核苷酸引物和荧光探针由合格的供应商合成。对寡核苷酸引物脱盐和冻干。用于 检测BKV的寡核苷酸引物对组如下SEQ ID NO.: 序列5'到3'
靶区域I (BK1)
SEQ ID NO: 06 f~~AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTT
SEQ ID NO: 07 R AAGTACCACTGCTTTACCTGCTGTAA
SEQ ID NO: 08 P TTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAA
耙区域II (BK2)
SEQ ID NO: 09 F~TTGCCCCAGGAGGTGCTA
SEQ ID NO: 10 R TTTACTTCTAGGCCTGTACGGGA
SEQIDNO:ll P TCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGC
耙区域HI (BK3)
SEQ ID NO: 12 "~GGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTACCTTT
SEQ ID NO: 13 R TCATCACTGGCAAACATATCTTCATG
SEQ ID NO: 14 P GTGTTGAGAATCTGCTGTTGCTTCT
耙区域IV (BK4)
SEQ ID NO: 15 ^~~ATGGGTGCTGCTCTAGCAC
SEQ ID NO: 16 R GTGGCTGAAATTGCTGCTGG
SEQ ID NO: 17 P TGCCAGTGTATCTGAGGCTGCTGCTGC
靶区域V (BK5)SEQ ID NO: 18 f~~GGGCTGAAGTATCTGAG SEQ ID NO: 19 R CAGTGCTTGATCCATGTC SEQ ID NO:20 P CTTGGGAAGAGCATTGTGATTGG "F，，指正向引物，"R"指反向引物，"P"指探针。探针以100pM的浓度冷冻， 探针的工作浓度是5pM，其用lOmMTris-HCl， pH 8.0以1:10稀释，分装成100 ^L的等份。探针可以被贮存在-20'C或者以下并避光。酶。使用以下酶2xTaqMan Universal PCR Master Mix ， Applied Biosystems Cat. #4304437或4318157，其包括Applied Biosystems的AmpliTaq Gold
DNA聚合酶。试剂和缓冲液。以下物质在检测中被使用QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGENCat. No.51106);设备。所应用的设备包括ABI PRISM Sequence Detection System 7500。
扩增。通过广泛使用的上述PCR方法完成DNA扩增(例如，见Persing等， 1993, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Amplifications, American Society for Microbiology, Washing D.C.)。扩增的DNA序列通过杂交和通过Taqman
方法切割双标记的寡核苷酸探针检测。简而言之，扩增和检测方案如下在含有各引物500 nM、 100 nM的双标记探针(Taqman探针)、各200 pM的四种dNTPs 的25 pi PCR反应混合物中(PCR Master Mix, Applied Biosystems)，扩增从临床样品 提取的DNA。在混合物中使用AmpliTaq Gold聚合酶，所述酶是热激活(热启动) 酶，以提高扩增的特异性和灵敏度。通过用ABI7500实时PCR系统(ABI7500 Real Time PCR System)使PCR反应物接受热循环(95'C， 10 min，接着95。C30秒、60 'C 30秒进行40个循环)。实时监测扩增和检测，并在PCR循环完成后用ABI序 列检测软件(vl.2.2)分析。特异性。在一组临床BKV阳性和阴性样品上，对来自测序DNA和在 GenBank获得的序列的寡核苷酸引物和探针的特异性进行测定。也在JCV阳性和 阴性样品上以及许多对照上测定引物和探针。将结果与目前在临床实验室中使用 的PCR检测结果进行比较。对一些扩增核酸进行测序以验证检测的特异性。扩增 序列的测序证实，所有的PCR片段的确是BKV序列。这些序列片段都不与JCV 序列或者来自任何其它种类的序列相关。灵敏度。通过滴定已知浓度系列的BKVDNA和将浓度转化为标准曲线， 分析检测的灵敏度。因为有靶向不同区域的几组引物/探针，灵敏度轻微变化。总 之，分析的灵敏度达到每个反应管5个拷贝或更低。基于样品制备程序和体积调 整方案，对临床样品(例如，血清、尿或者其它形式的液体样品)而言，本分析的灵 敏度等同于每ml大约200个拷贝。
实施例1
BKV全基因组的完整测序为了理解BKV基因组多样性和鉴定用于其诊断应用的候选序列，对病毒 全基因组进行测序。从13个BKV阳性患者收集尿样品。为了避免密切的临床关 联，这些患者从地理上多样的来源选择或随机挑选。通过常规方法提取样品获得 病毒RNA。随后通过长PCR方案(Stratagene)扩增提取的DNA以获得其完整的 5.1kb基因组。用预先设计的一组测序引物通过四色双脱氧终止法对扩增的病毒 DNA测序，并在ABI377测序仪系统上分离。对每个BKV基因组，将序列片段通 过Lasergene 6软件组装成完整的5.1-5.2 kb重叠群，进行分析。
将十三个组装的BKV重叠群相互比对，也与所有公布的BKV序列比对。 从公共数据库(GenBank、 EMBL和Swiss-Port)获得公布的序列信息。比较32个 BKV全基因组序列，包括13个新测序的BKV序列和19个公布的BKV序列 (GenBank登录号AY628224、 AY628225、 AY628226、 AY628227、 AY628228、 AY628229、 AY628230、 AY628231、 AY628232、 AY628233、 AY628234、 AY628235、 AY628236、 AY628237、 AY628238、 M23122、 NC001538、 V01108和V01109)。
首先，相互比较来自BKV株的所有序列。随后，将BKV序列与其它密切 相关的种类的基因组相比较。在被筛选的所有种类中，特别值得注意的是多瘤病毒家族的另一个成员，人多瘤病毒JC病毒(JCV)。 BKV基因组内的全序列比对允许选择几个候选序列区域用于诊断检测。这 些区域享有所有32个BKV基因组中的共有序列，并且它们的序列中有最小的变 异。这些区域外的序列或是不一致或是高度多态，这使得它们很难被用于诊断应 用中的普遍检测。对公共数据库中的所有其它种的序列进一步进行比较性分析。 显著地，JCV与BKV共享高度的同源性。尽管具有高度的同源性，但是BKV与 JVC的选择区域的比较显示出一些序列差异。这些序列差异尽管有限，但是对鉴 别检测BKV和JCV是关键的。在来自全基因组的5100+个碱基对中，总共有142个以前未公布的核苷酸 变异被鉴定。在这些核苷酸变异中，105个是核苷酸取代(单个或者多个碱基对)， 37个是缺失或者插入(多个碱基对)。新鉴定的变异分布在整个BKV基因组上。通 过结合新鉴定的序列变异与公共数据库中的变异，建立BKV遗传多样性精细图谱。 如图1所示，该图谱说明了高度多态的区域和相对保守的区域。对该精密图谱的 分析允许选择候选序列用于诊断应用。
实施例2
靶区域BK1("BK1")的鉴定如图l所示，对所有新完成的核酸序列和公布的核酸序列的序列比较允许 选择一个以上的保守序列区，和会提供对生物样品中BKV存在或者不存在的特异 的和灵敏的基于核酸的检测。选择由GenBank登录号AY628224的核苷酸435到 585组成的BK1区域进行PCR引物设计。BK1靶序列的核酸序列是
(SEQ IDNO:Ol)。用于设计基于核酸的扩增引物的策略是基于对所有BKV基因组序列和密 切相关病毒序列的多序列比对分析。设计该分析以便包括BKV的所有变体。也对 该分析进行设计以排除任何密切相关但不是BKV的序列，如JCV序歹U。对这些比 对的仔细分析允许选择覆盖所有BKV变体的序列、但区分来自任何其它密切相关 属的序列的寡核苷酸序列，从而允许BKV的属特异性扩增和广泛检测及鉴定。用 于BK1耙区域的引物和探针的序列如下
SEQIDNO.: 序列5'到3'
耙区域I (BK1)
SEQ ID NO:06 F~~AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTT
SEQ ID NO:07 R AAGTACCACTGCTTTACCTGCTGTAA
SEQ ID NO:08 P TTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAA
为了证实BKV的特异性检测，对来自BKV样品的PCR扩增产物进行测 序和分析。扩增产物序列与BKV序列比对良好，没有扩增产物序列被鉴定为JCV 序列或者任何其它属的序列。检测结果显示在图2中。模板浓度范围是每个反应 50个拷贝到每个反应50,000个拷贝，检测一式两份进行。BK1检领"斜率=-3.58， 截距=43.428, R2 = 0.997。
实施例3
耙区域IK"BK2")的鉴定对所有新完成的BKV核酸序列和公布的BKV核酸序列的核酸序列比较使 得能够选择BK2靶区域。BK2靶区域包括GenBank登录号AY628224的核苷酸 1418 到 1545。 BK2 耙序列的核酸序列是
ACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)。用于设计基于核酸扩增的引物和探针的策略是基于对所有BKV序列和密 切相关病毒序列的多重序列比对的分析。设计该分析以包括所有的BKV变体。也 对该分析进行设计以排除任何密切相关但非BKV的序列，如JCV序列。对这些比 对的仔细分析允许选择覆盖所有BKV变体序列、但区分来自任何其它密切相关属 的序列的寡核苷酸序列，从而允许BKV的属特异性扩增和广泛检测及鉴定。用于 BK2耙区域的引物和探针的序列如下
SEQ ID NO.: 序列5'到3'
耙区域II (BK2) ~
SEQ ID NO:09 F~~TTGCCCCAGGAGGTGCTA
SEQ ID NO: 10 R TTTACTTCTAGGCCTGTACGGGA
SEQ ID NO: 11 P TCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGC为了证实BKV的特异性检测，对来自BKV样品的PCR扩增产物进行测 序和分析。扩增产物序列与BKV序列比对良好，没有扩增产物序列被鉴定为JCV 序列或者任何其它属的序列。检测结果显示在图2中。模板浓度范围是每个反应 50个拷贝到每个反应50,000个拷贝，检测一式两份进行。BK2检测斜率=-3.48， 截距=44.053和R2 = 0.999。
实施例4
靶区域III("BK3")的鉴定对所有新完成的BKV核酸序列和公布的BKV核酸序列的核酸序列比较允 许选择BK3靶区域。BK3靶区域包括GenBank登录号AY628224的核苷酸4097 到4560。 BK3靶序列的核酸序列是(SEQ IDNO:03)。用于设计基于核酸的扩增引物和探针的策略是基于对所有BKV序列和密 切相关病毒的序列的多重序列比对的分析。设计该分析以包括所有的BKV变体。 也对该分析进行设计以排除任何密切相关但非BKV的序列，如JCV序列。对这些 比对的仔细分析允许选择覆盖所有BKV变体的序列但区分来自任何其它密切相关 属的序列的寡核苷酸序列，从而允许BKV的属特异性扩增和广泛检测及鉴定。用 于BK3靶区域的引物和探针的序列如下
SEQ ID NO.: 序列5'到3，
耙区域III (BK3)
SEQ ID NO: 12 F GGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTACCTTT SEQ ID NO: 13 R TCATCACTGGCAAACATATCTTCATG SEQ ID NO: 14 P GTGTTGAGAATCTGCTGTTGCTTCT为了证实BKV的特异性检测，对来自BKV样品的PCR扩增产物进行测 序和分析。扩增产物序列与BKV序列比对良好，没有扩增产物序列被鉴定为JCV 序列或者任何其它属的序列。检测结果显示在图2中。模板浓度范围是每个反应 50个拷贝到每个反应50，000个拷贝，检测一式两份进行。BK3检测斜率=-3.49， 截距=44.819和112 = 0.999。
实施例5
靶区域IV("BK4")的鉴定对所有新完成的BKV核酸序列和公布的BKV核酸序列的核酸序列比较允 许选择BK4靶区域。BK4靶区域包括GenBank登录号AY628224的核苷酸612到 864。 BK4耙序列的核酸序列是
TAATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTTAA (SEQ IDNO:04)用于设计基于核酸的扩增引物和探针的策略是基于对所有BKV序列和密 切相关病毒的序列的多重序列比对的分析。设计该分析以包括所有的BKV变体。 也对该分析进行设计以排除任何密切相关但非BKV的序列，如JCV序列。对这些 比对的仔细分析允许选择覆盖所有BKV变体的序列、但区分来自任何其它密切相 关属的序列的寡核苷酸序列，从而允许BKV的属特异性扩增和广泛检测及鉴定。 用于BK4靶区域的引物和探针的序列如下
SEQ ID NO.: 序列5'到3'
靶区域IV (BK4)
SEQIDNO:15~F~~ATGGGTGCTGCTCTAGCAC SEQIDNO:16R GTGGCTGAAATTGCTGCTGG SEQIDNO:17 P TGCCAGTGTATCTGAGGCTGCTGCTGC为了证实BKV的特异性检测，对来自BKV样品的PCR扩增产物进行测 序和分析。扩增产物序列与BKV序列比对良好，没有扩增产物序列被鉴定为JCV 序列或者任何其它属的序列。检测结果显示在图2中。模板浓度范围是每个反应 50个拷贝到每个反应50,000个拷贝，检测一式两份进行。BK4检湖!l:斜率=-3.21， 截距=41.466和112 = 0.999。寡核苷酸引物和探针的分析灵敏度通过滴定已知浓度系列的DNA检测和 用标准曲线分析计算而检测。其显示，检测的分析灵敏度达到每个反应管5个拷 贝或者更低。从样品制备程序和体积调整方案校正，该分析灵敏度等同于每ml液 体临床样品中大约200个拷贝。在总共333个以前检测的临床样品组上检测引物/探针组。样品组包括47 个已知的BKV阳性(已检测)和286个已知的BKV阴性(未检领'J)样品。寡核苷酸引 物/探针组检测所有47个阳性样品。而且，在284个阴性样品中，其检测34个为 BKV阳性。为了证实那些"遗漏的"阳性结果，对28个样品测序。所有28个测 序的扩增产物被鉴定为BKV。剩余的6个样品因为样品体积不足没能够被测序。 总之，通过新的引物/探针策略，至少10%的临床阴性样品被检测为BKV阳性， 并且通过测序证实为真阳性。检测这样的真阳性百分率的失败可能是由变异位点 上的引物/探针错配或者PCR效率差或者上述二者造成的。
实施例6
靶区域V("BK5")的鉴定对所有新完成的BKV核酸序列和公布的BKV核酸序列的核酸序列比较允 许选择BK5靶区域。BK5靶区域包括GenBank登录号AY628224的核苷酸2810 到2895。 BK5靶序列的核酸序列是CTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC(SEQ ID NO:05)。
用于设计基于核酸的扩增引物和探针的策略是基于对所有BKV序列和密 切相关病毒序列的多重序列比对的分析。设计该分析以包括所有的BKV变体。也 对该分析进行设计以排除任何密切相关但非BKV的序列，如JCV序歹ij。对这些比 对的仔细分析允许选择覆盖所有BKV变体的序列、但区分来自任何其它密切相关 属的序列的寡核苷酸序列，从而允许BKV的属特异性扩增和广泛检测及鉴定。用 于BK5耙区域的引物和探针的序列如下
SEQIDNO.: 序列5'到3'
耙区域V (BK5)
SEQIDNO: 18~ ~~GGGCTGAAGTATCTGAG
SEQIDNO:19R CAGTGCTTGATCCATGTC
SEQ ID NO:20 P CTTGGGAAGAGCATTGTGATTGG为了证实BKV的特异性检测，对来自BKV样品的PCR扩增产物进行测 序和分析。扩增产物序列与BKV序列比对良好，没有扩增产物序列被鉴定为JCV 序列或者任何其它属的序列。检测结果显示在图2中。模板浓度范围是每个反应 50个拷贝到每个反应50,000个拷贝，检测一式两份进行。BK5检领"斜率=-3.61， 截距=47.324和112 = 0.994。上述结果和论述显而易见地说明，本发明提供了用于检测BK病毒以及区 分不同BK病毒基因型或者毒株的重要的新方法。同样地，本方法和系统在各种不 同应用，包括研究、医学、治疗、诊断、军事和其它应用中有用。因此，本发明 表现出了对本领域的重要贡献。尽管本发明针对其具体实施方式
进行了描述，本领域技术人员应该理解， 可以进行各种变化并且可以替换为等同物，而不偏离本发明的真正精神和范围。 另外，可以进行许多修改，使得具体的情况、材料、物质组分、方法、处理步骤 或者多个步骤适应于本发明的目的、精神和范围。所有的这样的修改意图包含在 所附权利要求范围内。
权利要求
1. 检测样品中BK病毒(BKV)核酸的方法，所述方法包括检测被怀疑具有BKV核酸的样品中至少第一核酸的存在或者不存在，所述第一核酸具有下述靶序列或者其互补序列的至少20个连续核苷酸AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTTTTATTTTTATTTTAGAGCTTTTGCTGGAATTTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAACAAAGGTACCACTGCTTTACCTGCTGTAAAAGACTCTGTAAAAGACTCCTAGGTAAGTAAT(SEQ ID NO01)，其中，所述第一核酸的5′端和3′端包含在SEQ ID NO01内；其中，具有所述靶序列的所述核酸存在的检测表明，所述样品含有BKV核酸。
2. 权利要求l所述的方法，其中所述检测是通过基于核酸的扩增进行的。
3. 权利要求2所述的方法，其中所述扩增产物的长度是大约30个核苷酸或以下。
4. 权利要求1所述的方法，进一歩包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样品 中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互补序 列的至少20个连续核苷酸TACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)。
5.权利要求1所述的方法，进一歩包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互补 序列的至少20个连续核苷酸AATACAGCTTGACTAAGAAACTGGTGTAGATCAGAGGGAAAGTCTTTA GGGTCTTCTACCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGAGAAT CTGCTGTTGCTTCTTCATCACTGGCAAACATATCTTCATGGCAAAATAA ATCTTCATCCCATTTTTCATTAAAGGAGCTCCACCAGGACTCCCACTCT TCTGTTCCATAGGTTGGCACCTATAA (SEQ IDNO:03)。
6. 权利要求1所述的方法,进一步包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样品 中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互补序列的至少20个连续核苷酸ATGGGTGCTGCTCTAGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCCAGTGTATCTG AGGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGG AGGCTGCTGCTGCTATAGAAGTTCAAATTGCATCCCTTGCTACTGTAG AGGGCATAACAAGTACCTCAGAGGCTATAGCTGCCATAGGCCTAACTCTGCTGCTTTAA (SEQ ID NO:04)。
7. 权利要求1所述的方法，进一步包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样品 中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互补序 列的至少20个连续核苷酸-GTGCTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC (SEQ ID NO:05)。
8. 检测样品中BK病毒(BKV)核酸的方法，所述方法包括 检测被怀疑具有BKV核酸的样品中至少第一核酸的存在或者不存在，所述第一核酸具有下述靶序列或者其互补序列的至少20个连续核苷酸-TAATCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTG TACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)， 其中，所述第一核酸的5'端和3'端包含在SEQ ID NO:02内； 其中，具有所述靶序列的所述核酸存在的检测表明，所述样品含有BKV核酸。
9. 权利要求8所述的方法，其中所述检测是通过基于核酸的扩增进行的。
10. 权利要求9所述的方法，其中所述扩增产物的长度是大约30个核苷酸或 者以下。
11. 权利要求8所述的方法，进一步包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互补 序列的至少20个连续核苷酸AACAAAAAAAAGAGCTCAGAGGATTTTTATTTTTATTTTAGAGCTTTTG CTGGAATTTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAACAAAGG TACCACTGCTTTACCTGCTGTAAAAGACTCTGTAAAAGACTCCTAGGT AAGTAAT (SEQ ID NO:Ol)。
12.权利要求8所述的方法，进一步包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述耙序列或者其互补 序列的至少20个连续核苷酸GGGTCTTCTACCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGAGAATTCTGTTCCATAGGTTGGCACCTATAA (SEQ ID NO:03)。
13.权利要求8所述的方法，进一步包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互补 序列的至少20个连续核苷酸AGGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGGCTCAAACATATGCTGTAATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTTAA (SEQ ID NO:04)。
14.权利要求8所述的方法，进一步包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互补 序列的至少20个连续核苷酸GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTCA
15.检测样品中BK病毒(BKV)核酸的方法，所述方法包括 检测被怀疑具有BKV核酸的样品中至少第一核酸的存在或者不存在，所述第 一核酸具有下述靶序列或者其互补序列的至少20个连续核苷酸-ATGGGTGCTGCTCTAGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCCAGTGTATCTGAGGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGGAGGCTGCTGCTGCTATAGAAGTTCAAATTGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGCATAACAAGTACCTCAGAGGCTATAGCTGCCATAGGCCTAACTCCTCAAACATATGCTGTAATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTTTGCTGCTTTAA (SEQ ID NO:04)，其中，所述第一核酸的5'端和3'端包含在SEQ ID NO:04内； 其中，具有所述靶序列的所述核酸存在的检测表明，所述样品含有BKV核酸。
16. 权利耍求15所述的方法，其中所述检测是通过基于核酸的扩增进行的。
17. 权利要求16所述的方法，其中所述扩增产物的长度是大约30个核苷酸或 者以下。
18. 权利要求15所述的方法，进一步包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述耙序列或者其互补 序列的至少20个连续核苷酸AAGTAAT (SEQ ID NO:Ol)。
19.权利要求15所述的方法，进一步包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互补 序列的至少20个连续核苷酸GGGTCTTCTACCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGAGAATTCTGTTCCATAGGTTGGCACCTATAA (SEQ ID NO:03)。
20. 权利要求15所述的方法，进一步包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互补 序列的至少20个连续核苷酸TGTACATTCAGGAGAGTTTATAGAAAAAACTATTGCCCCAGGAGGTGC TAATCAAAGAACTGCTCCTCAATGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTG TACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)。
21. 权利要求15所述的方法，进一步包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互补序列的至少20个连续核苷酸GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTCA GTGCTTGATCCATGTCCAGAGTCTTCAGTTTCTGAATC (SEQ ID NO:05)。
22. 检测样品中BK病毒(BKV)核酸的方法，所述方法包括 检测被怀疑具有BKV核酸的样品中至少第一核酸的存在或者不存在，所述第一核酸具有下述靶序列或者其互补序列的至少20个连续核苷酸-GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATTCA其中，所述第一核酸的5'端和3'端包含在SEQ ID NO:05内； 其中，具有所述靶序列的所述核酸存在的检测表明，所述样品含有BKV核酸。
23. 权利要求22所述的方法，其中所述检测是通过基于核酸的扩增进行的。
24. 权利要求23所述的方法，其中所述扩增产物的长度是大约30个核苷酸或 者以下。
25. 权利要求22所述的方法，进一步包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互补 序列的至少20个连续核苷酸CTGGAATTTTGTAGAGGTGAAGACAGTGTAGACGGGAAAAACAAAGG AAGTAAT (SEQ ID NO:01)。
26. 权利要求22所述的方法，进一步包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互补 序列的至少20个连续核苷酸TGAAAGTTACAGAATATTTTTCCATAAGTTTTTTATACAGAATTTGAGCAATACAGCTTGACTAAGAAACTGGTGTAGATCAGAGGGAAAGTCTTTAGGGTCTTCTACCTTTCTCTTTTTCTTGGGTGGTGTGGAGTGTTGAGAATCTGCTGTTGCTTCTTCATCACTGGCAAACATATCTTCATGGCAAAATAAATCTTCATCCCATTTTTCATTAAAGGAGCTCCACCAGGACTCCCACTCT TCTGTTCCATAGGTTGGCACCTATAA (SEQ ID NO:03)。
27.权利要求22所述的方法，进一步包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互补 序列的至少20个连续核苷酸TACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)。
28. 权利要求22所述的方法，进一步包括检测被怀疑具有BKV核酸的所述样 品中至少第二核酸的存在或者不存在，所述第二核酸具有下述靶序列或者其互补 序列的至少20个连续核苷酸AGGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGG AGGCTGCTGCTGCTATAGAAGTTCAAATTGCATCCCTTGCTACTGTAGCTCAAACATATGCTGTAATTGCTGGTGCTCCTGGGGCTATTGCTGGGTT TGCTGCTTTAA (SEQ ID NO:04)。
29. 试剂盒，其包括适于产生靶区域I、 II、 III、 IV或者V中的一种或者多种 的核苷酸序列的扩增产物的引物对。
30. 权利要求29所述的试剂盒，进一步包括用于检测所述扩增产物的探针。
31. 权利要求29所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于产生至少两种靶区 域的扩增产物的至少两对引物。
32. 下述序列的至少20个相邻核苷酸的分离核酸T(SEQIDNO:01)，或者其互补序列，其中所述核酸的长度不超过大约151个核苷 酸；(ii)TGTACATTCAGGAGAGTTTATAGAAAAAACTATTGCCCCAGGAGGT ACGGGACTGTAACACCTGCTCTTGAAGCAT (SEQ ID NO:02)或者其互补序列，其中所述核酸的长度不超过大约128个核苷酸；(iii)ATGGGTGCTGCTCTAGCACTTTTGGGGGACCTAGTTGCCAGTGTATC TGAGGCTGCTGCTGCCACAGGATTTTCAGTGGCTGAAATTGCTGCTGGGGA(SEQ IDNO:04)，或者其互补序列，其中所述核酸的长度不超过大约253个核苷酸; (iv)GGGGCTGAAGTATCTGAGACTTGGGAAGAGCATTGTGATTGGGATT者其互补序列，其中所述核酸的长度不超过大约86个核苷酸。 °
33.权利要求32所述的分离核酸，其中所述核酸被可检测地标记。
全文摘要
本发明提供了用于快速、灵敏和高度特异性地基于核酸(例如，基于DNA)检测样品中的BK病毒的方法和组合物。一般地，所述方法涉及检测具有BK病毒基因组保守区域的靶序列的靶核酸。本发明也表征了用于本发明方法的组合物和试剂盒，所述组合物包括引物、探针。
文档编号C12N7/00GK101511995SQ200680034771
公开日2009年8月19日 申请日期2006年7月25日 优先权日2005年8月2日
发明者F·陈, J·陈, L·I·孔, M·捷纳提保 申请人:焦点诊断公司