专利名称：基因取代微生物及使用该微生物的聚酯制造方法
技术领域：
本发明涉及经改良的微生物抹、以及利用该微生物抹的PHA制造方法， 所述改良的微生物抹在微生物降解聚酯的聚幾基链烷酸(PHA)的商业生产 上是有用的。
背景技术：
聚羟基链烷酸是可由多种微生物产生的聚酯型有机分子聚合物。这些 聚合物是具有生物降解性的、热塑性高分子，此外，其可以由可再生资源 生产，因而，进行了将其作为环境和谐型材料或生物适应型材料进行工业 生产，应用于各个产业的尝试。
构成该聚酯的单体通用名为3-羟基链烷酸，具体地，通过使3-羟基丁 酸、3-羟基吉草酸、3-羟基己酸、3-羟基辛酸、或者更长烷基链的3-羟基链 烷酸单独重合或共聚来形成聚合物分子。作为3-羟基丁酸(以下，简称为3HB) 的均聚合物的聚3-羟基丁酸(以下，简称P(3HB)), P(3HB)是1925年在巨大 芽胞杆菌(Sac/〃w meg加en'wm)中首次发现的，但该P(3HB)的结晶性高，其 性质硬且脆，其应用范围受到了实用性的限制。因此，进行了以改良其性 质为目的地研究。
这其中，公开了由3-羟基丁酸(3HB)、 3-羟基吉草酸(3HV)构成的共聚 体(以下，简称P(3HB-co-3HV))的制造方法(例如，参照专利文献l、专利文 献2)。该PpHB-co-:3HV)较PpHB)更富柔软性，因此，可以i/v为其具有更 广泛的应用。然而，实际上，即4吏增加3HV的摩尔比率，P(3HB-co-3HV) 的物性也缺乏随之发生的变化，特别是柔软性并不提高，因此，其只能应 用在洗发液瓶、 一次性剃刀的把手等硬质成型体领域。
此外，已知由烷基链的碳原子数为6~16的3-羟基链烷酸构成的中链 PHA，与P(3HB)、 P(3HB-co-3HV)相比结晶性低、富有弹力(参照非专利文 献l)、可以期待其在不同领域的应用。在中链PHA的制造研究方面，进行 了下述研究将假单胞菌属CP化wc/omo"w)的PHA合成酶基因导入假单胞菌
3属、雷氏菌属(i a/加m^)、大肠杆菌，但生产性均低，不适用于工业生产(参 照非专利文献2、非专利文献3、非专利文献4)。
近年来，进行了 3HB和3-羟基己酸(以下，简称3HH)的2成分共聚聚 酯(以下，简称P(3HB-co-3HH))及其制造方法的研究(参照专利文献3、专利 文献4)。这些报告中的P(3HB-co-3HH)制造方法是这样的使用从土壤中分 离出的豚鼠气单胞菌G4eromo"w cm;/fle),从油酸等脂肪酸或橄榄油等油脂 进行发酵生产。此外，还开展了关于P(3HB-co-3HH)的性质的研究(参照非 专利文献5)。在该报告中，以碳原子数12个以上的脂肪酸为唯一碳源来培 养豚鼠气单胞菌，发酵生产3HH组成为11 19mol。/。的P(3HB-co-3HH)。可 知P(3HB-co-3HH)随着3HH组成的增加，逐渐从P(3HB)的硬且脆的性质 转而显示柔软的性质，并显示出超过P(3HB-co-3HV)的柔软性。即，通过改 变3HH的组成，P(3HB-共聚-3HH)可具有从硬质聚酯到软质聚酯的广范围 的可应用物性，因此可望应用于从诸如电视机外壳等要求硬度的产品到诸 如胶片等要求柔软性的产品的广阔领域。然而、本制造方法中，聚酯生产 性低(菌体生产量4g/L、聚酯含量30%)，还不能充分地说其是面向本聚酯的 实用化的生产方法，因此，对面向实用化的可获得更高生产性的方法进行 了探索。
以P(3HB-co-3HH)的工业生产目标进行了 一些努力。使用嗜水气单胞菌 G4en9momw/z;^raj!7/n7a)进行培养时，在以油酸为碳源的43小时流加培养中， 生产出菌体产量为95.7g/L、聚酯含量为45.2%、 3HH组成为17%的P(3HB-共聚-3HH)(参考非专利文献 10)。 此外，以葡萄糖和月桂酸为碳源培养嗜水 气单胞菌，可达到菌体产量为50g/L，聚酯含量为50%，分子量为100万道 尔顿(参考非专利文献11)。然而，嗜水气单胞菌对人体具有病原性(参考非
专利文献12)，它并不是适于工业生产的菌种。此外，这些培养生产均使用 高价格的碳源，因此从生产成本的观点出发，应该寻求利用更廉价的碳源。 因此，以安全宿主中的生产以及提高生产性为目标，进行了一些努力。 从豚鼠气单胞菌克隆了聚羟基链烷酸(PHA)合成酶基因(参照专利文献5、非 专利文献9)。使用将该基因导入真养雷氏菌CRa/"ow'a eWrop/za,旧称 ^ca//ge"as ew^o/ /w)而得到的转化体进行P(3HB-co-3HH)的生产，结果是 菌体生产性为4g/L、聚酯含量为30%。而且，使用植物油脂作为碳源来培 养该转化体，结果实现了菌体生产量4g/L、聚酯含量80%(参照非专利文献10)。而且，对培养方法进行了研究，通过改善培养条件，提高到菌体生产
量45g/L、聚酯含量62.5%、 3HH组成8.1。/。(专利文献6参照)。
此外，虽然已经构建了能够以果糖为碳源生产P(3HB-co-3HH)的 Ralstoniaeutropha，但该菌抹的聚酯生产性低，不能说适用于实际生产(参照 非专利文献11)。
还构建了以大肠杆菌为宿主的P(3HB-co-3HH)生产抹。将气单胞菌属的 PHA合成酶基因以及Ralstonia eutropha的NADP-乙酰乙酰基Co—A还原酶 基因等导入大肠杆菌构建了菌抹。以十二烷为碳源培养该大肠杆菌的结果 是生产性为40.8小时培养时，菌体量79g/L、聚酯含量27.2%、 3HH组成 10.8%(参照非专利文献12)。
以提高P(3HB-co-3HH)的生产性和3HH组成控制为目标，进行了 PHA 合成酶的人工修饰。在豚鼠气单胞菌来源的PHA合成酶变体中，第149位 的氨基酸即天冬酰胺被丝氨酸取代的变体酶、第171位的天冬氨酸被甘氨 酸取代的变体酶显示出在大肠杆菌内改善PHA合成酶活性、3HH组成(非 专利文献13参照)。此外，有报道称该酶的518位的苯丙氨酸被异亮氨酸 取代的变体酶或214位的缬氨酸被甘氨酸取代的变体酶在大肠杆菌中的 PHA合成酶活性、聚酯含量有所提高(参照非专利文献14)。但是，这些方 法使用特殊的大肠杆菌作为宿主，且聚酯含量仍然低，因此，有必要灵活 运用这些变体酶的特点，进行更适用于工业生产的改良。
使用应用重組DNA技术制作的菌抹、工业规模培养PHA时最重要的 课题之一是导入的基因的稳定性。基因导入可以利用使用质粒的方法、重 组入宿主染色体的方法等。然而、已知质粒会在重组菌增殖、分裂时脱落(参 照专利文献7)。因此，质粒发生脱落的菌体丧失了 PHA生产能力，从而商 业生产性低下。传统上， 一般的策略是在重组菌体的培养中，通过在培 养基中添加抗生素来仅选择性地使质粒保有菌体繁殖并保持，但由抗生素 的使用带来的成本提高、由培养废液中的残留抗生素造成的环境影响等成 为问题。此外，为了使质粒稳定化，将Rl质粒来源的parB基因重组到P(3HB) 生产质粒中，制备了重组大肠杆菌(参照非专利文献15)。该大肠杆菌在培养 110-120代后基本上100%保持了质粒。然而、质粒仍然存在脱落的危险性。
另一方面，可以认为重组在染色体上的基因是稳定的，报告了将PHA 合成相关基因重组到染色体上而得的微生物(参照专利文献8、非专利文献16、非专利文献17)。
菌染色体上而制备的大肠杆菌抹，该大肠杆菌抹以超过细胞干燥重量的 85%的水平产生P(3HB)。然而、为了在大肠杆菌中产生实用物性良好的 P(3HB-co-3HH),必须还要共存有用于提供基质单体的基因，或必须向培养 基中供给昂贵的脂肪酸等，而且，这妨碍了高生产效率的实现。而且，当 在染色体上随机重组基因时，视发生重组的位点而定，会影响到该位点上、 或者该位点周围的基因的表达，存在作为PHA生产抹不能充分发挥能力的 情况。
将外源性PHA合成酶基因以质粒形式导入宿主时、或者重组在染色体 上时，如果是使用雷氏菌属、假单胞菌属等天然地生产PHA的微生物种作 为宿主，则会利用无法天然地生产PHA的菌抹。这样的菌株是经变异操作 而制备的，因此，与其亲本抹相比，增殖能力、生物活性处于劣势(参照非 专利文献18、非专利文献19、非专利文献20等)，作为PHA生产抹还不能 说发挥了充分的生产能力。
另 一方面，报导了将Ralstonia eutropha的染色体上的PHA合成酶基因 成取代酒色着色菌(Chromatium vinosum)来源的PHA合成酶基因，积累了超 过野生抹的、占细胞干燥重量91%的P(3HB)(非专利文献17)。然而，菌体 量低至1.8g/L,生产的聚酯也是硬且脆的P(3HB),而非期待有广泛应用的 P(3HB-co-3HH)，聚酯的商业生产中仍存在问题。
专利文献l特开昭57-150393号公报
专利文献2特开昭59-220192号公报
专利文献3特开平5-93049号公报
专利文献4特开平7-265065号公报
专利文献5特开平10-108682号公报
专利文献6特开2001-340078号公报
专利文献7特开昭59-205983号公报
专利文献8美国专利6593116号说明书
非专利文献1 Madison等、Microbiol.Mol,Biol.Rev., 63: 21-53(1999) 非专利文献2Matsusaki等、J.Bacteriol., 180: 6459-6467(1998) 非专利文献3 Matsusaki等、Appl.Micrbiol.Biotechnol., 53: 401-409(2000)非专利文献4 Langenbach等、FEMS Microbiol.Lett., 150: 303-309(1997)非专利文献5Doi等、Macromolecules, 28: 4822-4828(1995)非专利文献6Lee等、Biotechnol.Bioeng.， 67: 240-244(2000)非专利文献7Chen等、Appl.Microbiol.Biotechnol., 57: 50-55(2001)
非专利文献8国立感染症研究所病原体等安全管理规定别表1附表1(1999)
非专利文献9Fukui等、J.Bacteriol., 179: 4821-4830(1997)非专利文献10Fukui等、Appl.Microbiol.Biotecnol., 49: 333—336(1998)非专利文献11 Fukui等、Biomacromolecules， 3: 618-624(2002)非专利文献12Park等、Biomacromolecules, 2: 248-254(2001)非专利文献13 Kichise等、Appl.Environ.Microbiol., 68: 2411-2419(2002)非专利文献14 Amara等、Appl.Microbiol.Biotechnol., 59: 477-482(2002)非专利文献15Lee等、J.Biotechnol., 32: 203-211(1994)非专利文献16Kranz等、Appl.Environ.Microbiol.， 63: 3003-3009(1997)非专利文献17 York等、J.Bacteriol.， 183: 4217-4226(2001)非专利文献18 Schlegel等、Arch.Mikrobiol., 71: 283-294(1970)非专利文献19 Schubert等、J.Bacteriol.， 170: 5837-5847(1988)非专利文献20 Peoples等、J.Biol.Chem.， 264: 15298-15303(1989)
发明内容
本发明所要解决的问题
如上述，在PHA的商业生产中还存在许多问题。
本发明的目的是提供在工业规模的培养工艺中可期待具有广泛用途的、稳定地以高水平累积共聚聚酯的重组微生物菌林、以及提供利用该重组微生物菌林的共聚聚酯制造方法。解决问题的方法
技术领域：
本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现将存在于染色
得的聚酯生产微生物能够稳定地以高水平累积PHA。
有提示为了使PHA的合成稳定，在染色体上导入基因是有效的，但是，使用野生林、将其PHA合成酶基因位点特异性地取代为PHA合成酶基因、同时进行既有基因的破坏与导入基因的表达来累积共聚聚酯时的效果还不为人所知，此外，这也不能从已知技术来简单地进行预测。
如实施例所示，将Ralstonia eutropha HI6株的染色体上的聚羟基链烷酸合成酶基因取代成豚鼠气单胞菌来源的聚羟基链烷酸合成酶变体基因而得到的4鼓生物林，在48小时的培养中，以菌体生产量110.4g/L、聚酯含量73.8wt。/。生产了 P(3HB-co-3HH)。该生产性较已报导的P(3HB-co-3HH)的生产性有大幅提高。此外，还发现该菌林在整个培养工程中均无需抗生素或其它任何选择压力，培养结束时基本上所有细胞中均累积了P(3HB-co-3HH)。
即，本发明如下。
1. 一种生产共聚聚酯的微生物，所述共聚聚酯由选自3-羟基丁酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十三烷酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十五烷酸以及3-羟基十六烷酸中的2种以上单体单元构成，该微生物的染色体上本来具有聚羟基链烷酸合成酶基因，并且现在该聚羟基链烷酸合成酶基因的至少一部分已被取代成外源性聚羟基链烷酸合成酶基因。
2. 项l所述的微生物，其中，所述共聚聚酯由3-羟基丁酸和3-羟基己酸单体单元构成。
3. 项l或2所述的微生物，其中，所述染色体上本来具有聚羟基链烷酸合成酶基因的微生物为真养雷氏菌CRa/Wom'a ei^o; /2a)。
4. 项3所述的微生物，其中，所述真养雷氏菌为真养雷氏菌H16抹。
5. 项1~4中任一项所述的微生物，其中，所述外源性聚羟基链烷酸合成酶基因编码豚鼠气单胞菌04womo"aw caWae)来源的酶或其变体。
6. 项5所述的微生物，其中，所述变体至少进行了以下(a)、 (b)之一的氨基酸取代
(a) 第149位的氨基酸即天冬酰胺被取代成丝氨酸，
(b) 第171位的氨基酸即天冬氨酸被取代成甘氨酸。
7. 项1~4中任一项所述的微生物，其中，所述外源性聚羟基链烷酸合成酶基因编码用SEQIDNO: 9的氨基酸序列表示的豚鼠气单胞菌来源的变体酶，该变体酶是第149位的氨基酸即天冬酰胺被取代成丝氨酸、且第171位的氨基酸即天冬氨酸被取代成甘氨酸而成的。8. —种微生物，其为KNK-005抹。
9. 使用了项1~8中任一项所述的微生物的聚酯制造方法。 本发明的共聚聚酯是用以下通式表示的以3-羟基链烷酸为单体单元的
聚合物中、由选自3-羟基丁酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十三烷 酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十五烷酸以及3-羟基十六烷酸中的2种或3种 以上单体单元构成的共聚聚合物。
化学式1<formula>formula see original document page 9</formula>
(式中，R^和W表示碳原子数为1以上的烷基基团，它们在聚合物中可 以相同，也可以不同。m和n表示该聚合物的单体单元数，为1以上。)。
作为上述共聚聚酯，优选由3-羟基丁酸和3-羟基己酸的单体单元构成。
本发明中使用的微生物，只要是属于染色体DNA上原本具有聚羟基链 烷酸合成酶基因的物种的微生物即可，对其使用没有限制，包括经修饰而 能够利用其它碳源的微生物、经修饰而能够合成或摄入基质单体的微生物、 或者经修饰而生产性提高的微生物。例如，包括Ralstonia eutropha(分类学 上与Wautersia eutropha、 Cupriavidus necator同一)等Ralstonia属、豚鼠气单 胞菌等气单胞菌属、广泛产碱杆菌04/0^^""/"^ )等产碱杆菌属、绿脓假 单胞菌、恶臭假单胞菌等假单胞菌属(Pseudomonas)等细菌。从安全性和生 产性的观点来看，优选Ralstonia属，更优选Ralstonia eutropha,更优选 Ralstonia eutropha H16抹。
本发明中使用的外源性聚羟基链烷酸合成酶基因，只要是各种PHA累 积生物来源的基因中的使得能够累积共聚聚酯的基因即可，可以是任何基 因。作为这样的基因有从例如豚鼠气单胞菌(非专利文献9)、珊瑚红诺卡氏 菌(A^carafe cora〃/"a)(GenBank登录号AF019964)、绿脓假单胞菌(Timm 等、Eur丄Biochem. ， 209: 15-30(1992》、食油假单胞菌(尸化wcfowomw 。/e,r謹)(Huisman等、J.Biol.Chem.， 266: 2191-2198(1991))、紫堇嚢硫菌(Thiocystis violaceae)(Liebergesell等、Appl.Microbiol.Biotechnol. ， 38: 493-501(1993))等分离出的聚羟基链烷酸合成酶基因。优选编码豚鼠气单胞 菌来源的酶或其变体的基因。
此外，在不丧失目的酶活性的范围内，改变这些基因的一部分碱基序 列(从而使得氨基酸序列发生改变)而得的基因也是可以使用的。优选使用例 如非专利文献13记载的、第149位的氨基酸即天冬酰胺被取代成了丝氨 酸的豚鼠气单胞菌来源的聚酯合成酶基因(N149S变体基因)，第171位的氨 基酸即天冬氨酸被取代成了甘氨酸的豚鼠气单胞菌来源的聚酯合成酶基因 (D171G变体基因)，或者组合了上述2个氨基酸取代的、用SEQIDNO: 9 的氨基酸序列表示的豚鼠气单胞菌来源的聚酯合成酶基因等。
上述基因可以具有启动子和/或核糖体结合位点，但并非必要。 聚酯合成酶基因的取代方式，只要该取代使得染色体上原本存在的聚 酯合成酶基因(被取代基因)所编码的酶活性丧失、且外源性聚酯合成酶基因 (取代基因)得以表达即可，可以是任何取代方式。取代后，被取代基因可以 完全从染色体上消失，也可以还存在一部分、还可以以被分割开的形式存 在。作为取代的一种方式，在取代基因具有核糖体结合位点，但不具有启
外，作为取代的其它方式，在取代基因不具有启动子和核糖体结合位点时， 可以选择使其连接在被取代基因的核糖体结合位点的下游的取代方式。可 以选择使得取代后所表达的聚酯合成酶蛋白为取代基因编码的单一蛋白的 取代方式，也可以选择使得取代后所表达的聚酯合成酶蛋白为与被取代基 因编码的蛋白的融合蛋白的取代方式。本发明可采用的聚酯合成酶基因的 取代方式不限于以上示例，优选的方式是这样的将被取代基因的从起始 密码子到终止密码子取代成取代基因的从起始密码子到终止密码子。
对染色体上的基因位点特异性地进行取代的方法是本领域技术人员公 知的。作为代表性方法有利用转座子和同源重组机制的方法(Ohman等、 J.Bacteriol.， 162: 1068-1074(1985))或以同源重组机制引起的位点特异性重 组和基于第二阶段的同源重组的脱落为原理的方法(Noti等、Methods Enzymol.， 154: 197-217(1987))等，此外，还可以利用这样的方法使枯草 杆菌来源的sacB基因与取代基因共存，将sacB基因因第二阶段的同源重组 而脱落(Schweizer、 Mol.Microbiol., 6: 1195-1204(1992)、 Lenz等、J.Bacteriol.,
10176: 4385-4393(1994))的微生物抹作为蔗糖添加培养基耐性抹容易地分离出 来，只要能够取代染色体上的基因，对所用的方法没有特殊限制。
以下，对将Ralstonia eutropha的PHA合成酶基因(phaCRe)取代为豚鼠气 单胞菌的PHA合成酶基因(phaCAe)时的取代方法做更具体的示例。
首先，制备取代片段。取代片段为下述形式在phaCRe的编码序列(CDS: 包含从起始密码子到终止密码子)的紧邻(直前)上游序列上连接phaCAc的 CDS,在其后连接phaCRe的CDS的紧邻(直后)下游序列。即，取代片段为 仅CDS被取代为phaC^的CDS的phaCReDNA片段。上游序列和下游序列 是为了与染色体上的基因发生同源重组而必需的同源序列， 一般来说，其 长度越长重组频率越高，但只要能引起同源重组即可，对其长度可任意设 定。
取代片段上可以附加在基因取代时作为选择标记的基因。作为选择标 记的基因，可以使用例如卡那霉素、氯霉素、链霉素、氨千西林等抗生 素的抗性基因，或与各种营养缺陷互补的基因等。在利用Ralstoniaeutropha 进行时，优选卡那霉素抗性基因。
而且，除此之外，还可以附加下述基因，所述基因用于容易地选择含 有选择标记基因的区域因第二阶段的同源重组而发生脱落的^[鼓生物抹。作 为这样的基因，可以列举出枯草杆菌来源的sacB基因(Schweizer、 Mol.Microbiol.， 6: 1195-1204(1992))。已知表达该基因的微生物抹不能在 含蔗糖的培养基上生长繁育，可以通过在含蔗糖培养基上的生长繁育，容 易地选择该基因因脱落而丧失的菌抹。
通过将这样构成的取代片段连接到不在宿主微生物抹中复制的载体上 来制备基因取代用质粒。在可在雷氏菌属、假单胞菌属等中利用的这样的 载体方面，可以列举出例如pUC载体、pBluescript载体、pBR322载体或 者与它们具有相同复制起点的载体等。而且，还可以使mob、 oriT等DNA 序列共存，上述DNA序列使得可以进行接合转移。
以这样的构成制备成的基因取代用质粒DNA，可以采用电穿孔法、接 合转移法等公知方法导入Ralstonia eutr叩ha等微生物，可以进行同源重组。
接着，选择基因取代用质粒DNA因同源重组而插入染色体上的菌株。 选择可以通过下述方法进行，所述方法利用了在基因取代用质粒DNA上共 存的选择用基因。当使用卡那霉素抗性基因时，可以选择在含卡那霉素的培养基上长出的菌抹。
在下一阶段，选择下述菌抹，所述菌抹中的包含选择标记基因的区域 因第二次同源重组而从染色体上脱落。可以基于插入时所利用的选择用基
因、选择例如在含卡那霉素的养基上不能生长繁育的菌抹，但当sacB基因
共存于基因取代用质粒上时，可以容易地选择出在含蔗糖培养基上长出的 菌抹。为了确认这样获得的菌抹是不是所希望的基因取代菌株，可以采用
PCR法、South杂交法或DNA石咸基序列测定等公知的方法。如上述操作， 可以获得Ralstonia eutr叩ha的PHA合成酶基因(phaCRe)被豚鼠气单胞菌的 PHA合成酶基因(phaCAc)取代的菌林。作为这样的菌抹，可以列举出以下实 施例中制备的KNK-005抹等。
在本发明中，通过在碳源存在下增殖本发明的微生物，可以在微生物 体内累积共聚聚酯。作为碳源，可以使用糖、油脂或脂肪酸。作为碳源以 外的营养源，可以任意使用氮源、无机盐类、其它有机营养源。
糖类例如有葡萄糖、果糖等碳水化合物。油脂包括富含碳原子数为10 以上的饱和.不饱和脂肪酸的油脂，例如有椰子油、棕榈油、椋榈仁油等。 脂肪酸例如有己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻 酸、肉豆蔻酸等饱和.不饱和脂肪酸或这些脂肪酸的脂或盐等脂肪酸衍生物。
作为氮源，例如有氨、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐，其它还可以 举出蛋白胨、肉提取物、酵母提取物等。
作为无机盐类，例如有磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、 氯化钠等。
作为其它有机营养源，例如有甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯 氨酸等氨基酸；维生素B1、维生素B12、维生素C等维生素。
培养温度，只要是该菌林可以生长繁育的温度即可，但优选20。C至 40°C。培养时间没有特别的限定，可以为1-10日左右。
聚酯的回收，可以采用例如下述方法进行。培养结束后，用离心分离 器等从培养液中分离菌体，分离的菌体用蒸馏水及曱醇洗净，并干燥。使
用氯仿等有机溶剂从这些干燥菌体中抽提聚酯。采用过滤等方法从含有该 聚酯的有机溶剂溶液中除去菌体成分，向该滤液中加入甲醇或己烷等不良 溶剂以沉淀聚酯。然后，可以采用过滤或离心分离等方法除去上清液，干 燥、回收聚酯。确认产生聚酯的简易方法可以采用尼罗红染色法。即，在重组菌生长
繁育的琼脂培养基上加入尼罗红，培养重组菌1-7天，观察其重组菌是否变
红，以此确认是否产生了聚酯。 发明的效果
本发明提供下述重组微生物抹，所述重组微生物林能够在产业用发酵
过程中稳定地高性能地生产聚羟基链烷酸(PHA),本发明可以简便、大量且 廉价地制造高纯度的聚羟基链烷酸(PHA)。
图1为显示实施例1中构建的基因取代用质粒pBlue-phaCRe:: N149S/D171G-KmSAC的构成的示意图。
图2为示意性地显示实施例2中进行的基因取代的程序的图。
发明的
具体实施例方式
以下，通过实施例来说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。 (实施例l)基因取代用质粒的制备
以Ralstonia eutr叩ha H16抹的菌体为模板DNA的供给源，使用SEQ ID NO: l和SEQ ID NO: 2所示的引物进行PCR反应，得到了含有聚羟基链 烷酸合成酶基因(phaCRe)的结构基因的DNA片段。PCR条件如下(1)94°C2 分钟、(2)94°C30秒、(3)45°C30秒、(4)72°C3分钟、(2)~(4)25个循环、(5)72°C5 分钟；使用TaKaRaLATaq(TaKaRaBio公司制造)作为聚合酶。将PCR所得 的DNA片段用限制酶BamHI切割，然后亚克隆到用相同酶切割载体 pBluescriptIIKS(-)(TOYOBO公司制造)而形成的位点上(pBlue-phaCRe)。
如下述地制备作为豚鼠气单胞菌来源的聚酯合成酶变体基因的 N149S/D171G变体。首先，将pBluescriptIIKS(-)(TOYOBO公司制造)用Pstl 处理，使用DNA Blunting Kit(TaKaRaBio公司制造)进行平末端化并进行连 接，从而使Pstl位点缺失。然后，将该质粒进行Xhol处理，使用DNA Blunting Kit(TaKaRaBio公司制造)进行平末端化并进行连接，使Xhol位点缺失，从 而制备了质粒pBlue-New。在该质粒的EcoRI位点上克隆了使用相同酶从 pJRD215-EE32dl3(专利文献5)切出的d13片段(pBlue-d13)。然后，以从理化学研究所获得的克隆E2-50来源的质粒(非专利文献13)为模板,使用SEQ ID NO: 3和4所述的引物的组合以及SEQIDNO: 5和6所述的引物的组 合，分别通过PCR法进行扩增，得到了2个片段。PCR条件为(1)94'C2分 钟、(2)94。C30秒、(3)55。C30秒、(4)72。C2分钟、(2) (4)25个循环、(5)72°C5 分钟。将扩增出的2个片段等摩尔混合，再进行PCR反应，使这2个片段 结合。PCR条件为(1)96。C5分钟、(2)95。C2分钟、(3)72。Cl分钟、(2) (3)12 个循环，使用Pyrobest聚合酶(TaKaRaBio公司制造)作为聚合酶。将目的大 小的DNA片段从琼脂糖电泳凝胶中切出，用Pstl和Xhol进行处理，以片 段替换的形式将其克隆在用相同酶处理的pBlue-d13 中 (pBlue-N149S/D171G)。碱基序列测定使用PERKIN ELMER APPLIED BIOSYSTEMS公司制造的DNA测序仪310 Genetic Analyzer进行，确认获 得了变异基因，其中，PHA合成酶的第149位的氨基酸即天冬酰胺被取代 为丝氨酸、第171位的氨基酸即天冬氨酸被取代为甘氨酸。该氨基酸序列 示于SEQ ID NO: 9。
以pBlue-N149S/D171G为模板，使用SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8 所示的引物进行PCR反应，扩增了 N149S/D171G变体的结构基因DNA。 PCR条件为(1)94。C2分钟、(2)94°C30秒、(3)45°C30秒、(4)72°C2分钟、 (2)~(4)25个循环、(5)72°C5分钟，使用TaKaRa LA Taq(TaKaRaBio公司制 造)作为聚合酶。然后，将pBlue-phaCRe用限制酶Sbfl和Csp45I进行处理， 以用相同酶处理的上述扩增DNA片段取代phaCRe结构基因的形式进行了克 隆(pBlue-phaCRe: : N149S/D171G)。
然后，将质粒pJRD215(ATCC37533)用限制酶Xhol和Dral进行处理， 分离出含卡那霉素抗性基因的约1.3kb的DNA片段后，使用DNABlunting Kit(TaKaRaBio公司制造)对末端进行平滑化，将其插入到了用限制酶Sail 切割pBlue-phaCRe: : N149S/D171G后同样进行了平末端化而形成的位点 上(pBlue-phaCRe: : N149S/D171G画Km)。
接着，将质粒pMT5071(Tsuda、 GENE， 207: 33-41(1998))用限制酶Notl 进行处理，分离出包含sacB基因的约8kb的DNA片段，将其插入到用相 同酶切割pBlue-phaCRe: : N149S/D171G-Km而形成的位点上，从而制备了 基因取代用质粒pBlue-phaCRe: : N149S/D171G-KmSAC。
本实施例中构建的基因取代用质粒pBlue-phaCRe ::
14N149S/D171G-KmSAC的结构示意图如图1。 C实施例2)基因取代林的制备
用基因取代用质粒pBlue-phaCRe: : N149S/D171G-KmSAC转化大肠杆 菌S17-1抹(ATCC47005),与Ralstonia eutropha H16株一起在Nutrient Agar 培养基(Difco公司制造)上混合培养，进行了接合转移。选择在含250mg/L 卡那霉素的Simmons琼脂培养基(柠檬酸钠2g/L、氯化钠5g/L、七水合硫酸 镁0.2g/L、磷酸二氢铵lg/L、磷酸氢二钾lg/L、琼脂15g/L、 pH6.8)上生长 繁育出的菌抹，从而得到了质粒重组到Ralstonia eutropha H16抹的染色体 上的菌抹(第一阶段的同源重组)。将该菌抹用Nutrient Broth培养基(Difco 公司制造)培养2代，然后，稀释涂布在含15%蔗糖的Nutrient Agar培养基 上，选择生长繁育出的菌林，得到了含选择标记基因的区域已经脱落的菌 抹(第二阶段的同源重组)。而且，通过基于PCR的分析，分离出了 phaCRe 基因已被取代成N149S/D171G变体基因的菌林。将该基因取代林命名为 KNK-005抹，使用PERKIN ELMER APPL正D BIOSYSTEMS公司制造的 DNA测序仪310 Genetic Analyzer进行碱基序列测定，确认了 获得的菌抹 中，染色体上的phaCRe基因的从起始密码子到终止密码子被取代成了 N149S/D171G变体基因的从起始密码子到终止密码子。
本实施例中进行的基因取代的程序示意性地示于图2。通过第一阶段的 同源重组，基因取代用质粒插入到染色体中，通过第二阶段的同源重组， 相当于该质粒的部分重新成环并从染色体上脱离。在第二阶段的同源重组 时，视发生同源重组的位置而定，存在两种情况——与和原初相同的取代 基因(图中的phaCRe: : N149S/D171G)—起脱离的情况(A1),以及，与被取 代基因(图中的phaCRe)—起脱离的情况(A2)，本发明的KNK-005抹，是通 过在A2的位置进行第二阶段的同源重组而获得的菌抹。
(实施例3)聚酯的生产和纯化
种子培养基的组成为lw/v%肉提取物、lw/v%细菌胰蛋白胨 (Bacto-Trypton) 、 0.2w/v%酵母提取物、0.9w/v%Na2PO4 . 12H20 、 0.15w/v%KH2PO4、 pH6.8。
前培养培养基的组成为Uw/v% Na2P04.12H20、 0.19w/v% KH2P04、 1.29w/v%(NH4)2S04 、 0.1w/v% MgS04'7H20、 2.5w/v%Palm W 。lein油、 0.5v/v%微量金属盐溶液(在0.1N盐酸中溶解1.6w/v% FeCl3 6H20、 lw/v%CaCl2 2H20、 0.02w/v% CoCl2. 6H20、 0.016w/v% CuS04. 5H20、0,012w/v% NiCl2.6H20而得)。
聚酯生产培养基的组成为0.385w/v% Na2P04. 12H20、 0.067w/v% KH2P04、 0'291w/v%(NH4)2SO4、 0.1w/v% MgS04'7H20、 0.5v/v%微量金属 盐溶液(在0.1N盐酸中溶解1.6w/v% FeCl3'6H20、 lw/v% CaCl2'2H20、 0.02w/v% CoCl2 6H20、0.016w/v% CuS04 5H20、 0.012w/v% NiCl2 6H20而 得)、0.05w/v。/oBIOSPUREX200K(消泡剂Cognis Japan公司制造)。在碳源 方面，使用椋榈仁油分级的低熔点级分即棕榈仁油油精作为单一碳源，在 整个培养过程中流加，使得比基质供给速度为0.08-0.1(油脂(g))x(净千燥菌
体重量(g))"x(h)"。
在种子培养基(10ml)中接种KNK-005林的甘油储液(50pl)，培养24小 时，按1.0 v/v。/。接种于装有1.8L前培养基的3L小型发酵罐(丸菱BIOENG 生产，MDL-300型)中。运行条件为培养温度30°C、搅拌速度500rpm、通 气量1.8L/min，控制pH值在6.7-6.8之间，培养28小时。pH值控制使用 7%氢氧化铵水溶液。
聚酯生产培养是将前培养种子按5.0 v/v。/。接种于装有6L生产培养基的 10L小型发酵罐(丸菱BIOENG生产，MDL-1000型)中。运转条件为培养温 度28°C 、搅拌速度400rpm、通气量3.6L/min,控制pH值在6.7-6.8之间。 pH值控制使用7%氢氧化铵水溶液。培养进行约48小时，培养结束后通过 离心分离回收菌体，用曱醇洗净并冷冻干燥，测定干燥菌体重量为110.4g/L。
向约lg所得的干燥菌体中加入100ml氯仿，于室温搅拌一昼夜，抽提 菌体内的聚酯。滤去菌体残渣后，用蒸发器浓缩至总容积为约30ml,然后 緩慢加入约卯ml的己烷，在緩慢搅拌下放置1小时。将析出的聚酯滤出后， 于50。C真空干燥3小时。测定干燥聚酯的质量，计算菌体内的聚酯含量。 其结果是，KNK-005林48小时产生的聚酯的含量高达73.8(wt%)。
(实施例4)聚酯生产能力的稳定性评价
稀释实施例3的聚酯生产培养结束时的培养菌液，将其接种于Nutrient Agar培养基，将生长繁育出的菌落接种于含尼罗红(Nilered)培养基(磷酸氢 二钠.12H20 9g、磷酸二氬钾1.5g、氯化铵0.05g、硫酸镁'7H2O0.02g、果 糖0.5g、氯化钴'6H20 0.25ppm、氯化铁(111)'61120 16ppm、氯化4丐'2&0 10.3ppm、氯化镍'61120 0.12ppm、硫酸铜.5H20 0.16ppm、 Nilered 0.5mg、
16琼脂15g/lL)。 30°C、培养3天后呈红色的菌落可判定为正在生产聚酯。考
察了100个菌落，结果是全部菌落均保持聚酯生产能力。
工业实用性
本发明提供下述重组微生物林，所述重组微生物抹能够在产业用发酵 过程中稳定地高性能地生产聚羟基链烷酸(PHA)，本发明可以简便、大量且 廉价地制造高纯度的聚羟基链烷酸(PHA)。
权利要求
1. 一种生产共聚聚酯的微生物，所述共聚聚酯由选自3-羟基丁酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一烷酸、3-羟基十二烷酸、3-羟基十三烷酸、3-羟基十四烷酸、3-羟基十五烷酸以及3-羟基十六烷酸中的2种以上单体单元构成，该微生物的染色体上本来具有聚羟基链烷酸合成酶基因，并且该聚羟基链烷酸合成酶基因的至少一部分已被取代成外源性聚羟基链烷酸合成酶基因。
2. 根据权利要求1所述的微生物，其中，所述共聚聚酯由3-羟基丁酸 和3-羟基己酸单体单元构成。
3. 根据权利要求1或2所述的微生物，其中，所述染色体上本来具有聚 羟基链烷酸合成酶基因的微生物为真养雷氏菌(i a/Wom'a e"&o; /za)。
4. 根据权利要求3所述的微生物，其中，所述真养雷氏菌为真养雷氏 菌H16株。
5. 根据权利要求1~4中任一项所述的微生物，其中，所述外源性聚羟 基链烷酸合成酶基因编码来源于豚鼠气单胞菌04eromomw caw'ae)的酶或其变体。
6. 根据权利要求5所述的微生物，其中，所述变体至少进行了以下(a)、 (b)之一的氨基酸取代(a) 第149位的氨基酸即天冬酰胺被取代成丝氨酸，(b) 第171位的氨基酸即天冬氨酸被取代成甘氨酸。
7. 根据权利要求1 4中任一项所述的微生物，其中，所述外源性聚羟 基链烷酸合成酶基因编码用SEQIDNO: 9的氨基酸序列表示的豚鼠气单胞 菌来源的变体酶，该变体酶是第149位的氨基酸即天冬酰胺被取代成丝氨 酸、且第171位的氨基酸即天冬氨酸被取代成甘氨酸而成的。
8. —种微生物，其为KNK-005抹。
9. 使用了权利要求1~8中任一项所述的微生物的聚酯制造方法。
全文摘要
本发明的目的是提供下述重组微生物株，所述重组微生物株能够在产业用发酵过程中稳定地高性能地生产聚羟基链烷酸(PHA)。本发明为存在于微生物的染色体上的聚羟基链烷酸合成酶基因被外源性聚羟基链烷酸合成酶基因取代而得到的重组微生物株。
文档编号C12N1/20GK101501182SQ20068005542
公开日2009年8月5日 申请日期2006年7月21日 优先权日2006年7月21日
发明者丸山裕之 申请人:株式会社钟化;梅雷迪安股份有限公司