生物分子表面展示及其用途的制作方法

专利名称：生物分子表面展示及其用途的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及生物分子表面展示系统，以及展示作为疫苗的膜糖蛋 白的特定应用。具体而言，本发明涉及治疗和/或预防禽流感的方法、疫苗、 免疫组合物和试剂盒，以及涉及调节对禽流感病毒的免疫应答的相关方
法。更具体而言，本发明涉及用于治疗和/或预防毒株H5Nl禽流感病毒的 方法、疫苗、免疫组合物和试剂盒，以及涉及用于调节对毒抹H5N1禽流 感病毒的免疫应答的方法。
背景技术：
禽流感病毒是重大的世界性的乌类传染病，其是由流感病毒的A型毒 林引起的。所有鸟类被认为容易感染该疾病，这可产生从轻微发病到高度 接触传染范围内的症状以及迅速致命的发病机理，导致严重的流行病。
已知15种流感病毒亚型传染鸟类，因此在鸟群内提供了广泛的流感病 毒贮存宿主。具体而言，因为候鸟对传染具有天生抵抗力，因此它们对传 染其他鸟群，诸如特別容易感染迅速致命流感流行病的家禽，提供了有力 的载体。高致病形式的所有爆发都是由亚型H5和H7的流感A病毒引起。
受染地区的检疫以及受染或暴露群体的毁灭是针对防止禽流感病毒传 播的标准程序。然而，此类措施不仅受阻于高接触传染性、易于传播性以 及病毒在其天然宿主体外的长期稳定性，而且就实施此类措施以及对鸟类 的毁灭而言，它们还导致巨大的经济代价。
1997年在香港，禽流感病毒的H5N1毒林从鸟类直接转移到人，在18 个人身上引发严重的呼吸系统疾病，其中6人死亡。此次传染与由相同毒 株引起的禽流感病毒的香港家禽种群流行病同时爆发。2003年的另一次爆 发引发2例并且1人死亡。人类感染禽流感病毒的进一步病例已经在几个国家观察到，包括荷兰、越南和中国。另外，鸟类感染H5N1毒林的最近 爆发已经在东欧特别是土耳其进行了报道。
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的病毒捕获基因。另外，来自H5N1的分离林具有高致病性并且能够在人 身上引发严重的疾病。从感染中幸存的鸟类经口以及通过粪便排泄病毒至 少10天，从而促进了活家禽市场上以及通过候鸟的进一步传播。
有关人感染H5N1禽流感病毒的临床进展的数据非常有限，并且抗病毒 药——其中仅有一些可以被用于治疗和预防——也具有局限性。
本发明基于生物分子表面展示系统的开发，以及此类系统展示作为疫 苗的膜糖蛋白的特定应用。具体而言，本发明涉及治疗和/或预防禽流感的 方法、疫苗、免疫组合物和试剂盒，以及涉及用于调节对禽流感病毒的免 疫应答的相关方法。

发明内容
根据本发明的第一方面，提供用于呈递或展示多肽的方法，其中所述 方法包4舌
(a) 将编码所述多肽的核酸插入杆状病毒表达载体中，其中所述杆状病 毒表达载体包括来自白斑综合症病毒的iel启动子；
(b) 用所述表达载体转染至少一种宿主细胞；和
(c) 从所述表达载体中表达所述多肽，其中所述多肽被呈递或展示在杆 状病毒的表面膜上。
根据本发明的第二方面，提供用于呈递或展示多肽的系统，其中所述 系统包括
(a) 编码所述多肽的核酸，其被插入杆状病毒表达载体中，其中所述杆 状病毒表达载体包括来自白斑综合症病毒的iel启动子；
(b) 用所述表达载体转染至少一种宿主细胞的方法；和
(c) 用于从所述表达载体表达所述多肽的方法，其中所述多肽被呈递或展示在杆状病毒的表面膜上。
根据本发明的第三方面，提供用于治疗或预防受治疗者疾病的疫苗， 其中所述疾病与禽流感病毒有关，并且其中所述疫苗包括含有编码血凝素 肽的核酸的表达载体，使得在使用时所述血凝素肽通过所述表达载体在所 述受治疗者中表达。
受治疗者可以是人、禽或猪。
禽流感病毒可以是禽流感病毒的H5N1亚型。
表达载体可以包括杆状病毒表达载体。所述杆状病毒表达载体可以是 含有水泡性口膜炎病毒糖蛋白的假性病毒载体。
表达载体可以进一步包括启动子。所述启动子可以包括来自白斑综合
症病毒的iel启动子。该启动子可以可操作连接至编码抗原肽的核酸。 血凝素肽可以包括来源于禽流感病毒的H5N1亚型的氨基酸序列。
根据本发明的第四方面，提供用于治疗或预防受治疗者疾病的疫苗， 其中所述疾病与禽流感病毒相关，并且其中所述疫苗包括表达载体，其包 含
(a) 编码血凝素肽的核酸；和
(b) 来自白斑综合症病毒的iel启动子，其与编码血凝素肽的所述核酸可 操作连接，使得在使用时，所述血凝素肽通过所述受治疗者中的所述表达 载体表达。
根据本发明的第五方面，提供表达载体，其中所述表达载体包括
(a) 编码抗原肽的核酸；和
(b) 与编码抗原肽可操作连接的、来自白斑综合症病毒的iel启动子， 其中所述抗原肽包括血凝素肽，其包含来源于禽流感病毒的H5N1亚型
的氨基酸序列。
根据本发明的第六方面，提供第五方面所述的用于治疗或预防受治疗 者疾病中的表达载体，其中所述疾病与禽流感病毒相关，使得在应用时， 所述抗原肽通过所述受治疗者中的所述表达载体表达。
7根据本发明的第七方面，提供宿主细胞，其包含第五或第六方面所述 的表达载体。
根据本发明的第八方面，提供组合物，其包括选自第三或第四方面所 述的疫苗、第五或第六方面所述的表达载体或者第七方面所述的宿主细胞 的免疫增强剂，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
所述组合物可以任选包括佐剂。
根据本发明的第九方面，提供用于治疗或预防受治疗者疾病的疫苗， 其包括第五或第六方面所述的表达载体、第七方面所述的宿主细胞或者第 八方面所述的组合物，其中所述疾病与禽流感病毒有关。
根据本发明的第十方面，提供用于调节免疫应答的方法，其中所述方 法包括向受治疗者施用有效量的免疫增强剂，所述免疫增强剂选自第三、 第四或第九方面所述的疫苗、第五或第六方面所述的表达载体、第七方面 所述的宿主细胞或者第八方面所述的组合物。
根据本发明的第十 一方面，提供用于治疗或预防与禽流感病毒有关的 疾病的方法，其中所迷方法包括向受治疗者施用有效量的免疫增强剂，所 述免疫增强剂选自第三、第四或第九方面所述的疫苗、第五或第六方面所 述的表达载体、第七方面所迷的宿主细胞或者第八方面所述的组合物。
根据本发明的第十二方面，提供第三、第四或第九方面所述的疫苗、 第五或第六方面所述的表达载体、第七方面所述的宿主细胞或者第八方面 所述的组合物在调节免疫应答方面的用途。
根据本发明的第十三方面，提供第三、第四或第九方面所述的疫苗、 第五或第六方面所述的表达载体、第七方面所述的宿主细胞或者第八方面 所述的组合物，在制造用于治疗与禽流感病毒有关的疾病的药物方面的用 途。
根据本发明的第十四方面，提供用于治疗或预防受治疗者疾病的试剂 盒，其中所述疾病与禽流感病毒有关，其中所述试剂盒包括第三、第四或 第九方面所述的疫苗、第五或第六方面所述的表达载体、第七方面所述的 宿主细胞或者第八方面所述的組合物。


现在将参考下列附图描述本发明，其仅为实例的方式。
图1.重组杆状病毒的构建和产生。(A) vAc-杆粒、vAc-HA和vAc-G-HA 的基因组的示意表示。利用Bac-to-Bac系统，期望的VSVG或HA表达盒 经过位点专一转座^^皮插入多角体蛋白基因座中。(B)在感染vAc-G-HA的 Sf9细胞中形成合胞体，如通过白色箭头所示。图像在转导后72小时时捕 获。(C)一步生长曲线。每个数据点表示三个单独的感染的平均值。Sf9细 胞通过单个病毒来感染，其中MOI为0.5。
图2.展示在杆状病毒载体表面上的HA的表征。(A)在纯化vAc-HA和 vAc-G-HA颗粒中的HA的膜締合。纯化H5N1毒粒用作阳性对照。泳道 1，纯化vAc-杆粒毒粒作为阴性对照；泳道2，纯化核衣壳，来自用Triton X-100处理的vAc-G-HA毒粒；泳道3，完整的vAc-G-HA毒粒；泳道4， 来自用vAc-G-HA感染的Sf9细胞的总细胞提取物；泳道5，来自用 vAc-G-HA感染的Sf9细胞的总细胞提取物；泳道6,完整的vAc -HA毒 粒；泳道7，纯化核衣壳，来自用TritonX-100处理的vAc-HA毒粒。(B) 在纯化vAc-G-HA颗粒中VSV G的膜締合。泳道1-4是与(A)相同的样品。 (C)展示HA的杆状病毒的血凝活性。利用连续两倍稀释的纯化vAc-G-HA 颗粒和每测试孔0.5%鸡红细胞悬浮液确定血凝滴度，起始稀释为1:2。
图3. (A)和(B) HA基因通过vAc-G-HA的转导。MDCK或Df-l细胞用 MOI为100的vAc-G-HA转导。16 h后，固定细胞进行IFA试验，或者收 获细胞进行蛋白质印迹分析。(A)在用HA1特异性单克隆抗体的IFA试验 中，转导哺乳动物细胞的荧光显微照片。箭头指向阳性荧光细胞。利用倒 置荧光显微镜术检测荧光信号，并通过数字图像系统捕获图像。(B)利用抗 HA1血清，通过蛋白质印迹分析检测两种转导细胞中的HA。泳道1,MDCK 细胞提取物；泳道2， Df-I细胞提取物；泳道3，纯化的H5N1毒粒，作为 阳性对照。(C)通过抗原捕获ELISA，量化展示在vAc-G-HA毒粒上的HA 分子。在试验中，来自豚鼠的纯化IgG和单克隆抗体分别被用作检测物和 捕捉抗体。10倍连续稀释的HA1蛋白质被用于建立如所示的标准定量曲 线。
9图4. (A) vAc-G-HA的抗原分析。 一组5只小鼠(Ml- M5)被月几内注射 vAc-G-HA颗粒。两只对照小鼠(C1和C2)被注射等量的纯化vAc-杆粒毒 粒。通过ELISA监测诱导抗体，其中HA1蛋白质被包被作为捕捉抗原。 结果以1:10稀释血清的平均吸光度表达。(B)用vAc-G-HA免疫处理的小 鼠的血清HI滴度。ffl滴度纟皮表达为两倍血清稀释的终点。
图5. (A)展示HA的杆状病毒的抗原分析。三组5只小鼠各自被肌内注 射vAc-G-HA、 vAc-HA、灭活H5N1/PR8和vAc-杆粒。通过ELISA用包 被的纯HAI蛋白作为捕捉抗原来测试来自各组的收集血清样品。结果表示 为1:10稀释血清的平均吸光度。(B)对来自免疫小鼠的收集血清的HI试 验和中和试验。HI滴度被表达为两倍血清稀释中的终点。在中和试验中， 从10至640的2倍系列稀释液与含有2 x 103 TCID5Q/ml的流感病毒的等 体积病毒稀释液混合。通过IFA试验利用多克隆抗HA1抗体监测病毒蛋白 质的存在。中和滴度以系列稀释中的终点表达。
定义
如本文所用，术语"包括(comprising)"是指"主要但未必仅仅包括。" 此外，词语"包括，，的变体，诸如"包括(comprise)"和"包括(comprises)" 具有相应变化的含义。
如本文所用，术语"治疗(treating)"和"治疗(treatment)"是指任何和 所有用途，其治疗病症或症状，预防病症或症状的产生，或者另外以其他 任何方式预防、阻碍、延迟、改善或逆转病症或疾病或其他不良的症状。
如本文所用，术语"有效量(effective amount)"在其含义内包括无毒但 是可提供期望效果的足够量的药物或化合物。所需的确切数量将在受治疗 者间有所变化，这i[又决于诸如被治疗的物种、受治疗者的年龄和综合状态、 被治疗的病症的严重度、被施用的特定药物以及施用方式之类的因素。因 此，规定确切的"有效量"是不可能的。然而，对于任何给定的情况，适当 的"有效量，，可以由本领域技术人员仅仅利用常规试验则可以确定。
如本文所用，术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"可互换使用来指氨基酸残基的聚合物以及指它们的片段、变体、类似物、直向同源物(orthologues)
或同源物。因此，这些术语适用氨基酸聚合物——其中一个或多个氨基酸 残基是合成的、非天然的氨基酸，诸如相应的天然氨基酸的化学类似物， 以及适用天然的氨基酸聚合物。
如本文所用，术语"多核脊酸"或"核酸"可被互换施用并且表示包含一个
或多个核苷酸或寡核苷酸或其片段的分子，包括但不限于RNA或DNA核 香酸或其组合。
在术语的范围内，如本文所用的"蛋白质"、"多肽"、"肽"、"多核苷酸" 和"核酸"是它们的片段和变体，包括但不限于多核苷酸和核酸的反向互补 (reverse compliment)和反义形式。
术语"片段"是指编码全长蛋白质或基因或者是全长蛋白质或基因的组 成部分的多核苷酸或多肽序列。就多肽而言，片段可以具有与全长蛋白质 相同的定性生物活性。
如本文所用术语"变体"是指基本类似的序列。通常地，核酸序列变体可 以编码具有相同的定性生物活性的多肽。通常地，多肽序列变体也可以具 有相同的定性生物活性。此外，这些多肽序列变体可以共享至少50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97°/。、 98%或99% 的序列同同一性。
此外，变体多肽可以包括类似物，其中术语"类似物，，是指为所公开多肽 的4汙生物的多肽，该衍生物包括一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代， 使得多肽基本保留与其所衍生的天然多肽相同的功能。
如本文所用，术语"表达载体"是指核酸，其具有提供其可操作连接的核 酸片段在细胞或无细胞表达系统中进行表达的能力。在本发明的上下文 中，应当理解，包括如本文所定义的启动子的表达载体可以是质粒、噬菌 体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段，或者其他能够保持和/ 或复制可表达形式的异源DNA的核酸，如果其被引入细胞中的话。
如本文所用，术语"可操作连接"是指转录和翻译调节的多核苦酸，其相 对于编码多肽的多核香酸以使得多核苷酸被转录以及多肽被翻译的方式
ii进行定位。
如本文所用，术语"启动子"包括基因组基因的转录调节序列，其包括
TATA框或起始子元件，其可以是精确转录起始必需的，具有或不具有另
外的调控元件，所述调控元件响应发育和/或外刺激或者以组织特异性方式 改变基因表达。在本发明的上下文中，术语"启动子"也被用于描述重组、 合成或融合分子，或者衍生物，其赋予、激活或增强其可操作连接的核酸 以及编码肽的核酸的表达。
如本文所用，短语"禽流感病毒"包括引发或怀疑引发受治疗者疾病的任 何病毒，其包括但不限于禽、猪或人类受治疗者。具体而言，"禽流感病毒"
包括所有类型的禽流感病毒，包括4旦不限于A型，以及禽流感病毒的所有 亚型，包括但不限于亚型H5 (特别是H5N1和H5N2)和H7 (特别是H N1)。
如本文所用，短语"与禽流感病毒有关的疾病"是指由禽流感病毒引起或 与其有关的任何疾病、疾病状态或病症。
如本文所用，术语"调节(modulating)"当涉及免疫应答使用时，是指 直接或间接增加或减小对抗原的免疫应答。
具体实施例方式
本发明人已经开发了生物分子表面展示系统，以及其展示作为疫苗的 膜糖蛋白的特定应用。具体而言，本发明人已经通过协同表面展示以及病 毒血凝集素(HA)蛋白质的基因转导展示了杆状病毒表达系统作为对抗流 感病毒的免疫试剂的应用。免疫显性病毒膜HA蛋白质以及VSV G蛋白在 重组杆状病毒表面上的有效展示在对抗流感病毒的接种疫苗策略上提供 很大的优势。除这种杆状病毒表达系统作为接种疫苗载体的应用之外，病 毒膜展示系统也可以被用于表征很多种病毒膜糖蛋白的结构和功能。
在来自白斑综合症病毒的iel启动子的控制下，利用杆状病毒载体， H5N1流感病毒的HA基因被有效表达在昆虫和哺乳动物细胞中。HA与水 泡性口膜炎病毒糖蛋白的同时展示不会降低在杆状病毒表面上HA展示的 效力。部分裂解的HA蛋白质一皮展示在杆状病毒表面上，从而赋予病毒颗粒血凝活性。将展示HA的纯化杆状病毒肌内注射进入小鼠中刺激了具有 血凝抑制活性的抗体的产生。这种杆状病毒表达系统因此包含抗原HA肽 作为结构蛋白并且维持通过体内转导表达肽的能力。
呈递或展示生物分子的方法、试剂盒和系统
本发明公开了生物分子表面展示系统，以及此类系统展示作为疫苗的 膜糖蛋白的特定应用。如对于本领域技术人员显而易见的是，这些生物分 子表面展示系统不限于在此所公开的特定应用，而是在期望呈递生物分子 特别是膜糖蛋白的任何情况下找到广泛应用。
因此，在一个实施方式中，本发明公开了涉及膜糖蛋白表面展示的疫 苗生产的方法、试剂盒和系统。这些方法、试剂盒和系统可以利用在此所
示例的基于杆状病毒的表面展示系统，其与抗毒抹H5N1禽流感病毒的疫 苗生产相关。然而，本领域技术人员将意识到并且理解，涉及膜糖蛋白表 面展示的疫苗生产的方法、试剂盒和系统并不限于本文所公开的疫苗的生产。
因此，本发明提供用于呈递或展示多肽的方法，其中所述方法包括
(a) 将编码所述多肽的核酸插入杆状病毒表达载体中，其中所述杆状病 毒表达载体包括来自白斑综合症病毒的iel启动子；
(b) 用所述表达载体转染至少一种宿主细胞；和
(c) 从所述表达载体中表达所述多肽，其中所述多肽被呈递或展示在杆 状病毒的表面膜上。
本发明进一步提供用于呈递或展示多肽的系统，其中所述系统包括
(a) 编码所述多肽的核酸，其被插入杆状病毒表达载体中，其中所述杆 状病毒表达载体包括来自白斑综合症病毒的iel启动子；
(b) 用所述表达载体转染至少一种宿主细胞的方法；和
(c) 用于从所述表达载体表达所述多肽的方法， 其中所述多肽被呈递或展示在杆状病毒的表面膜上。疫苗
本发明也提供用于治疗或预防受治疗者疾病的疫苗，其中所述疾病与 禽流感病毒有关，并且其中所述疫苗包括含有编码血凝素肽的核酸的表达 载体，使得在使用时所述血凝素肽通过所述表达载体在所述受治疗者中表 达。
受治疗者可以是人、禽或猪。
禽流感病毒可以是禽流感病毒的H5N1亚型。
表达载体可以包括杆状病毒表达载体。所述杆状病毒表达载体可以是 具有水泡性口膜炎病毒糖蛋白的假性病毒载体。
表达载体可以包括启动子。所述启动子可以包括来自白斑综合症病毒 的iel启动子。该启动子可以可操作连接至编码抗原肽的核酸。
血凝素肽可以包括来源于禽流感病毒的H5N1亚型的氨基酸序列。
本发明也包括用于治疗或预防受治疗者疾病的疫苗，所述疫苗包括如 本文所述的表达载体、宿主细胞或组合物，其中所述疾病与禽流感病毒有 关。
表达载体和宿主细胞
本发明也提供包含编码抗原肽的核酸的表达载体，其中所迷抗原肽包 括血凝素肽，该血凝素肽包括来源于禽流感病毒的H5N1亚型的氨基酸序 列。
本发明进一步提供包含编码抗原肽的核酸的表达载体，用于治疗或预 防受治疗者疾病，其中所述疾病与禽流感病毒相关，使得在应用时，所述 抗原肽通过所述受治疗者中的所述表达载体表达。
本发明也提供包含如本文所述的表达载体的宿主细胞。
组合物和免疫增强剂
本发明包括组合物，所述组合物包括免疫增强剂以及药学上可接受的 载体、稀释剂或赋形剂，所述免疫增强剂选自如本文所述的疫苗、表达载 体或宿主细月包。
14免疫增强剂可以被配制成作为中性或盐形式的组合物。药学上可接受 的盐包括酸加成盐(利用肽的自由氨基基团形成)，并且其利用无机酸形成， 例如，诸如盐酸或磷酸，或利用此类有机酸形成，诸如乙酸、草酸、酒石 酸、马来酸等。利用自由羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如，诸如 氢氧化钠、氢氧化钟、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及衍生自此类 有机碱，诸如异丙胺、三曱胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
一般而言，合适的组合物可以根据本领域技术人员已知的方法制备， 并且可以包括药学上可接受的稀释剂、佐剂和/或赋形剂。就与该组合物的 其他成分相容而言，稀释剂、佐剂和赋形剂必须是"可接受的，，并且对其受 体无毒。
药学上可接受的稀释剂的实例是去矿质水或蒸馏水；盐水溶液；植物 基油，诸如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油，诸如花 生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅 油，包括聚硅氧烷，诸如曱基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧 烷(polysolpoxane);挥发性硅酮；矿物油，诸如液体石蜡、软石蜡或角鲨 烷；纤维素衍生物，诸如曱基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲 基纤维素钠或鞋丙基甲基纤维素钠；低碳烷醇，例如乙醇或异丙醇；低碳 芳烷醇(aralkanols );低碳聚烷撑二醇或低碳烷撑二醇，例如聚乙二醇、 聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，诸如棕榈酸 异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜聚 糖；黄蓍胶或阿拉伯胶和石油凝胶。通常，载体或多种载体将是组合物重 量的1%至99.9%。最优选地，稀释剂是盐水。
对于作为可注射溶液或悬浮液的施用，无毒的肠胃外接受的稀释剂或 载体可以包括林格氏溶液、中链甘油三酯(MCT)、等渗盐水、磷酸盐缓沖 盐水、乙醇和1,2丙二醇。
用于经口应用的一些合适载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的实例包括花 生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、曱基纤维素、藻酸钠、阿拉伯胶、黄 蓍胶、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。另外，这些口服 制剂可以含有合适的增香剂和着色剂。当以月交嚢形式使用时，胶嚢用化合物包衣，诸如延迟崩解的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
佐剂通常包括软化剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和緩沖剂。
口服给药的固体形式可以含有在人和兽医制药实践中可接受的粘合 剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味料、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或 时间延迟剂。合适的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、藻 酸钠、羧曱基纤维素或聚乙二醇。合适的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、 阿司帕坦或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯 烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、 山梨醇、甘露醇、葡萄糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。 合适的增香剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、橙子或树莓调味料。合适的包 衣剂包括丙烯酸和/或曱基丙烯酸和/或它们的酯的聚合物或共聚物、蜡、 脂肪醇、玉米醇溶蛋白、虫胶或谷蛋白。
合适的防腐剂包括苯曱酸钠、维生素E、 (X-生育酚、抗坏血酸、羟苯甲 酸甲酯、羟苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂 酸、油酸钠、氯化钠或滑石。
除上迷物质之外，口服给药的液体形式可以含有液体载体。合适的液
体载体包括水；油，诸如橄榄油、花生油、芝麻油、葵花籽油、红花油、
花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、 异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或它们的混合物。
用于口服给药的悬浮液可以进一步包含分散剂和/或悬浮剂。合适的悬 浮剂包括羧曱基纤维素钠、曱基纤维素、羟丙基曱基纤维素、聚乙烯吡咯
烷酮、藻酸钠或乙酰醇(acetyl alcohol )。合适的分散剂包括卵磷脂、脂肪 酸如硬脂酸的聚氧乙烯酯、聚氧乙烯山梨糖醇的单油酸酯或二油酸酯或硬 脂酸酯或月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐的单油酸酯或二油酸酯或硬脂酸 酯或月桂酸酯等。
用于口服给药的乳剂可以进一步包含一种或多种乳化剂。合适的乳化 剂包括上面所示例的分散剂或天然胶，诸如瓜尔胶、阿拉伯胶、或黄蓍胶。
16制备可肠胃外施用的组合物的方法对本领域技术人员而言是显而易见
的，并且更详纟田i也4葛述在例"V Remington的Pharmaceutical Science, 15th ed" Mack Publishing Company, Easton, Pa.中，其因此通过参考并入本文。
所述组合物可以引入任何合适的表面活性剂，诸如阴离子、阳离子或 非离子表面活性剂，如脱水山梨醇酯或它们的聚氧乙烯衍生物。也可以包 括悬浮剂诸如天然胶、纤维素衍生物或无机材料诸如硅酸盐质二氧化硅 (silicaceous silicas )， 以及其j也成分^口羊毛月旨。
一种或多种免疫增强剂可以被用作免疫增强组合物制备中的活性物。 此类制备利用本领域技术人员已知的常规方法。典型地，此类组合物被制 备作为以液体溶液或悬浮液的注射剂，；也可以制备固体形式，其适合在 注射之前溶解或悬浮在液体中。制剂也可以是乳化的。活性免疫增强成分 经常与赋形剂混合，该赋形剂是药学上可接受的并且与活性成分相容。
给药途径
根据本发明的方法，疫苗和组合物可以通过任何合适的途径施用，或 者全身、区域性或局部施用。在任何给定环境中所使用的任何特定给药途 径将取决于多种因素，其包括被治疗的疾病的性质、疾病的严重度和程度、 被输送的具体化合物所需的剂量以及期望疫苗或组合物的潜在副作用。
例如，在要求适当浓度的期望疫苗或组合物被直接输送至被治疗部位 的情况下，给药可以是局部的而非全身性的。局部给药提供向所需部位输 送非常高浓度的期望疫苗或组合物的能力，并因此适合实现期望的治疗或 预防效果，同时避免身体的其他器官暴露于疫苗或组合物并因此潜在降低 副作用。
举例来说，根据本发明实施方式的给药可以通过任何标准途径来实现， 其包括腔内、膀胱内、肌内、动脉内、静脉内、皮下、局部或经口。腔内 给药可以是腹膜内的或胸膜内的。
如果期望，含有免疫增强剂的适于持续释放或间歇释放的器件或组合 物实际上可以被植入体内或者被局部施用于身体，以将此类物质緩慢释放 到身体中。表达载体或宿主细胞的施用可以包括通过直接口服、全身注射的输送，或者输送至选择的组织(一种或多种)或细胞，或者间接通过输送至从受治疗者或相容供体分离的细胞而进行的输送。
关于基于核酸的组合物，此类組合物所有的输送方式被本发明考虑在内。这些组合物向动物细胞或组织的输送可以通过例如微粒轰击、脂质体介导的转染(例如，脂质转染试剂或脂质转染胺)、电穿孔术、磷酸钙或DEAE-葡聚糖-介导的转染来促进。在可选的实施方式中，合成构建物可以
以"棵露DNA"组合物的形式^1用作治疗或预防组合物，这在本领域是已知的。合适的输送方法的讨论可以发现于CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY (Eds. Ausubel等；John Wiley & Sons Inc., 1997版本)的第9章以及国际互联网站点DNAvaccine.com上。组合物可以通过皮内(例如，使用panjetTM输送)或肌内途径施用。
将合成多核苷酸引入靶细胞的步骤取决于意图应用和物种将是不同的，并且可以包括一种或多种非病毒和病毒载体、阳离子脂质体、逆转录病毒和杆状病毒，诸如，如在Mulligan, R.C.， (1993 Science 260 926-932)中所述，其因此通过参考并入。这些方法可以包括例如
A. 通过注射(Wolff等，1990, Science 247 1465-1468，其因此通过参考并入)、外科植入、滴注法或任何其他方法，局部施用合成多核苷酸。该方法也可以与通过注射、外科植入、滴注法或任何其他方法来局部施用应答合成多核普酸编码的蛋白质的细胞结合使用，以便增加该治疗的效力。该方法也可以与通过注射、外科植入、滴注法或任何其他方法来局部施用所述蛋白质活性所需的另一因子或多个因子结合使用。
B. —般的全身输送，其通过DNA (Calabretta等，1993, Cancer Treat. Rev.19 169-179，其因此通过参考并入)或RNA的单独注射，或与脂质体(Zhu等，1993, Science 261 209-212,其因此通过参考并入)、病毒衣壳或纳米颗粒(Bertling等，1991, Biotech. Appl. Biochem. 13 390-405 ，其因此通过参考并入)或其他任何输送介质一起注射进行。改善的靶向作用可以通过下迷方式实现通过连接合成的多核苦酸与靶向分子(所谓的"魔弹(magic bullet)"方法，其利用例如抗体)，或者通过注射、外科植入、或任何其他方法来局部施用所述合成多核苷酸编码的蛋白质的活性所需的另一种因子或多种因子或应答所述蛋白质的细胞。
C.通过任何方法注射或植入或输送细胞，所述细胞已经通过转染(例
如，在磷酸4丐存在下Chen等，1987, Mole. Cell Biochem. 7 2745-2752，或者在阳离子脂质和多胺存在下Rose等，1991, BioTech. 10 520-525,该文章通过参考并入本文)、感染、注射、电穿孔(Shigekawa等，1988, BioTech.6 742-751，其通过参考并入本文)或任何其他方式进行体外修饰，以便增强所述合成多核苷酸在这些细胞中的表达。该修饰可以通过下述各项介导质粒、噬菌体、粘粒、病毒(诸如腺病毒或逆转录病毒；Mulligan, 1993,Science 260 926-932; Miller, 1992, Nature 357 455-460; Salmons等，1993,Hum. Gen. Ther. 4 129-141，该文章通过参考并入本文)或其他载体，或者其他修饰剂，诸如脂质体(Zhu等，1993, Science 261 209-212，其通过参考并入本文)，病毒核壳或纳米粒子(Bertling等，1991, Biotech. Appl. Biochem.13 390-405，其通过参考并入本文)，或者任何其他修饰介体。细胞作为基因或基因产物的输送载体的应用已经由Barr等，1991, Science 2541507-1512和Dhawan等，1991, Science 254 1509-1512予以描述，这些文章通过参考并入本文。所处理的细胞可以与任何养分、生长因子、基质或者将会促进它们在治疗受治疗者中存活的其他物质结合输送。
组合物也可以以脂质体的形式输送。脂质体通常来源于磷脂类或其他脂质物质，并且通过分散在水介质中的单层或多层水合液晶形成。可以使用任何无毒的、生理学上可接受以及可代谢的、能够形成脂质体的脂质。脂质体形式的组合物可以含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是天然及合成的磷脂类以及磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法在本领域是已知的，关于这方面，具体参考Prescott, Ed., Methods in Cell Biology,Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 ，其内容通过参考并入本文。
剂量
对于任何具体受治疗者，所施用化合物的有效剂量水平将取决于很多因素，包括被治疗疾病的类型以及疾病的阶段；所使用的化合物的活性；所使用的组合物；受治疗者的年龄、体重、 一般健康、性别和饮食；给药时间；给药途径；化合物的螯合速率；治疗的持续时间；与治疗结合或同时使用的药物，以及本领域已知的其他相关因素。
的剂量。这些最通常将在个案基础上确定。
就重量而言，对患者施用的治疗有效的组合物剂量预期在大约0.01mg至约150mg/kg体重/24小时的范围内；典型为大约O.lmg至约150mg/kg体重/24小时的范围内；大约0.lmg至约100mg/kg体重/24小时的范围内；大约0.5mg至约100mg/kg体重/24小时的范围内；或者大约l.Omg至约100mg/kg体重/24小时的范围内；更典型地，有效剂量预期在大约5mg至约50mg/kg体重/24小时的范围内。
可选地，有效剂量可以达到大约5000mg/m2。 一般而言，有效剂量预期在大约IO至约5000mg/n^的范围内，典型在大约10至约2500mg/m2、大约25至约2000mg/m2、大约50至约1500mg/m2、大约50至约1000mg/m2、或大约75至约600mg/m2的范围内。
此外，对于本领域技术人员将显而易见的是，最佳的单剂量的数量以及间隔将由被治疗的病症的性质和程度、给药的形式、途径和位点以及被治疗的具体个体的性质确定。此外，这些最佳条件可以通过常规技术来确定。
对本领域技术人员同样显而易见的是，最佳疗程，诸如每单位时间所
过程来确定。治疗方法
同样被本发明考虑在内的是调节免疫应答的方法，其中所述方法包括向受治疗者施用有效量的免疫增强剂，所述免疫增强剂选自如在本文所述的疫苗、表达载体和宿主细胞。
另外，本发明提供用于治疗或预防与禽流感病毒有关的疾病的方法，其中所述方法包括向受治疗者施用有效量的免疫增强剂，所述免疫增强剂
20选自如在本文所述的疫苗、表达载体和宿主细胞。免疫接种功效评估
可以利用任何合适的技术来评估按照本发明方法进行的免疫接种的效
力。例如，可以利用受激脾细胞或外周血单核细胞(PBMC)对肽包被的或重组病毒感染的细胞用51Cr标记的靶细胞进行CTL裂解试验。此类试验可以利用例如灵长类动物、小鼠或人细胞来进行(Allen等，2000, J. Immunol.164(9): 4968-4978以及下文的Woodberry等)。可选地，免疫接种的功效可以利用一种或多种技术来监测，所述技术包括但不限于新鲜和受激PBMCs的HLA I类四聚体染色(例如参见前述Allen等)、增殖试验(前述Allen等)、ElispotTM试验以及胞内INF-y染色(前述Allen等)、线性B细胞应答的ELISA试验，以及表达如本文所述的抗原肽的细胞样品的蛋白质印迹。
试剂盒
本发明提供用于治疗或预防受治疗者疾病的试剂盒，其中所述疾病与禽流感病毒有关，并且其中所述试剂盒包括如本文所述的疫苗、表达载体、宿主细力包或组合物。
典型地，用于实施本发明方法的试剂盒含有实施该方法的所有必需试剂。典型地，本发明的试剂盒将包含一种或多种容器，其含有例如洗涤试剂和/或能够将结合组分从多肽或其片段中释放的其他试剂。
在本发明的上下文中，具有隔室的试剂盒包括试剂被包含在单独容器中的任何试剂盒，并且可以包括小的玻璃容器、塑料容器或者塑料条或纸条。此类容器可以允许试剂从一个隔室有效转移至另一隔室，同时避免样品和试剂的交叉感染，以及允许每个容器的物质或溶液从一个隔室以定量的方式加至另一隔室。此类试剂盒也可以包括容纳测试样品的容器、含有试验中所用的聚合物的容器以及含有洗涤试剂的容器(诸如磷酸盐緩冲盐水、三羟甲基氨基甲烷(Tris)緩冲液等)。
典型地，本发明的试剂盒也将包括使用该试剂盒组分以实施适当方法的说明书。
本发明现在将通过参考下面的实施例进行描述，所述实施例不应当以任何方式解释为限定本发明的范围。 实施例
实施例1:重組杆状病毒HA-表达盒的构建
H5N1流感病毒的血凝素(HA)是负责产生中和抗体的两种主要膜病毒 糖蛋白之一 (Bosch等，1979, Kawaoka and Webster 1988)。为确定产生对抗 H5N1 (A/Goose/Guangdong/3/97/H5Nl)病毒的杆状病毒基疫苗的潜力，本 发明人构建了两种重组杆状病毒表达载体，每种含有HA-表达盒。第一种 杆状病毒表达载体用在白斑综合症病毒(WSSV) iel启动子的控制下与HA-表达盒一起产生，被称为vAc-HA(图1A)。第二种杆状病毒表达载体用在 杆状病毒多角体蛋白启动子的控制下与HA-表达盒和附加的水泡性口膜炎 病毒糖蛋白(VSVG)-表达盒一起产生，被称为vAc-G-HA(图1A)。
为了产生重组杆状病毒载体，根据Bac-To-Bac系统的方案(Invitrogen)， AcMNPV多角体蛋白启动子控制的VSV G表达盒或WSSV iel启动子控制 的HA表达盒被插入穿梭载体pFastBacl中，并被整合到DH IOB ACtm内 的杆状病毒基因组中。对照病毒vAc-杆粒也通过将空pFastBacl载体整合 到杆粒基因组中而被构建(图1A)。
期望的VSVG或HA表达盒利用Bac-To-Bac系统通过位点专一转座被 插入多角体蛋白基因座中。带有(3-球蛋白终止子的VSV G cDNA然后利用 引物5'- CGCGGATCCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAG-3' (SEQ ID NO: 1) 和5'- CCCAAGCTTCCAACACACTATTGCAATGAA-B' (SEQ ID NO: 2)从 pVSV-G进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。VSV G cDNA被放置在多角 体蛋白启动子的下游，多角体蛋白启动子利用引物 5'國TCCCCCGGGGGATGGTTGGCTACGTATACTCCG-3' (SEQ ID NO: 3)和 5'誦CGCGGATCCGGTTTCGGACCGAGATCCGC-3' (SEQ ID NO: 4)从杆粒 基因组进行PCR扩增。HA cDNA利用引物组
5'誦ATAAGAATGCGGCCGCTATGGAGAAAACAGTGCTTCTTCTTG-3' (SEQ ID NO: 5)和
225'-CCGCTCGAGCGGTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAACGATC-3 ' (SEQ ID NO: 6)通过RT-PCR从H5N1病毒的基因组扩增。HA cDNA然后被放置 在pFastBacl载体中的SV40终止子的上游以及iel启动子的下游，iel启 动子利用引物组5'- TCCCTACGTATCAATTTTATGTGGCTAATGGAGA-3' (SEQIDNO: 7)和5'-
ACGCGTCGACCTTGAGTGGAGAGAGAGCTAGTTATAA-3' (SEQ ID NO: 8)从WSSV基因组(Lu等，2005)扩增。
利用vAc-G-HA感染昆虫Sf9细胞产生大量的细胞-细胞融合(图1B)。 表型是通过多角体蛋白启动子引起的具有膜融合活性的VSV G蛋白质的 非常高的表达水平导致的。
通过产生感染病毒生产的一步生长曲线也检验了 Sf9细胞中的毒粒生 产的动力学(图1C)。这些病毒生长曲线的时间动力学(Lu等，2003)是类似 的，尽管vAc-G-HA的峰值毒粒生产落在vAc-HA和对照vAc-杆粒之后。 vAc-G-HA的滴度在120 h p丄增加至109 PFU (噬斑形成单位)/ml，而 vAc-HA和vAc-杆粒在96 h p.i.产生同样的滴度(图1C)。传染vAc-G-HA 的Sf9细胞中大量合胞体形成可能会延迟后期感染中毒粒的释放。
实施例2:血凝素的膜展示
本发明人通过超离心从受染昆虫细胞的上清液中纯化了 vAc-HA、 vAc-G-HA和vAc-杆粒。为研究HA是否纟支展示在vAc-HA和vAc-G-HA 的膜上，将纯化的毒粒用1% Triton X-100处理15分钟，以破裂病毒膜结 构，然后通过超离心收集病毒核衣壳。为产生抗HA蛋白质的抗体，从杆 状病毒感染的SF9细胞中表达并纯化His6-标记Hal,其中在利用His6-标记Hal作为抗原的豚鼠中出现抗HA蛋白质的多克隆抗体。蛋白质印迹 分析显示，在用Triton X-100处理之前在纯化的毒粒中检测到HA，在已收 集的仅由病毒核衣壳组成的沉淀中未^r测到(图2 A)。
发现，在受染SF9细胞以及在纯化的vAc-G-HA颗粒中，HA^^皮部分切 割为Hal和HA2，其类似于纯化H5N1毒粒的情况(图2A)。这些数据表明， 杆状病毒载体可以展示类似HA的病毒糖蛋白，并对其天然产物具有类似 的翻译后修饰。利用抗-VSVG单克隆抗体的蛋白质印迹试验也显示，VSVG在纯化的vAc-G-HA毒粒中是膜締合的结构成分(图2B)。
为确定杆状病毒表面展示的HA蛋白质是否维持真正的生物性质，测试 vAc-HA和vAc-G-HA的纯化毒粒的血凝活性(图2C)。利用标准血凝试验 (Wood等，1985)，各25 pl的101Q PFU/ml滴度的vAc-HA或vAc-G-HA产 生大约28的血凝滴度。结果表明，VSVG与HA的联合展示将不会显著降 低HA在杆状病毒膜上的展示效率。
实施例3: vAc-G-HA转导能力
因为VS V G提供优于vAc-HA的vAc-G-HA转导优势，因此实施体内 接种试验，以评估vAc-G-HA的转导能力。在细胞系(1)犬MDCK和(2)鸡 Df-I细胞中进行转导试验(Hsu等，2004)。图3A显示，vAc-G-HA有效地 转导这些细胞系，如通过阳性焚光细胞所示。该表达进一步通过用豚鼠中 出现的抗HA1血清的蛋白质印迹分析总细胞提取物证实，如在图3B中所 示。
为进一步监测在vAc-G-HA表面上展示的HA分子的数量，基于豚鼠抗 -HA1多克隆抗血清和HA1单克隆抗体，开发了抗原捕获ELISA，如先前 所报告(He等，2005)。
从杆状病毒感染的SF9细胞表达和纯化His6-标记的HA1。为了利用 Bac-To-Bac系统的pFast Hta载体构建表达HA1的杆状病毒，HA1编码 序列利用引物组
5'-CGCGGATCCGATGGAGAAAACAGTGCTTCTTCTTTG-3' (SEQ ID NO: 9)和5'-CGGGGTACCCTCTCTTTGAGGGGTATTTCT-3' (SEQ ID NO: 10) 从上述HAcDNA扩增。对于蛋白质表达，Sf9细胞用MOI为5的重组病 毒感染并在72 h p.i.收获。His6-标记HA1蛋白质从总细胞提取物的纯化利 用载有N产的树脂浆(resin slurry )进行。
通过用来自豚鼠的纯化IgG涂敷微量滴定板来设计抗原捕获ELISA。 结合抗原然后用含有HAl-特异性单克隆抗体的杂交瘤上清液来检测。使 用10-倍连续稀释的HA1蛋白质来建立标准量化曲线。vAc-G-HA样品中 的HA1的量以标准曲线中的点值来确定，其表示在490 nm下具有相同的吸光度(图3Q。根据该曲线，发现101QPFU/ml滴度下各25 pl vAc-G-HA含 有大约50ngHAl。这些发现表明，HA蛋白质维持真正的血凝活性并且被 有效地展示在杆状病毒的表面上。
实施例4: vAc-G-HA的免疫原性
然后通过用纯化的vAc-G-HA毒粒肌内免疫接种6-8周BALB/c小鼠， 研究vAc-G-HA的免疫原性。在用5xl(^PFU的vAc-G-HA颗粒接种之后 4周时，用相同数量的毒粒加强免疫小鼠。 一周后，经眼后血管丛 (retroorbital plexus )对小鼠釆血，并通过ELISA和血凝抑制反应(HI)试验 (Wood等，1985)单独测试来自各动物的血清中抗HA的抗体。
通过用每孔60 ng纯化的His6-标记HA1蛋白质涂敷96孔微量培养板建 立ELISA测试，以监测HA-特异性抗体水平。如在图4A中所示，所有5 个免疫处理的小鼠产生了显著的抗体应答，如通过ELISA所检测到的， 在ELISA中，纯化HA1蛋白质被涂敷作为抗原。用vAc-杆粒免疫处理的 两个对照小鼠仅展示背景血清滴度。
vAc-G-HA在所有5只免疫处理小鼠中诱导了血清HI抗体应答，其滴 度在23至25范围内(图4B)。 HI抗体应答与用活H5流感病毒鼻内接种的 那些小鼠相当，其显示24至27范围内的滴度，如由Takada等(1999)所报 告。来自接种vAc-G-HA的小鼠的专一的及显著的抗体应答表明，展示在 病毒表面上或者通过病毒转导表达的HA分子维持其抗原性。
为进一步表征vAc-G-HA和vAc-HA的免疫原性，7周BALB/c小鼠(每 组5只小鼠)利用纯化毒粒进行肌内免疫处理。使用从MDCK细胞扩增的 灭活H5N1/PR8疫苗抹作为阳性对照，vAc-杆粒接种的小鼠作为阴性对 照。在用256 HA单位的纯化杆状病毒颗粒或灭活H5N1/PR8病毒肌内接 种之后4周时，用相同数量的毒粒对小鼠加强免疫。 一周后，经眼后血管 丛(retro-orbital plexus )对小鼠采血，并通过He等，2005所述的ELISA以 及通过Wood等，1985所述的血凝抑制反应(HI)试验，单独测试来自每组5 只小鼠的混合血清中的抗HA抗体。通过用每孔60 ng纯化His6-标记HA1 蛋白质涂敷96孔微量培养板建立ELISA测试，以监测HA-特异性抗体水 平。
25如在图5A中所示，用vAc-HA或vAc-G-HA免疫处理的小鼠发展了显 著的抗体应答，其通过ELISA检测，在ELISA中，纯化的HA1蛋白质被 涂敷作为抗原。用vAc-杆粒免疫处理的小鼠仅展示背景血清滴度。 vAc-G-HA和vAc-HA在免疫处理小鼠中都诱导了血清HI抗体应答，其滴 度为26 (图5B)。杆状病毒载体的HI滴度与用疫苗林H5N1/PR8接种的那 些小鼠具有的28的平均滴度相当(图5B)。
在ELISA试验中，由vAc-G-HA诱导的抗体应答比vAc-HA诱导的抗 体应答高大约18%。令人惊讶的是，H5N1/PR8疫苗才朱诱导更高水平的抗 体应答，如通过ELISA所示。因此，谦导的抗血清显示比展示HA的杆状 病毒高四倍的HI活性(图5A和5B)。来自杆状病毒接种小鼠的专一性及显 著的抗体应答表明，展示在病毒表面上或者通过病毒转导表达的HA分子 维持其真正的抗原性。
然后通过展示HA的杆状病毒测试诱导抗体的体外中和能力。如先前由 Rowe等，1999所才艮告的，进行基于H5N1/PR8和MDCK细胞系统的标准 微量中和试验。由两种展示HA的杆状病毒诱导的血清显示80的重大中和 滴度，而H5N1/PR8诱导血清给出160的更高滴度(图5B)。
参考文献
Bosch, F.X., M. Orlinch, H.D. Klenk, and R. Rott. 1979. The structure of the hemagglutinin, a determinant for the pathogenicity of influenza viruses. Virology. 95:197-207.
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Hsu, C, Y. Ho, K. Wang, and Y. Hu. 2004. Investigation of optimal transduction conditions for baculo virus-mediated gene delivery intomammalian cells. Biotechnol. Bioeng. 88:42-51.
Kawaoka, Y. and R. G Webster. 1988. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA. 85:324-328. Lu, L., Q. Du, and N. Chejanovsky. 2003. Reduced expression of the immediate- early protein IEO enables efficient replication of Autographa califomica multiple nucleopolyhedrovims in poorly permissive Spodoptera littoralis cells. J. Virol. 77:535- 545.
Lu, L., H. Wang, I. M扁po, L. Yu, and J. Kwang. 2005. Baculovirus誦mediated promoter assay and transcriptional analysis of white spot syndrome vims orf427 gene. Virol. J. 2:71.
Takada, A., N. Kuboki, K. Okazaki, A. Ninomiya, H. Tanaka, H. Ozaki, S. Itamura, H. Nishimura, M. Enami, M. Tashiro, K.F. Shortridge, and H. Kida. 1999. Avirulent Avian influenza vims as a vaccine strain against a potential human pandemic.丄Virol 73:8303-8307.
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权利要求
1. 用于治疗或预防受治疗者疾病的疫苗，其中所述疾病与禽流感病毒有关，并且其中所述疫苗包括含有编码血凝素肽的核酸的表达载体，使得在使用时所述血凝素肽通过所述表达载体在所述受治疗者中表达。
2. 根据权利要求1所述的疫苗，其中所述表达载体包括杆状病毒表达 载体。
3. 根据权利要求1或权利要求2所述的疫苗，其中所述表达载体进一 步包括与编码抗原肽的核酸可操作连接的、来自白斑综合症病毒的启 动子。
4. 用于治疗或预防受治疗者疾病的疫苗，其中所述疾病与禽流感病毒 相关，并且其中所述疫苗包括表达载体，所述表达载体包含(a) 编码血凝素肽的核酸；和(b) 来自白斑综合症病毒的ze/启动子，其与编码血凝素肽的所述核酸可 操作连接，使得在使用时，所述血凝素肽通过所述受治疗者中的所述表达载体表达。
5. 根据权利要求1至4任一项所述的疫苗，其中所述受治疗者选自人、 禽或猪。
6. 根据权利要求1至5任一项所述的疫苗，其中所述禽流感病毒是禽 流感病毒的H5N1亚型。
7. 根据权利要求1至6任一项所述的疫苗，其中所述血凝素肽包括来 源于禽流感病毒的H5N1亚型的氣基酸序列。
8. 表达载体，其中所述表达载体包括(a) 编码抗原肽的核酸；和(b) 与编码抗原肽的核酸可操作连接的、来自白斑综合症病毒的启动子，其中所述抗原肽包括血凝素肽，所述血凝素肽包含来源于禽流感病毒的H5N1亚型的氨基酸序列。
9. 权利要求8所述的表达载体在治疗或预防受治疗者疾病中的用途， 其中所述疾病与禽流感病毒相关，使得在应用时，所迷抗原肽通过所述受 治疗者中的所述表达载体表达。
10. 包括权利要求8或权利要求9所述的表达载体的宿主细胞。
11. 组合物，其包括选自由根据权利要求1至7任一项所述的疫苗、根 据权利要求8或权利要求9所述的表达载体或者根据权利要求10所述的 宿主细胞组成的组的免疫增强剂，以及药学上可接受的栽体、稀释剂或赋 形剂。
12. 根据权利要求11所述的组合物，其进一步包括佐剂。
13. 用于治疗或预防受治疗者疾病的疫苗，其包括根据权利要求8或权 利要求9所述的表达载体、根据权利要求10所述的宿主细胞或根据权利 要求ll所述的组合物，其中所述疾病与禽流感病毒有关。
14. 用于调节免疫应答的方法，其中所述方法包括向受治疗者施用有效 量的免疫增强剂，所述免疫增强剂选自根据权利要求1至7或13任一项 所述的疫苗、根据权利要求8或权利要求9所述的表达载体、根据权利要 求10所述的宿主细胞或根据权利要求12所述的组合物组成的组。
15. 治疗或预防与禽流感病毒有关的疾病的方法，其中所述方法包括向 受治疗者施用有效量的免疫增强剂，所述免疫增强剂选自根据权利要求1 至7或13任一项所迷的疫苗、根据权利要求8或权利要求9所述的表达 载体、根据权利要求10所述的宿主细胞或根据权利要求12所述的组合物 组成的组。
16. 根据权利要求1至7或13任一项所述的疫苗、根据权利要求8或 权利要求9所述的表达载体、根据权利要求10所述的宿主细胞或根据权 利要求12所迷的组合物，在调节免疫应答的用途。
17. 根据权利要求1至7或13任一项所述的疫苗、根据权利要求8或 权利要求9所述的表达载体、根据权利要求10所述的宿主细胞或根据权利要求12所述的组合物，在制造用于治疗与禽流感病毒有关的疾病的药物的用途。
18. 用于治疗或预防受治疗者疾病的试剂盒，其中所述疾病与禽流感病毒有关，并且其中所述试剂盒包括根据权利要求1至7或13任一项所述的疫苗、根据权利要求8或权利要求9所述的表达载体、根据权利要求10所述的宿主细胞或根据权利要求12所述的组合物。
19. 用于呈递或展示多肽的方法，其中所述方法包括(a) 将编码所述多肽的核酸插入杆状病毒表达载体中，其中所述杆状病毒表达载体包括来自白斑综合症病毒的？e/启动子；(b) 用所述表达载体转染至少一种宿主细胞；和(c) 从所述表达载体中表达所述多肽，其中所述多肽被呈递或展示在杆状病毒的表面膜上。
20. 用于呈递或展示多肽的系统，其中所述系统包括(a) 编码所述多肽的核酸，其被插入杆状病毒表达载体中，其中所述杆状病毒表达载体包括来自白斑综合症病毒的ze/启动子；(b) 用所述表达载体转染至少一种宿主细胞的方法；和(c) 用于从所述表达载体表达所述多肽的方法，其中所述多肽被呈递或展示在杆状病毒的表面膜上。
全文摘要
用于治疗或预防受治疗者疾病的疫苗，其中所述疾病与禽流感病毒有关，并且其中所述疫苗包括含有编码血凝素肽的核酸的表达载体，使得在使用时所述血凝素肽通过所述表达载体在所述受治疗者中表达。
文档编号C12N15/866GK101460628SQ200680054933
公开日2009年6月17日 申请日期2006年5月5日 优先权日2006年5月5日
发明者吉米·光, 鲁丽群 申请人:淡马锡生命科学研究院有限公司