专利名称：：一种用于快速分离rna的方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于快速分离RNA的方法。更具体的，其涉及一种通过使用两种溶液的系统分离RNA的方法。本发明还涉及一种RNA分离试剂盒。
背景技术：
：和现有技术在分子生物学领域已开展广泛的研究以促进基因表达，信号转导，基因调节和转录分析的潜在机制的破解。这包括全部技术，例如反转录聚合酶链式反应(下文中，被称为RT-PCR)，northern杂交，构建cDM文库和体外翻译。基本上纯的并且未降解的RNA是用于所有上述技术的基本要素。一些用于分离RNA的组合物和步骤已描述如下CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel，F.M.，Brent,R.，Kingston,R.E.，Moore,D.D.，Seidman，J.G.，Smith,J.A.和Struhl，K.Eds,1994.JohnWileyandSons,Inc.USA)描述了RNA分离方法，其包括通过苯酚/SDS进行细胞裂解和蛋白去除，接着使用氯化锂进行RNA选择性沉淀。简言之，使用研杵在液氮中研磨组织，接着将其转移到研磨緩冲液(O.18MTris，0.09MLiCl，4.5mMEDTAand1%SDS，pH8.2)，该緩冲液以3:1的比例含有用0.2MTris，0.lMLiCl和5mMEDTA溶液(pH8.2)饱和的苯酚。在polytron中匀浆后，通过使用饱和苯酚和氯仿的数次再提取从水相中去除蛋白。如此获得的水相用詣LiCl沉淀数次。因为重复的沉淀步骤，该过程变得耗时，麻烦而且费用昂贵。Cox，R丄(在MethodsinEnzymology1968,Grosmann，L.和Moldave,K.Eds.Vol.12B，pp.120-129，AcademicPress,Orlando,FL中)描述了使用盐酸胍的RNA分.离方法。盐酸胍是一种核糖核酸酶的强抑制剂。然而，该过程是耗时的。用于分离RNA的胍盐是剧毒的。而且，一些植物组织在胍盐中难以提取。从一些组织中通过胍盐提取获得可忽略量的RNA或不能获得RNA[R.C.Bugos，V.L，Chiang,X-H.Zhang，E丄Campbell,G丄Podila，W.H.Campbell.RNAisolationfromplanttissuesrecalcitranttoextractioning画idine，Biotechniques19(1995)734-737]。Chirgwin，J.M.，Przybyla，A.E.,Macdonald，RJ.，&Rutter，W.J.(1979)Biochemistry18:5294-5299，描述了一种用强变性剂硫氰酸胍分离RNA的方法，其中阳离子和阴离子都是强效的离液剂。在该方法中，组织在含有硫氰酸胍(4M)，N-月桂基肌氨酸钠(O.5%),柠檬酸钠，pH7.0(25mM)和p-巯基乙醇(0.1M)的溶液中匀浆。上清液用1M乙酸酸化，并且RNA用0.75体积的无水乙醇在-20X:沉淀。进一步包括在氯化胍溶液(7.5M)(用含有5mM二硫苏糖醇的pH7.0柠檬酸钠緩沖)中离心后获得的RNA团块(RNApellet)的溶解。在乙酸和乙醇中在-20。C进行再沉淀3-4h。包括另一个溶解和再沉淀步骤，以进行于RNA分离。该方法的改进包括通过氯化铯梯度超速离心从匀浆中分离RNA。该方法也使用有毒的胍盐并且非常耗时。Wallace,D.M.(在MethodsinEnzymology，152:33-41;1987中)描述了基于苯酚的生物组织中的RNA的提取。用温的緩冲液饱和的苯酚，获得的水相用氯仿-异戊醇和緩冲液饱和的苯酚反萃取。重复反萃取并且RNA用乙醇通过过夜温育沉淀。该方法是耗时的，因为它需要过夜沉淀步骤。另外，在水相中没有保护RNA免受核糖核酸酶的破坏。美国专利4,843，155和Chomczynski，P.andSacchi，N.(1987)Anal.Biochem.162:156-159描述了一种用于同时分离RNA,DNA和蛋白的方法。它也被称作酸-胍盐-苯盼-氯仿(下文称为AGPC)法。在该方法中，组织在由4M硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，pH7;0.5°/。N-脂酰基肌氨酸类阴离子表面活性剂(sarkosyl)，0.1M2-巯基乙醇组成的溶剂中匀浆。通过加入用水和0.2M乙酸钠饱和的苯酚(pH4.0),经过剧烈混合的氯仿-异戊醇混合物(49:1)和离心实现相位分离。RM分入水相，而DNA和蛋白存在于有才几相和中间相中。通过加入等体积的异丙醇进行沉淀，获得的RNA团块溶解在匀浆液中并且用l体积异丙醇在-20X:沉淀1小时。用70%乙醇沖洗并且将RNA团块溶于0.5%SDS中。该方法用于RNA分离需要至少4小时。Chofliczynski，P.和Sacchi，N.(1987)Anal.Biochem，162:156-159开发的方法涉及Chirgwin，J.M.，Przybyla，A.E.，Macdonald，RJ.，&Rutter，WJ.(1979)Biochemistry18:5294-5299的石危氰酸胍方法的改进，在酸性pH下使用硫氰酸胍-苯酚-氯仿，其是快速的，但是这种AGPC法经常产生大量基因组DNA污染。Siebert，P.D.和Chenchik,A.(1993)Nucl.AcidRes.21(8):2019-2020通过加入选择性RNA沉淀步骤对AGPC法进行简单改进。其包括加入三分之一体积的95%乙醇，之后在石克氰酸胍中裂解。异丙醇沉淀步骤也从lh减少到30分钟。DNA污染显著减少。但是该方法仍需要3-4h以进行RNA分离并且不适用于抗胍盐的组织。美国专利5,945,515(Chomczynski，P.(1999))公开了一种用于同时分离RNA，DNA和蛋白的溶液。该溶液由40-60%苯酚中的石危氰酸胍盐，作为苯酚增溶剂的丙三醇和用于维持溶剂pH为或大约为4的緩冲剂组成。该混合物是均质混合物(单相)。通过加入10%氯仿实现相位分离，其导致RNA分入水相。蛋白和DNA在有机相或中间相中浓缩。通过在水相中加入等体积异丙醇进4亍RNA沉淀。RNA团块通过离心获得，并用70%乙醇洗涤且允许其干燥。非常高浓度(2-5M)的胍盐的存在使得溶液对健康非常有害。另外，抗胍盐的组织不产生任何RNA。美国专利5，777，099(Mehra，M.(1998))描述一种用于从生物来源的液体样品中分离RM的方法，其通过与双相性溶液接触，其中上层相是苯酚而下层相是含有胍盐，緩冲剂，和尿素的水相。通过加入水-不溶溶剂例如氯仿进行水相分离。RNA从获得的水相中分离。胍盐的存在使得溶液极度危害健康。另外，抗胍盐的组织不产生任何亂美国专利号5,010,183，(Macfarlane，D.E.(1991))描述了阳离子表面活性剂裂解细胞并且同时从溶液中沉淀RNA和DNA的能力。该方法与上面描述的那些方法的根本区别在于其第一步使RNA不溶，而之前描述的方法的第一步是溶解RNA。在该方法中，2%的表面活性剂节基二甲基-n-十六烷基氯化铵溶液和40%尿素和其他添加剂一起被加入细胞悬浮液，并且将混合物离心。团块在乙醇中重悬浮，通过加入盐，从中沉淀出RNA和DNA。为了将该方法应用于血液，该发明人自己发现后一表面活性剂和其他商业上可获得的表面活性剂的使用导致RNA的低效率的沉淀和血细胞的不完全裂解。美国专利号5，300,635(Macfarlane,D.E,(1994))公开了一种新的用于从生物样品中，尤其是血液中分离核酸的方法，其使用经选择的季铵表面活性剂。通过羟基季铵与选自磷酸，硫酸，甲酸，乙酸，丙酸，草酸，丙二酸，琥珀酸和柠檬酸的酸反应产生经选择的季铵。季铵可以是酰基三曱基铵(acyltrimethylammonium)或酰基千基二曱基铵(acylbenzyldimethylammonium),其中酰基包含12，14，16或18个碳原子。该方法使用4M异硫氰酸胍溶液以从核酸/季铵复合物中分离核酸，所述核酸/季铵复合物非常有害。另外，该方法主要适用于从血液和动物组织中分离RNA，而没有在植物组织上进行过实验。Feramisco，J.R.，Helfman，D.M.，Smart,J.E.，Burridge,K.，和Thomas,G.P.(在MolecularCloning(Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，andSambrook，J.，Eds.(1982)，PP.194-195，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY中)报道了另一种RNA分离方法，其中包含RNA的样品在4M硫氰酸胍，20°/。月桂基肌氨酸钠，和2-巯基乙醇的溶液中匀浆。匀浆之后，等体积的热的苯酚(60T)和乙酸钠pH5.2加入匀浆物。接着，加入等体积氯仿，并且将混合物冷却并离心。轻轻移出水相并用苯酚/氯仿溶液反萃取数次，以使产量最大化。该方法要求熟练的技术人员并且花费四至五个小时来完成并且也使用非常有害的硫氰酸胍。美国专利号20040019196(Bair，RJJr.，Heath，EM.，Meehan，H，Paulsen,KE，Wages,JM.Jr.(2004))描述了一种用于从血液，哺乳动物细胞，植物组织，细菌和真菌中分离RNA的方法。最初，在试管中，对每30mg组织样品而言加入200nL裂解/结合溶液(4LiCl，5%TritonX-IOO，5%DGME(二甘醇单乙醚)，10mMEDTA，10mMTCEP(三羧乙基磷酸)，1%鵠酸钠，在100mMTRIZMA中，pH8.8)。在roto-stator(转子-定子匀浆器)中在低速下将组织匀浆，然后在额外的时间里增加速度以彻底匀浆。匀浆后，将200pl匀浆裂解产物加入到预-净化柱(Gentra)。依赖于组织和匀浆程度，预-净化柱捕获颗粒，同时允许大部分的包含RNA的应用的裂解体积穿过过滤器。在预-净化柱中离心后，短暂涡旋在预-净化管底部的净化的裂解产物。然后，吸取净化的裂解产物的全部体积(约200到纯化柱上，所述纯化柱在篮中包含硼硅酸玻璃纤维膜(WhatmanD玻璃纤维膜)并且置于2ml离心管(microfugetube)中。然后离心管在最高速度下在微量离心机中旋转1分钟。然后离心管在微量离心机中转180度并且额外离心2分钟。在裂解产物离心和随后RNA结合到硼硅酸盐膜表面后，将200pL洗涤I溶液(5MLiCl和55%乙醇)加到柱材料并且在微量离心机中以最高速度旋转1分钟。然后包含膜的篮被转到新的离心管并且将200ja洗涤II溶液(5mMEDTA,70%乙醇，在100mMTrisHC1中pH7.6)加到柱材料并且在孩i:量离心机中以最高速度旋转l分钟。重复洗涤II溶液添加和离心步骤一次。为了从固体支持物洗脱RNA，包含膜的篮被转到新的离心管并且将50pLDEPC-处理的水加到柱材料并且以最高速度旋转1分钟。该专利没有提供任何从植物组织分离RNA的实验/数据，所述的从植物组织分离RNA通常非常困难，由于多糖和其他污染物的存在。氯化锂和其他附件的使用使得该方法很昂贵。美国专利号5,973,137(Heath，EM.(1999))描述了一种用于从人全血，植物和动物组织，培养细胞，体液，酵母，和细菌中分离RNA的方法。该发明人使用了一种"细胞裂解试剂，，，其包括溶于水中的阴离子去污剂(盐例如，十二烷基硫酸和N-月桂酰肌氨酸的钠盐，钾，和锂盐；1,8-2.2°/。重量/体积)，用浓度分别为66-7謹和130-13顿的柠檬酸钠和柠檬酸緩冲。除阴离子去污剂和緩冲剂以外，该试剂还包括螯合剂例如有效量的乙二胺四乙酸(EDTA)作为优选的试剂用于降低脱氧核糖核酸酶活性。第二试剂，在其中称为"蛋白质-DNA沉淀剂"，包括钠盐或钾盐，例如氯化钠，乙酸钠，氯化钾和乙酸钾，以相对高的盐浓度(3.8-4.2M)溶于水中。该发明人使用阴离子去污剂，例如十二烷基硫酸钠，作为核糖核酸酶抑制剂。核糖核酸酶是组织中的主要难题，尤其在老的和受压组织中。阴离子去污剂是温和的核糖冲亥酸酵4中制剂(Wallace,D.M.，在MethodsinEnzymology，152:33-41;1987中；请参考第37页第7行)，因此不适合用于具有高核糖核酸酶的组织。其次，在该方法中使用的非常高的盐浓度(3.8-4.2M)将引起非特异性RNA聚合导致尤其是小RNA(minorRNA)种类的丟失(Wallace,D.M.，在MethodsinEnzymology,152:33-41;1987中；请参考第36页倒数第2段)。现有技术的缺点在于这些方法中使用胍盐(盐酸胍和硫氛酸胍)作为主要组分。盐酸胍是非常危险的并且被CHIP(UKChemicalsHazardinformationandPackaging)鉴定为有害的并且被HCS(USHazardCommunicationstandards)鉴定为有毒的。OralRatLD50=475mg/kg。抗胍盐的组织不产生RNA或产量太少以致不能进行任何进一步的使用。市场上可获得的试剂非常昂贵。基于非-盐酸胍的方法耗时非常久。不涉及胍盐使用的溶液/方法不适用于具有高核糖核酸酶的组织，并且还会导致RNA种类的损失，这是由于使用高盐浓度抑制核糖核酸酶活性造成的。一些方法使用氯化铯在超高速离心器中进行RNA分离，所述超高速离心器是非常昂贵的仪器。并且，技术人员必须在采取所有安全预防措施的条件下操作超高速离心器，因此，该方法是非常昂贵而且耗时的。发明目的本发明的主要目的是提供一种用于快速分离RNA的方法。本发明的另一个目的是提供一种使用两种溶液的系统分离RNA的方法。另外，本发明的另一个目的是提供经济有效的，低危险性的，两种溶液的系统用于快速分离RNA。本发明的另一个目的是提供一种RNA分离试剂盒，其适合于在分子生物学中使用的下游应用，包括使用RNA作为底物的互补DNA(cDNA)的合成和进行northern杂交，聚合酶链式反应，基因克隆，探针制备和cDNA文库构建。附图简述图1表示用不同的RNA分离方法从来源于不同物种的不同组织分离的总RNA的对比，其中P，G，T和R分别代表本方法，盐酸胍，Trizol和RNeasy方法。图2表示从拟南芥cv，col-0的叶和才艮分离的总RNA。A表示从叶分离的RM而B表示从根分离的RNA。图3表示用不同量的相位分离溶液从拟南芥cv.col-0的叶分离的总RM。A，B，C和D分别包含200，400,600，和800jiL溶液I1。图4表示从马铃薯(Solanumtuberosum)，辣椒(Capsicumannum)，大黄(Rheum)，胡黄连(Picrorhiza)的叶和根分离的总RNA。A是来自马铃薯块茎的RNA，B是来自辣椒果实的RNA，C是来自大黄叶的RNA，D是来自胡黄连的叶的RM和E是来自胡黄连的根的RNA。图5表示从茶的叶芽和倒三叶(thirdleaf)分离的总RNA。M表示RNA标记；A，分离自叶芽的RNA;B,分离自倒三叶的RNA。图6表示用肌动蛋白引物基于RT-PCR扩增拟南芥cv.col-0的RNA。M表示100bp标记；C表示无模板的对照反应；A表示用拟南芥cDNA的扩增。图7表示用肌动蛋白引物基于RT-PCR扩增大黄的RNA。图8表示用wrky引物基于RT-PCR扩增拟南芥cv.col-0的RNA。M表示100bp标记。A表示带模板的对照反应而B展示500碱基对的扩增。图9表示用wrky特异性引物基于RT-PCR扩增大黄RNA。其中M是100bp标记，A是无模板的对照反应而B是700碱基对的扩增产物。图IO表示使用DFR特异性引物基于RT-PCR扩增来源于茶的叶芽和倒三叶的RNA。其中M是100碱基对标记，A是叶芽中的扩增而B是倒三叶中的扩增。图11表示用950碱基对的DFR片段作为探针与来自茶芽(A)和倒三叶(B)的RNA的northern杂交。发明简述本发明涉及一种经济有效的并且低危险性的使用两种溶液的系统的快速分离RNA的方法。其还提供一种快速的RNA分离试剂盒。其提供来源于广泛组织的RNA，所述RNA可以用于不同的下游应用，如RT-PCR，northern杂交等。发明详述因此，本发明提供了一种用于快速分离RM的方法，其中所述的方法包括步骤a)在液氮中研磨10至100mg组织使之成为细粉；b)添加1至2ml溶液I到从步骤(a)获得的粉末样品中，接着匀浆使成为细粉；c)添加600至800p1溶液II到从步骤(b)获得的粉末样品中；d)添加150至200ja1氯仿到上迷从步骤(c)获得的溶液中，接着涡旋并且将其静置于室温下IO分钟以使之分层；e)将从步骤d)获得的上层转移入新管；f)以5:3至5:4的比例将异丙醇加入到从步骤(e)获得的上述层中，接着涡旋并将其置于室温IO分钟；g)将从步骤(f)获得的溶液在约4C离心5至IO分钟，以获得希望的RNA团块；h)用70%乙醇洗涂从步骤(g)获得的产物RNA团块，接着风干；i)将从步骤(h)获得的经洗涤的团块溶于适量的经DEPC处理的水中。本发明的一个实施方式中，所述的组织选自马铃薯(Solanumtuberosum)块茎，辣椒(Capsicumannum)果实，大黄(Rheum)叶,胡黄连(Picrorhizakurroa)的叶和根，拟南芥(Arabidopsisthaliana)的叶和根。在本发明的另一个实施方式中，所述的溶液I包含pH6.0-6.8的饱和酚，阴离子去污剂，醋酸盐和螯合剂，其中各组分的比例范围分别为10:0.003:0.02:1.0至10:0.03:0.08:2.0。本发明的另一个实施方式中，所用的饱和酚优选pH小于7。在本发明的另一个实施方式中，所用的阴离子去污剂选自十二烷基硫酸盐或N-月桂酰肌氨酸。本发明的另一个实施方式中，所用的阴离子去污剂的量为大约0.3-1%重量/体积,优选大约0.5-0.6Wv。本发明的另一个实施方式中，所用的醋酸盐选自钠盐或钾盐。本发明的另一个实施方式中，所用的醋酸盐浓度为0.2-0.8M。本发明的另一个实施方式中，所用的螯合剂选自乙二胺四乙酸的二钠盐和二钾盐。本发明的另一个实施方式中，溶液II包含溶于具有17-18.2mega-欧姆传导率的去离子水中的焦碳酸二乙酯。在本发明的另一个实施方式中，所用的焦碳酸二乙酯浓度为大约0.1%体积/体积。在本发明的另一个实施方式中，分离的RNA被检验用于分子生物学的下游应用。另外，本发明还提供了一种快速的RNA分离试剂盒，包括a)溶液I;b)溶液II;c)使用所述溶液的说明书。本发明提供了一种经济有效的，低危险性的，两种溶液的系统用于快速分离RNA，其包括包含緩冲液饱和酚(pH小于7)，SDS(0.1-1%),EDTA(10-20mM)，乙酸钠(0.3-0.8M)的溶液I，和包含经DEPC(0.001-0.1%)处理的去离子水的溶液II。溶液系统可以用于从不同组织中分离RNA。整个分离RNA的过程需要的时间小于1小时并且其提供了纯的且高质量的RNA。用拟南芥(植物生物学上的一种模型植物系统)的叶对溶液II的最适量进行标准化。改进的方法用于广泛的植物材料，包括马铃薯的块茎(糖类丰富)，辣椒的果实，大黄叶(抗含胍的溶液)，胡黄连的叶和4艮，拟南芥的叶和才艮，和山茶(Camelliasinensis)的叶芽和倒三叶(含大量多酚的组织)。表l中给出用本发明方法和其他方法分离的RNA的产量的对比数据。表1分离的RNA的产量的对比数据<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>下面的实施例以本发明的举例说明的方式给出并且不应理解为限制本发明的范围。实施例1制备用于分离RNA的溶液为了制备溶液I，用Tris-(羟甲基)-氨基曱烷(Tris)緩冲剂饱和苯酚至pH6.7±0.2。之后，添加0.3-1%十二烷基硫酸钠，0.2-0.8M乙酸钠和10-20mMEDTA。单独制备溶液II，其中将0.1%DEPC(终浓度)加入具有传导率17-18.2mega-欧姆的去离子水中。溶液过夜放置后高压灭菌。实施例2使用如下方法分离总RNA:使用基于盐酸胍的方法分离RNA:(Singh,G.，K醒r，S.和Singh,P.2003.AquickmethodtoisolateRNAfromwheatandothercarbohydrate-richseeds.PlantMolecularBiologyReporter21:93a-93f)1.将组织(lg)在液氮中研磨成细粉。将粉末转入包含5mlGH緩冲液[8M盐酸胍，20mM乙二胺四乙酸(EDTA)，20mMMES{2-(N-吗啉)乙磺酸}，p巯基乙醇，200mM;pH7.0]的新的研钵并且进一步研磨。2.将获得的匀浆转移到含有等体积PCI(苯酚氯仿异戊醇)的oak-ridge管。3.通过涡旋使相乳化并且通过在10，000rpm离心20分钟(7°C)分离相。4.将上层水相转移到新的oak-ridge管并且用等体积CI萃取。5.将获得的上层水相转移到Corex管并且通过加入0.2体积的1M乙酸和0.7体积的冷的乙醇沉淀RNA。6.将管置于-72°C3小时。7.使沉淀物团块化，接着在4X:和10，000rpm下旋转10分钟。团块用5ml3M乙酸钠(pH5.2)洗涤三次，接着最后用70%的冷的乙醇洗涤。8.干燥团块并且溶于最小体积的经DEPC-处理的ADW。用TRIzol试剂分离RNA:1.将组织(100mg)在液氮中研磨使成为细粉。2.添加lmlTRIzol试剂并且进一步用研棒和研钵研磨成细粉。3.在15至30。C温育勻浆样品5分钟。每mlTRIzol试剂加0.2ml氯仿。剧烈震动管15秒并且在15至30匸温育2至3分钟。4.以12，OOOxg在4C下离心样品15分钟。5.将水相转移至新管。6.通过与异丙醇混合从水相沉淀RNA。每lmlTRIzol试剂加入0.5ml异丙醇用于初始匀浆。7.在15至3(TC温育样品IO分钟。8.以12，000xg在4。C离心样品IO分钟。9.除去上清液。用75。/。的乙醇洗涤RNA团块并风干。10.将RNA溶于30-50n1无核糖核酸酶的水中。用于RNA分离的RNeasyPlantMiniProtocol(QIAGEN):1.将组织(100mg)在液氮中用研棒和研钵研磨使成为细粉。转移组织粉末到2ml管。不要使样品解冻。2.向最大量lOOmg组织粉末中加入450|i1緩冲液RLC(含有盐酸胍)。剧烈涡旋。在使用前，确保10m1P-ME被加入至lml緩沖液RLC中。3.将裂解产物应用于置于2ml收集管中的QIAshredder旋转柱，并且在最大速度下离心2分钟。从QIAshredder中转移流出液部分至新管，不打乱收集管中的细胞碎片团块。4.将0.5体积乙醇加入到纯化的裂解产物中通过吸打充分混合。5.将包括任何可能形成的沉淀物的样品应用至置于2ml收集管中的RNeasymini旋转柱上。在10，OOOrpm下离心15秒。6.在RNeasy柱上添加700ju1緩冲液RW，并且在10，OOOrpm下离心15秒以进行洗涤。弃去流出液和收集管。7.转移RNeasy柱到新的2ml收集管中。将500pl緩冲液RPE添加到RNeasy柱上并且在10，OOOrpm下离心15秒。8.将500ju1緩沖液RPE添加到RNeasy柱，并且以最高速度离心2分钟以干燥RNeasy膜。9.将RNeasy旋转柱置于新的2ml收集管中，并且将旧的收集管和滤液一起弃去。全速离心1分钟。10.将RNeasy柱转移到新的1.5ml收集管中，并将50y1无核糖核酸酶的水加到RNeasy膜的正上方。在10，OOOrpm下离心1分钟以洗脱RM。用本发明方法分离RNA:a.将拟南芥的叶UOOmg)在液氮中用研棒和研钵研磨使之成为细粉。b.加入2ml溶液I。c.在研钵中匀浆使之成为细粉。d.加入800ju1溶液II。e.将样品转移到2.Omleppendorf管中。f.加200pi1氯仿。g.涡旋并在室温下放置10分钟。h.在室温下离心IO分钟。i.将上层水相转移到新的2.Omleppendorf管中。j.加O.6体积的异丙醇。k.涡旋并在室温下静置10分钟。1.在4。C离心5分钟。m.用70%的乙醇洗涤获得的RNA团块，风干并且溶于适量经DEPC处理的水中。通过扫描220至320nm的吸光率定量RNA;通过计算在26Q和280nm下测量的吸光率的比值测定纯度。在260/280nm下>1.8的数值被认为对本研究的目标是理想的。用于计算RNA浓度和产量的公式如下RNA浓度(ng/ml)=A26。(260nm下的吸光率)x40x稀释系数总产量(jug)=浓度x保存的RM样品的体积分离的RNA的质量在含有曱醛的1.2%琼脂糖凝胶上进行分析。为了检验RNA的完整性，4.5jul经DEPC处理的高压灭菌水中的5-6jLigRNA用15.5|u1Ml溶液(2p15xMOPS緩沖液，3.5|u1甲醛和10pl曱酰胺[5xM0PS緩冲液300mM乙酸钠，10mMMOPS(3-{N-吗啉丙烷磺酸}，0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA)]稀释并且在65"C下温育15分钟。加入2jal甲醛-凝胶上样緩冲液[50%甘油，lmMEDTA(pH8.0)，0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯蓝FF]后,将RNA上样到1.2%曱醛琼脂糖凝胶，并且在1xMOPS緩冲液中(60mM乙酸钠，2mMMOPS和0.lmMEDTA)在72伏特下电泳，如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，(1989)(在MolecularCloning:ALaboratoryManual:ColdSpringharborLaboratoryPress,Plainview,NY中)所述。用lOOmg叶获得153)igRNA(表2)。图2显示分离的RM是完整的，因为它显示出完整条带。表2来自不同组织的RNA产量<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>用实施例2中提及的本发明方法和其他方法分离的RNA产量的对比数据在表l中给出。实施例3对加入到勻浆中的溶液II的量进行改变，以研究其对RNA数量和质量的影响。拟南芥的叶用作起始材料并且该方法基本上按照所描述的，除了在匀浆物中加入200m1，400ja1，600ji1和800m1溶液II。从表2和图3中显示出800n1溶液II产生最佳结果。表3不同体积溶液II对RNA产量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例4改进的溶液用于从不同的植物种类中分离RNA。所用的样品为马铃薯块茎(富含糖类)(图4-A)，辣椒果实(图4-B)，大黄叶(抗含胍溶液)(图3-C)，胡黄连叶(图4-D)和根(图4-E),拟南芥叶和根(图2)，和山茶(茶)叶芽和倒三叶(富含多酚)(图5)。用于分离的方法，RNA数量和质量的测定与实施例2中所描述的一样。取决于所用的组织，产量可高达215yg/100mg组织。表l描述了获自不同组织的产量。实施例5为了评估RNA用于下游应用的适用性，用来源于拟南芥根和芽，和大黄叶的RNA进行反转录(RT)聚合酶链式反应(PCR)。总RNA(2|ig)用脱氧核糖核酸酶I酶解(Cat.No.18068-015Invitrogen，U.S.A.),使用oligodT引物(Cat.No.18418-012，Invitrogen,U.S.A.),用superscriptII反转录酶(CatNo.18064-022，Invitrogen,U.S.A.)进行反转录以合成cDM。上述两个反应中，按照厂家的说明书进行。对于PCR扩增，特异针对p肌动蛋白的寡核苷酸引物用于扩增该DM，经35个循环，其中，循环定义为94X:30秒，52匸l分钟，和72X:l分钟。反应混合物的组成如下<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>扩增的DNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳。一个500碱基对的条带被扩增，扩增是来源于拟南芥(图6)和大黄(图7)的cDNA。使用合成自拟南芥和大黄RNA的cDNA，用特异针对转录因子wrky的寡核苷酸引物进行另一个PCR。用于wrky引物35个循环扩增DNA的循环参数是94C30秒，48X:45秒和"72。C1分钟。扩增产物用1.5°/。琼脂糖凝胶显象。500碱基对(图8)和700碱基对(图9)扩增产物分别从拟南芥和大黄中获得。测序证实它们是wrky片段。如其他地方所述，用分离自茶芽和倒三叶的RNA合成互补DNA。为了PCR扩增，特异针对黄烷酮醇-4-还原酶(DFR)的寡核苷酸引物用于扩增35个循环，其中循环参数定义为30秒，40秒，和2分钟。扩增的DNA经过1.5%琼脂糖凝胶在80伏特电泳2小时。如图IO所示，扩增得到950碱基对的条带并且进一步测序证实它是DFR片段。因此，本实验明确表明分离的RNA适用于RT-PCR分析这一下游应用。实施例6进一步评估RNA用于下游应用的适用性，用来源于茶芽和倒三叶的RNA进行northern杂交，使用获自实施例5的950碱基对扩增产物作为探针。在1.5%琼脂糖凝胶上显象扩增产物后。从凝胶切下条带并且用来自M/sQiagen,德国的QIAEXIIGelExtraction试剂盒按照厂家的说明书洗脱DNA。纯化的片段使用HotPrime试剂盒(M/sGenHunterCorporationNashville,U.S.A.)用a-[32P]dATP(4000Ci/mmole)进行放射性标记。用QIAquickNucleotideRemoval试剂盒(QIAGEN，Germany)除去未结合的放射核苷。放射性标记探针用于杂交实验。对于杂交，15jugRNA在1.oy。曱醛琼脂糖凝胶上电泳，基本上如实施例2中所述。电泳后，用经DEPC处理的高压灭菌水洗涤凝胶两次，每次15分钟并振荡。然后用10xSSPE(10xSSPE:1.5M氯化钠，115mMNaH2P04，10mMEDTA)洗涂两次，每次20分钟，并振荡。尼龙膜在DEPC水中浸湿，然后在10xSSPE中浸泡5分钟，并轻轻振荡。然后将RNA真空杂交(使用40mbar压力)到尼龙膜上，其中用经DEPC处理的10xSSPE作为转移介质。转移进行4个小时。在从真空杂交仪中除去凝胶前将压力增加到70mbar持续15分钟。在尼龙表面在UV光源下，对RNA标记的位置进行标记。将膜干燥并且在80X:烘干2小时。在5xSSPE中简单漂洗后，将膜在预杂交溶液(50%甲酰胺，0.75MNaC1，50mM磷酸钾，pH7.4,0.5mMEDTA，0.簡coll-400,0.1°/。牛血清白蛋白，0，1%聚乙烯吡咯烷酮，Q.1。/。SDS溶液和150jag新鲜煮沸的鲑鱼精子DNA)中浸泡5小时。放射性标记的探针通过煮沸10分钟进行变性，然后添加至预杂交溶液。杂交进行16小时。除去溶液并且在室温下用含有0.1°/。SDS的1xSSC(20xSSC:3M醋酸钠和0.3M二水合柠檬酸钠，pH7.Q)洗涤膜2次，每次15分钟。最后在60X:用预热的含有0.1%SDS的0.25xSSC洗涤15分钟。将膜包装入saran包装材料并且暴露于X射线胶片48小时。图11表示探针给出信号。该结果进一步证明了分离的RNA适合于下游应用。优点本发明的主要优点1.本发明提供高质量的RNA。2.用本发明方法可分离高质量和数量的RNA。3.本发明方法可以用于不同的组织系统。4.本发明提供了经济有效而快速的RNA分离方法。5.本发明适用于抗胍盐的组织。权利要求1.一种用于快速分离RNA的方法，其中所述方法包括步骤a)在液氮中研磨植物组织使其成为细粉；b)在从步骤(a)中获得的粉末样品中以1:10至1:50的比例添加溶液I，接着匀浆使其成为细粉；c)在从步骤(b)中获得的粉末样品中添加溶液II，其中所用的溶液I和溶液II的浓度的比例范围为5:3至5:2；d)在从步骤(c)获得的上述溶液中添加氯仿，接着涡旋并且在室温下静置10分钟以分层；e)将从步骤(d)获得的上层转移到新管中；f)在从步骤(e)获得的上述层中以5:3至5:4的比例添加异丙醇，接着涡旋并且在室温下静置10分钟；g)在大约4℃下将从步骤(f)获得的溶液离心5至10分钟以获得期望的RNA团块；h)用乙醇洗涤从步骤(g)获得的产物RNA团块，然后风干；i)将从步骤(h)获得的经洗涤的团块溶于适量的经DEPC处理的水中。2.权利要求1的方法，其中所述组织选自马铃薯(Solanumtuberosum)块茎，辣椒(Capsicumannum)果实，大黄(Rheum)叶，胡黄连(Picrorhizakurroa)的叶和才艮，拟南芥(Arabidopsisthaliana)的叶和根。3.权利要求l的方法，其中所述溶液I包含pH6.0-6.8的饱和酚，阴离子去污剂，醋酸盐和螯合剂，其中各个组分的比例范围分别为10:0.003:0.02:1.0至10:0.03:0.08:2.0。4.权利要求3的方法，其中酚用Tris-(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)緩冲液饱和。5.权利要求3的方法，其中所用的阴离子去污剂选自十二烷基硫酸盐或N-月桂酰肌氨酸。6.权利要求3的方法，其中所用的醋酸盐选自钠盐或钾盐。7.权利要求3的方法，其中所用的螯合剂选自乙二胺四乙酸的二钠盐和二钾盐。8.权利要求1的方法，其中所述溶液II包含溶于具有17-18.2mega-欧姆的传导率的去离子水中的焦碳酸二乙酯。9.权利要求l的方法，其中所用的焦碳酸二乙酯的浓度为大约0.1%体积/体积。10.快速RNA分离试剂盒，其包含a)溶液I;b)溶液II;c)使用所述溶液的说明书。全文摘要本发明涉及一种用于快速分离RNA的方法。更具体的，其涉及一种通过使用两种溶液的系统分离RNA的方法。本发明还涉及一种RNA分离试剂盒。文档编号C12N15/10GK101437941SQ200680054561公开日2009年5月20日申请日期2006年7月31日优先权日2006年3月30日发明者A·拉尼,J·雷扎达,K·辛格,P·K·巴德瓦杰,S·库玛,S·格瓦纳申请人:科学与工业研究会