通过检测转变区的甲基化来诊断癌症的方法

专利名称：：通过检测转变区的甲基化来诊断癌症的方法
技术领域：
：本发明涉及一种通过检测转变区(transitionalzone)的曱基化来诊断癌症、确认转移和预后的方法以及一种用于检测曱基化的引物。癌症已经被认为是由于基因突变而引起的遗传性障碍。通过DNA的核苷酸序列来确定蛋白质的氨基酸序列和功能。然而，蛋白质的表达受到DNA曱基化的影响。即，特定基因的功能和表达取决于核苷酸序列和DNA曱基化。在肿瘤组织中，通常观察到这些遗传变化和表观变化。因此，通过检测肿瘤组织中的这种遗传变化和表观变化，可以解释特定癌症的起因，对癌症的预防和治疗的研究提供有利信息。肺瘤组织中DNA曱基化的方面如下1)在肿瘤组织中观察到DNA曱基化和去曱基化两者，2)在CpG岛相邻基因中观察到DNA曱基化，同时在重复序列中观察到DNA去曱基化，3)在癌症的发生和发展过程中，DNA曱基化和去曱基化起到独立的作用。目前还没有清楚地理解在癌症发生和发展过程中DNA曱基化所涉及的细节。然而，已经发现了在细胞生长、分化和老化过程中所涉及的DNA甲基化的各个方面，使DNA曱基化成为理解由遗传不稳定性引起的各种恶性表型的研究的主要目标。人体基因组在早期发育过程中通过表遗传重编程分化为各个组织。表遗传结构主要在胚胎发生的早期过程中建立，表遗传结构主要分为两部分，一部分在整个生命中都被保持，另一部分是可以根据细胞分化和RNA重复序列而改变的转变区。占人体基因组的40%以上的反转录因子是源于内源性反转录病毒类遗传因子的重复序列。反转录因子诱导自身的曱基化，同时引起相邻DNA的曱基化，这表明在整个基因组中反转录因子在DNA曱基化的过程
背景技术：
：4中起到关键作用。可以通过简单重复序列标记来检测染色体丢失，染色体丟失反映基因组的剂量减低。剂量减低引起剂量补偿机制，以保持每个个体中的基因组的剂量。因此，染色体丟失诱导核酸去甲基化，从而补偿剂量减低，这种去曱基化过程显示出与内因性程序相似的基因表达模式，即，怀孕早期阶段为了诱导胎盘形成激活表观基因，以使细胞侵犯和转移，并且伴随分娩而丟失。。因此，本发明人研究了与肿瘤组织中的染色体丟失有关的DNA曱基化，并且基于发明人的发现(与CpG岛相比，在CpG岛和与其相邻的反转录因子之间的转变区中更积极地诱导DNA曱基化)进一步确认DNA曱基化在诊断癌症的过程中会起到重要作用。1.BalmainA,GrayJ,PonderB.Thegeneticsandgenomicsofcancer(癌症的遗传学和基因组学).NatGenet2003;33S:238-242.HongSJ,ChoiSW,LeeKH,LeeS,MinKO,RhyuMG.Preoperativegeneticdiagnosisofgastriccarcinomabasedonchromosomallossandmicrosatellitemstability(基于染色体丢失和微随体不稳定性的胃癌的外科术前遗传诊断).IntJCancer.2005Jan10;113(2):249-58.3.KimKM,KwonMS,HongSJ，MinKO,SeoEJ,LeeKYetal.Geneticclassificationofintestinal-typeanddiffuse-typegastriccancersbasedonchromosomallossandmicrosatelliteinstability(基于染色体丢失禾口樣t随体不稳、定性的肠型和弥漫型胃癌的遗传分类).VirchowsArch2003;443(4):491-504.ChoiSW,LeeKJ，BaeYA,MmKO,KwonMS,KimKMetal.Geneticclassificationofcolorectalcancerbasedonchromosomallossandmicrosatelliteinstabilitypredictssurvival(基于染色体丢失和孩i随体不稳定性的结肠直肠癌症的遗传分类预测存活)■ClinCancerRes2002;8(7):2311-2322.
发明内容技术问题本发明的目的是提供一种在外科手术前通过用内镜;险查肿瘤组织从而能够预测癌症转移和预后的准确等级的诊断癌症的方法。技术方案为了实现以上目的，本发明提供了一种通过研究转变区的DNA曱基化来诊断癌症以及预测转移和预后的方法。本发明还提供了一种用于研究转变区的DNA曱基化的引物。本发明还提供了一种能够测定杂合性丟失(LOH)和染色体不稳定性的简单重复序列标记组。在下文中详细描述本发明。本发明提供了一种通过测量转变区的甲基化来诊断癌症和预测转移或预后的方法。新发现的转变区是形成在CpG岛和位于基因上游的转录调控区的与其相邻的反转录因子之间的可变区域，其中的曱基化取决于重复序列的转录密度。除了依赖于转录密度的曱基化之外，这个区域表现出不同等级的变异性以及在正常组织和肺瘤组织之间在模式方面的很大区别，这表明这个区域可以用于"^断癌症。为了筛选在癌症发展过程中相关的基因，要考虑以下标准l)基因和反转录因子之间的距离；2)相邻反转录因子的类型；3)反转录因子密度；4)基因之间的距离；5)CpG岛和反转录因子之间的关系；6)核内部的反转录因子的密度。考虑到以上标准，已经确定40个表观基因(epigene)与癌症的诊断有关，根据CpG岛的核苷酸序列的数量将这40个表观基因分为两组一组包括例如在富核苷酸序列的CpG岛中制备的RABGEF1、STAG和CHGB之类的标记，另一组包括在缺乏核苷酸序列的CpG岛中制备的TNFRSF14、SERP膽5、ANGPTL7、TFF2、BGLAP、MSLN、DDX53和MAGEA2。上述40个表观基因也可以根据CpG岛的核苷酸和与其相邻的反转录因子之间的距离分组，这些表观基因是在包括近端和远端的两个或更多个区域中制备的VDR、ST14、CDKN2A、MYBPC2、RUNX3、RUNX2、MLH1、PTEN等。如果在上游中Ll或LTR与Alu相比较多，并且在基因的起点处缺乏CpG岛核苷酸序列，则曱基化转变区将成为诊断癌症和预测癌症发展的更有效目标。如果在基因的起点处富含CpG岛核普酸序列，则在反转录因子和CpG岛之间制备的标记对于预测将非常有效。可以通过在第2004-001575号韩国专利公布、第2006-0026595号韩国专利公布和第2003-0069752号韩国专利公布中描述的传统方法来测定甲基化。本发明还提供了一种用于检测转变区曱基化的引物。6所述引物可以有效地用于测定转变区的曱基化等级，所述引物可以为从由表1中列出的那些序列组成的组中选择的一组正向引物和反向引物。该引物组可以应用于电泳和微阵列芯片。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>TTTAGTTTGGQACTCACQCT+0.8kbUGTATTTTAGGAAGT工GTTGTTTGITTTTCTCCCCAACCTCCCAACA10158MGTATTTTAGGAAGTCGTTGTTTGCTTTTTCTCCCCAACCTCCCGACG10260-0.2kbUGGTTAGGTTTTGTGTTTTGAIGICCTAACTACAC△CTCCATCCA11158MGGTTAGGTTTTGTGTTTTGA￡G￡CCTAACTACQCQCTCCATCC￡11158-1.2kbUTTTTTAATTTAGIGGGGTTIGIAAAAACATCCAACCAATCC厶9658MTTTAATTTAG￡GGGGTT￡G￡AAAAACQTCCAACCAATCC^9460-0.7kb.utgtt工gttt工gggaa5agtigiaactccjaaatttcacacccca12558mtgtt￡gttt￡gggaa5agt^^aactccqaaat12560-0.4kbUTGTAAAA工GGATTGGG王GAAAACTCTC△AACCCC^C11658mttgtaaaagggattggg5aaaactctcgaaccccgc11658-0.5kbUGAIG工GT工GTATAGTT;AfiGG工TCCCCATTAAACAACCTCCA9756M^G^GT￡GTATAGT^A^CGGCTCCCCQTTAAACQACCTCCQ9558-1.7kbU工GGGGTTAGATTTTIGTTGTTTTIATAAAATCTTACAACCACCATCA10756M^GGGGTTAGATTTT￡GTTGTTTT^ATAAAATCTTACGACCACCGTCG10758+1,0kbUGT工GTTTTAATGGG;GTAGGGATCAAAATAAAACAAAAACACCTCA14759MG丁GGTTTTAATGGG;GTAGGGACQAAATAAAACjQAAAACGCCTCG14759P起，-1.0kbUGTAGGAGGATTTTTGGTTTGTTCCTAAATTACAACCCAACCTCA11559MAGGAGGATTTTTGGTTCGTCTAAATTACQACCCAACCTCQm59肌肌'-0.6kbUTTTTGAIGTAGAIGTTTTATfXGGGTfbTACCACCTCATCATAACTACCCACA1258ma￡gtaga￡gttttattagg5tcgccctcatcqtaactacccgcg1〗558-1.0kbUGATTTTAGGATTGTTGATATGAGTAAACTACCTCCTAATCTTTATCCA12658MGATTTTAGGATTAACTACCTCCTA125588GT￡GATATGAG￡ATCTTTATCCS0kbUGGTGAATTTTTAGTTAATTAGIGGTAITCACAAATACTTTACAATTCCAACA10856MTGAATTTTTAGTTAATTAG￡GGTA￡ACAAATACTTTACAATTCCGACG10458-1.4kbUTTT工G工GTTTTGTAAG;ATTGGTAACCTCCCAAAAAAACACTATCA12458MTTTGGGGTTTTGTAAG"TCGGCACCTCCCGAAAAAACGCTATCG12360-0.9kbUTATTTTGT工GGGTTTTTA远GIAACTCCAAATCAA9658mTATTttgt￡GGgtttttac5gcaaatcqattcgcgacgtcg9058+0.4kbUTAATGGTTTTTGAGGATTGAGAT工GCACAAACTATTATCAACCAATCACA10358MTAATGGTTTTTGAGGATTGAGATCCACAAACTATTATCAACCQATCACQ10362-1.1kbUTGGTTGTTATTTGGGGIGGTIGCTAAACCACACTAAAAACAAACA8856MTGGTTGTTATTTGGGGGGGT匸CTAAACCACACTAAAAACQAACQ8858-0.7kbUGGTTT工GGAAATTGTATA工GGIGIAAACAACAAATCTC^AACCTACA9658MTTTGGGAAATTGTA^ACGGCGCAACAAC^AATCTCQAACCTACG9358-3,0kbUTGTTIGAGTGTATAT(fAGTGGATTCTCTCAAATCCCACAAACAACCA12359mtgttggagtgtatat^Xgtggactctctcqaatcccacaaacqaccq12359-3.8kbUAGGTTTAGTTAGTTTTAGTTGCCACTAAATACCCTAACAACA11359MAGGTTTAGTTAGTTTTAGTTGCCACTAAATACCCTAACAACQ11359+1.6kbUGTTTGAGGG工GGGTGGTAGTIGIACTACCCCAAAAAATCTAAATCA12759MGTTTGAGGGGGGGTGGTAGTCGCACTACCCCSAAAAATCTAAATCG127592.0kbUGGTAGGAGTTATTAGGAGAGTATTAATACAAACACTCACCACCTAACCA14055MGGTAGGAGTTATTAGGAGAGTATCAATACAAACQCTCACCGCCTAACCG14060磁2，0.9kbUTTTTTTTTAAGGATTT工G工GIG工ACTAAAAATACACATTCCACCA11156MTTTTTTTAAGGCCAACTAAAAAT113589<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本发明还提供了一种用于癌症的诊断套组，该诊断套组包含可以用于检测转变区的曱基化的引物。所述诊断套组中包含的引物可以为能够通过互补结合到RABGEFl、STAG、CHGB、TNFRSF14、SERPINB5、ANGPTL7、TFF2、BGLAP、MSLN、DDX53、MAGEA2、VDR、ST14、CDKN2A、MYBPC2、RUNX3、RUNX2、MLH1或PTEN基因的转变区序列而扩增的每个序列。并且，从由表l中列这种引物的构成可以通过本领域技术人员已知的传统方法来实现，通过本领域技术人员通常使用的RCR仪可以确认利用本发明的诊断套组中的引物扩增的PCR产物。本发明还提供了一种用于测量杂合性丟失(LOH)和染色体不稳定性的筒单重复标记组。本发明提供了用于利用频繁丟失来选择与癌症有关的染色体的40个简级将那些染色体变异分为四组非常有用，这四组为基本、LOH-L(低)、LOH-H(高)染色体丟失和微随体不稳定性(MSI)。所述遗传变异可以分为高风险基因型(LOH-H和LOH-B)和低风险基因型(LOH-L和MIS),遗传变异是预测二期和三期胃癌病人存活率的关键因素(图4、图5和图6)。通过检测重复序列不稳定性和染色体丢失，将基因型分类，从而预测转移和复发，其中，重复序列不稳定性和染色体丟失是胃癌的两个最特别的病理特性。引物和反向引物。chr标记正向反向Tm扩增产物大小杂化度(%)3D3S1597AATACACACAAATGTCTCTCCCCCTTTTTTTCAGTGGTATGC5680-100803D3S1552ATTCCATACTGTAGGGAGTGTGCAAATGCCATGCTGTA56140-160623D3S1312CTTCTCACTGCATATGACTCGGCTCCCCAGGGTAAG56148158603D3S1478GATGAAACTGTGATAGCACCCTGCCAGTAATGTAAATCTCC62109-140793D3S1619GTCCTGCAAGACTCATTGTTGCTAGGATGGTTGTTTTC59161-171604D4S1609TCTGAAAATGCCCTTGACCCATCATTACTGCTGGGATGC59163-177674D4S2946GTCAAGAGGACCTGTCTGA59104-1267211GCTGATTCTGACTTGCGTG4D4S174GCAGTTCAAAGATGAAAGTGCATTCCTAGATGGGTAAAGC54114~134774D4S391CACATAACTTCCCTTGCTGGACTGTTGTCAAATCAGGCTC59164-185864D4S230GGTAAATAGGGAAAATGACATTAGGATGCTGACTTCACCA56170-19605D5S519CTACTACCAGCAGCATTCTCATCTGCAGTGTGAGGCAATG59114-128835D5S346ACTCACTCTAGTGATAAATCGGGAGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT5696-135835D5S409GGGATGAAGTGTGGATAAACTAGGATGGCAGTGCTCTTAG59138-154695D5S349ATTTGGTTTCCATAGAATCTGAGATTACACCCACCAGATTAAGCG62140-158725D5S422TTAATTGATCTGGGCTGGAGAACCCAGAGCAAGGTCCTGTCTGAAAAT59113-134858D8S261TGCCACTGTCTTGAAAATCCTATGGCCCAGCAATGTGTAT128-1444188D8S262D8S503AGCTCAAAAGCGAAGGTGATGGCAACAAAGTGAGATCCTG59114-1280CGTTTGGAAATTGTCATTACCTCGC丁CAGAAACAAACCAA56107-120458D8S552AGGATTGTAATTTCCTTGCGGGACTTTTTGAAGGTTTG56168-182798D8S277GATTTGTCCTCATGCAGTGTACATGTTATGTTTGAGAGGTCTG120-140749D9S157AGCAAGGCAAGCCACATTTCTGGGGATGCCCAGATAACTATATC113-149769D9S200GCATTTCACAGGAAATAATCTAAGGCCTCTCTGCATGCCCCAG107-127689D9S270AGGTGTAGTCCTTCTGGAATTTGATGTGACTGCTGTTAAAACTAGAG5987-101719D9S199ACACATTCATACCATAGCAGAGGGGGGAAAGCATTCAGACTTT56144-164779nos78SAGCAACCT。5CAACAGGGAATCATCCAGAAAGGCCA62124-1407213iGGCCTGAAAGGTATCCTCTCCCACCATAAGCACAAG56148-162i6913mCCTGGCCTGTTAWW;GTTTTTATTGTTACCCAGTCTTGGGTATGTTTTTA56145-16501313D13S135D13S286—CCCTGTCTTCTACTTCCTGTATGCCGGTTCTCAACCAGGAGAAA59168-17475TGATTGTATGTAGAGTGCAG5680-900<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本发明还提供了一种包含筒单重复序列标记组的用于癌症的诊断套组。所述诊断套组中包含的引物是从由表2中列出的那些序列组成的组中选择的成对的正向引物和反向引物。这些引物的构成可以通过本领域技术人员已知的传统方法来实现，通过本领域技术人员通常使用的RCR仪可以确认利用本发明的诊断套组中的引物扩增的PCR产物。本发明人确定的是曱基化随着染色体丟失的增加而增加，随着染色体丟失的减少而减少。因此，对同一病灶，研究曱基化并且测量LOH等级，使得由染色体丢失的不连续性导致的不准确机会减少。本发明提供的遗传学方法的结果在于，该方法比CT更准确地预测淋巴结转移。外科手术之前的遗传学诊断能够提供关于胃癌病程的信息。因此，本发明的用于遗传学诊断的方法对于计划手术和治疗非常有用。参照附图最好地理解本发明优选实施例的应用，其中图l是示出了位于CpG岛和与转录起点相邻的反转录因子之间的转变区根据细胞或组织中的重复序列的转录密度分别诱导的曱基化的示意图，这表明组织特定甲基化存在变异。通过检测该可变区中的表遗传标记可以预测癌症发展。图2是示出了将具有LOH的染色体定量并且测量病灶的大小的框图。基于此，在肠型中，染色体丢失被分为LOH-H(高，48个丢失)和LOH-L(低，03个丟失)；在弥漫型中，染色体丟失被分为LOH-H(高，48个丢失)、LOH-L(低，23个丢失)和LOH-B(基本的，01个丟失)。这种分类有助于在从内镜组织得到的基因和从手术组织得到的基因之间进行基因型比较。基于基因型比较的结果和测量癌症病灶的大小，通过利用LOH在外科手术之前i貪断癌症。图3是示出了通过利用可变区表遗传标记对表现出染色体不稳定性的每个低风险组(病例10)和高风险组(病例25)的正常组织和肺瘤组织进行才佥测的PCR和电泳结果的照片。病例10:低风险组(具有染色体不稳定性)病例25:高风险组(没有染色体不稳定性但是具有LOH-H)U:利用去曱基化标记的PCR结果M:利用曱基化标记的PCR结果%:曱基化程度图4是示出通过利用位于4p、5q、9p、13q、17p和18q处的40个简单重复序列标记对正常组织和肿瘤组织进行PCR和电泳结果的照片。*表示通过将与正常组织进行比较而确认的具有染色体丟失的区域，病例25显示出LOH-H。图5是示出由在二期和三期中进行了手术的130个胃癌病人得出的存活曲线的一组曲线图。当按照基因型对病人分类时，低风险组(LOH-L，染色体不稳定)显示出高存活率，而高风险组(LOH-H，LOH-B)显示出低存活图6是示出染色体丢失和转变区曱基化可以作为诊断癌症的指标的一组曲线图，通过图6,清晰地分开了高风险组(LOH-H、LOH-B)和低风险组(LOH-L、MSI)。具体实施例方式下面的示例中示例性地示出了本发明的实践的和当前的优选实施例。然而，考虑到本公开，本领域技术人员将理解的是，可以在本发明的精神和范围内进行》f改和改进。示例1:利用测量转变区曱基化的PCR标记进行癌症诊断<1-1〉显微解剖和DNA提取将固定在石蜡块中的肺瘤组织样品切成5pm厚，用二曱笨去除蜡，接着在乙醇中水合。该样品用苏木精-曙红染色，接着被固定在载片上。在显微镜下观察，用针将载片上的肿瘤组织和正常组织分离。从正常区域和肺瘤区域得到的组织均放入到裂解緩沖液中，在37。C下保持3小时，然后在50。C下保持3小时。在PCR之前将样品加热使蛋白酶K失去活性。<1-2>为了得到用于分析曱基化模式的样品，进行亚硫酸氢盐修饰和曱基化特定PCR将NaOH加入在示例<1-1〉中得到的DNA中，在37。C保持10分钟。将对苯二酚和亚硫酸氢钠(pH5.0)加入其中，然后搅拌。对混合物加载矿物油，然后在5CTC反应16小时。利用优质的(wizard)DNA纯化树脂(Promega,USA)执行纯化，然后洗提。按0.3M的等级将NaOH加入到反应混合物中，接着在室温下反应5分钟，从而完成修饰。通过在存在糖原和乙酸钠的情况下加入乙醇来执行乙醇沉淀，在-20。C下搅拌并且放置过夜。对沉淀物进行30分钟的离心分离，接着用70%的乙醇清洗。制备的样品直接使用或者在-20。C下储存待以后使用。PCR反应混合物中含lxPCR緩冲液、dNTPs、P32-dTTP、引物和亚硫酸氢盐修饰过的DNA或者未修饰的DNA。在95。C下执行热启动5分钟，为了扩增，向其中加入Taq聚合酶。最后在72。C下执行延伸IO分钟。将PCR产物加载到聚丙烯酰胺凝胶上，接着进行电泳。利用无线电发光绘图扫描仪(BAS2500,FujiPhotoFilm，日本)进行观察。通过利用标准校正曲线来计算曱基化等级(％)并用百分比表示。在图3中，U表示利用去甲基化标记扩增的结果，M表示利用甲基化标记扩增的结果，％表示曱基化程度(等级)。图3示出了通过利用可变区表遗传标记和由CpG岛周围的核苷酸序列制备的标记对表现出染色体不稳定性的每个低风险组(病例10)和高风险组(病例25)的正常组织和胂瘤组织进行4全测的PCR和电泳结果。当卩吏用由CpG15岛周围的核苷酸序列制备的标记时，正常组织和肿瘤组织的曱基化模式没有明显区别。然而，当使用由CpG岛序列区之外的转变区制备的标记时，低风险组(病例10)显示出曱基化，而高风险组(病例25)显示出去曱基化。上述结果表示CpG岛序列区的标记根据正常组织或胂瘤组织没有明显不同，而转变区的标记对曱基化更加灵敏，使得转变区标记成为癌症诊断更好的选择。在高风险组(病例25)中，CpG岛的那些标记(例如P15或RASSF1A)的曱基化模式在正常组织和肿瘤组织之间类似，而转变区的那些标记(例如MLH1或MAGEA2)的曱基化模式在正常组织和肿瘤组织之间明显不同。在高风险组(病例25)中，对于MLH1(-0.61(b),CpG岛序列区的曱基化和染色体丟失在正常组织和肿瘤组织之间没有明显不同，这表示ML.m对于癌症诊断来说是不优选的标记。然而，本发明的转变区的曱基化在正常组织和肿瘤组织之间明显不同。示例2:通过简单重复序列标记测量LOH(杂合性丢失)通过利用位于4p、5q、9p、13q、17p和18q的40个简单重复序列标记对正常组织和肺瘤组织(胃癌)进行PCR和电泳。结果，在病例10中，至少40%(—共15个)的纯合标记显示出高的染色体不稳定性，而在病例25中检测到LOH-H染色体丢失。示例3:内镜病灶和手术病灶之间的染色体丟失的比较只要内镜病灶可以表示总基因型，内镜病灶的杂合性丢失(LOH)就可以在外科手术之前用于遗传学诊断。比较了91对内镜病灶和手术病灶，结果，96%显示出类似的基因型，表明在手术之前可以在胃癌病人上进行内镜病灶的遗传学诊断。示例4:通过LOH等级和病灶大小的结合化验来确认手术组织的预测准确性通过对130位胃癌病人的多病灶研究，确定在高风险基因型中频繁发生淋巴结转移，而与病灶的大小无关。在低风险组中的至少5cm病灶中，淋巴结转移为83%。与较小病灶(<5cm)相比，在较大病灶(〉5cm)中频繁发生肠内侵犯。考虑到内镜病灶的基因型以及病灶的大小，可以准确地预测手术组织，对于淋巴结转移和肠内侵犯来说精确的接受者操作特性区域(Roc区域)分别为0.815和0.685。示例5:通过LOH等级和病灶大小的结合化验进行手术组织的预测以及16计算机X线体层照相结果之间的准确性比较表3示出了将计算机x线体层照相结果与LOH和病灶大小的结合化验的准确性进行比较的示例。结果，LOH与病灶大小的结合化验的预测比计算机x线体层照相结果更加准确(肠内侵犯；ROC区域=0.691vs0.548)或者(淋巴结转移；ROC区域=0.691vs0.642)。病理学基因型大小计算的X线体层照相p值2浆膜外(extraserosal)"f憂^巳否曰疋否曰疋否38(42)21(70)17(28)23(46)15(37)是53(58)9(30)44(72)27(54)26(63)ROC区域'0.6910.5480,076淋巴结转移(％)否曰疋否疋否36(40)25(83)11(18)22(61)14(39)是55(60)5(17)50(82)18(33)37(67)ROC区域10.8020.6420.021'ROC曲线下面的区域2在微随体基因型和计算的x线体层照相之间的ROC区域的比较示例6:存活率与根据LOH和染色体不稳定性分类的基因型之间的关系图5是示出由在二期和三期中进行了手术的130个胃癌病人得出的存活曲线的一组曲线图。当按照基因型对病人分类时，低风险组(LOH-L，染色体不稳定)显示出高存活率，而高风险组(LOH-H，LOH-B)显示出低存活率。示例7:通过测量LOH等级和可变区的曱基化等级来增加遗传学诊断的准确性图6是示出通过测量甲基化来更清楚地确认将LOH分为高、低、基本和染色体不稳定性的一组曲线图。图6A和图6B是示出曱基化随着染色体丢失的减少而减少的曲线图，图6C和图6D是示出曱基化随着染色体丢失的增加而减少的曲线图。在染色体丟失的高等级和基本等级中，曱基化减少，而在17染色体丟失的低等级和染色体不稳定性中，曱基化增加。利用根据染色体丟失等级的这种曱基化差异，提高了癌症诊断预测的可靠性。即，曱基化与LOH等级密切相关，从而测量曱基化能够减少由LOH不连续性引起的不准确性，表明同时测量LOH等级和曱基化两者增加了遗传学诊断预测的准确性和可能性。产业上的可利用性本发明提供了一种用于提高癌症诊断和预测的准确性的方法，该方法通过1)通过测量转变区的曱基化来提供可用于癌症诊断的标记组，2)提供与LOH有关的简单重复序列标记组，3)同时测量转变区的甲基化和LOH等级，从而提高癌症诊断和预测的准确性。因此，本发明提供了一种在外科手术之前进行遗传学it断的方法，该方法能够以—d、部分的病灶和内镜组织来预测转移和预后，这将有效地用于对癌症的外科手术和治疗进行计划。用SEQ.ID.NO:1NO:160表示的序列为癌症诊断中包括的转变区的40个表遗传标记的正向引物和反向引物。用SEQ.ID.NO:1NO:4表示的序列为RABGEF1，-0.2kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:5NO:8表示的序列为STAGl，-0.4kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:9~NO:12表示的序列为CHGB,-0.3kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:13NO:16表示的序列为VDR,-0.7kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:17NO:20表示的序列为VDR，+1.0kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:21NO:24表示的序列为ST14，-0.3kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:25NO:28表示的序列为ST14,-0.8kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:29NO:32表示的序列为CDKN2A,-0.1kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:33NO:36表示的序列为CDKN2A,-1.5kb的正向引物和反向引物；用SEQ,ID.NO:37NO:40表示的序列为CDKN2A,+0.8kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:41NO:44表示的序列为PPARG，-0.2kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:45~NO:48表示的序列为MYBPC2,-1.2kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:49NO:52表示的序列为MYBPC2，-0.7kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:53NO:56表示的序列为RBI，-0.4kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:57NO:60表示的序列为RUNX3,-0.5kb的正向引物和反向引物;用SEQ.ID.NO:61NO:64表示的序列为RUNX3，-1.7kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:65NO:68表示的序列为RUNX3，十1.0kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:69NO:72表示的序列为PAX5,-l.Okb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:73NO:76表示的序列为MLH1,-0.6kb的正向引物和反向引物;用SEQ.ID.NO:77NO:80表示的序列为MLHl，-l.Okb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:81NO:84表示的序列为CDH1,0kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:85NO:88表示的序列为PTEN，-1.4kb的正向引物和反向引物;用SEQ.ID.NO:89NO:92表示的序列为-0.9kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:93NO:96表示的序列为KIAA1752,+0.4kb的正向引物和反向引物;用SEQ.ID.NO:97NO:100表示的序列为FU43855,-l.lkb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:101NO:104表示的序列为RUNX2，-0.7kb的正向f物和反向引物；用SEQ.ID.NO:105NO:108表示的序列为RUNX2,-3.0kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:109NO:112表示的序列为RUNX2，-3.8kb的正向引物和反向引物;用SEQ.ID.NO:113NO:l16表示的序列为RUNX2,+1.6kb的正向引物和反向引物;用SEQ.ID.NO:117NO:120表示的序列为MUC8，+2.0kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:121NO:124表示的序列为ESR2,-0.9kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:125NO:128表示的序列为E2F4,0kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:129NO:132表示的序列为TNFRSF14,-0.6kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:133NO:136表示的序列为SERPINB5,-0.3kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:137NO:140表示的序列为ANGPTL7，+0.5kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:141NO:144表示的序列为TFF2，-0.2kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:145NO:148表示的序列为BGLAP，-0.5kb的正向引物和反向引物;用SEQ.ID.NO:149NO:152表示的序列为MSLN,-0.8kb的正向引物和反向引物;用SEQ.ID.NO:153NO:156表示的序列为DDX53,0kb的正向引物和反向引物；用SEQ.ID.NO:157NO:160表示的序列为MAGEA2，-O.lkb的正向引物和反向引物。用SEQ.ID.NO:161NO:240表示的序列为可以用于测量LOH和染色体不稳定性的简单重复序列标记。SEQ.ID.NO:161是D3S1597的正向引物，SEQ.ID.NO:162是D3S1597的反向引物；SEQ.ID.NO:163是D3S1552的正19向引物，SEQ.ID.NO:164是D3S1552的反向引物；SEQ.ID.NO:165是D3S1312的正向引物，SEQ.ID.NO:166是D3S1312的反向引物；SEQ.ID.NO:167是D3S1478的正向引物，SEQ.ID.NO:168是D3S1478的反向引物；SEQ.ID.NO:169是D3S1619的正向引物，SEQ.ID.NO:170是D3S1619的反向引物；SEQ.ID.NO:171是D4S1609的正向引物，SEQ.ID.NO:172是D4S1609的反向引物；SEQ.ID.NO:173是D4S2946的正向引物，SEQ.ID.NO:174是D4S2946的反向引物；SEQ.ID.NO:175是D4S174的正向引物，SEQ.ID.NO:176是D4S174的反向引物；SEQ.ID.NO:177是D4S391的正向引物，SEQ.ID.NO:178是D4S391的反向引物；SEQ.ID.NO:179是D4S230的正向引物，SEQ.ID.NO:180是D4S230的反向引物；SEQ.ID.NO:181是D5S519的正向引物，SEQ.ID.NO:182是D5S519的反向引物；SEQ.ID.NO:183是D5S346的正向引物，SEQ.ID.NO:184是D5S346的反向引物；SEQ.ID.NO:185是D5S409的正向引物，SEQ.ID.NO:186是D5S409的反向引物；SEQ.ID.NO:187是D5S349的正向引物，SEQ.ID.NO:188是D5S349的反向引物；SEQ.ID.NO:189是D5S422的正向引物，SEQ.ID.NO:190是D5S422的反向引物；SEQ.ID.NO:191是D8S261的正向引物，SEQ.ID.NO:192是D8S261的反向引物；SEQ.ID.NO:193是D8S262的正向引物，SEQ.ID.NO:194是D8S262的反向引物；SEQ.ID.NO:195是D8S503的正向引物，SEQ.ID.NO:196是D8S503的反向引物；SEQ.ID.NO:197是D8S552的正向引物，SEQ.ID.NO:198是D8S552的反向引物；SEQ.ID.NO:199是D8S277的正向引物，SEQ.ID.NO:200是D8S277的反向引物；SEQ.ID.NO:201是D9S157的正向引物，SEQ.ID.NO:202是D9S157的反向引物；SEQ.ID.NO:203是D9S200的正向引物，SEQ.ID.NO:204是D9S200的反向引物；SEQ.ID.NO:205是D9S270的正向引物，SEQ.ID.NO:206是D9S270的反向引物；SEQ.ID.NO:207是D9S199的正向引物，SEQ.ID.NO:208是D9S199的反向引物；SEQ.ID.NO:209是D9S288的正向引物，SEQ.ID.NO:210是D9S288的反向引物；SEQ.ID.NO:211是D13S267的正向引物，SEQ.ID.NO:212是D13S267的反向引物；SEQ.ID.N〇:213是D13S263的正向引物,SEQ.ID.NO:214是D13S263的反向引物；SEQ.ID.NO:215是D13S135的正向引物，SEQ.ID.NO:216是D13S135的反向引物；SEQ.ID,NO:217是D13S286的正向引物，SEQ.ID.NO:218是D13S286的反向引物；SEQ.ID.NO:219是D13S118的正20向引物，SEQ.ID.NO:220是D13S118的反向引物；SEQ.ID.NO:221是TP53的正向引物，SEQ.ID.NO:222是TP53的反向引物；SEQ.ID.NO:223是D17S122的正向引物，SEQ.ID.NO:224是D17S122的反向引物；SEQ.ID.NO:225是D17S796的正向引物，SEQ.ID.NO:226是D17S796的反向引物；SEQ.ID.NO:227是D17S1358的正向引物，SEQ.ID.NO:228是D17S1358的反向引物；SEQ.ID.NO:229是D17S1566的正向引物，SEQ.ID.NO:230是D17S1566的反向引物；SEQ.ID.NO:231是D18S67的正向引物，SEQ.ID.NO:232是D18S67的反向引物；SEQ.ID.NO:233是D18S57的正向引物，SEQ.ID.NO:234是D18S57的反向引物；SEQ.ID.NO:235是D18S474的正向引物，SEQ.ID.NO:236是D18S474的反向引物；SEQ.ID.NO:237是D18S70的正向引物，SEQ.ID.NO:238是D18S70的反向引物；SEQ.ID.NO:239是D18S58的正向引物，SEQ.ID.NO:240是D18S58的反向引物。本领域技术人员将理解的是，在以上描述中公开的构思和具体实施例可以作为改进或设计其它实施例的基础而被容易地利用，从而达到与本发明相同的目的。本领域技术人员还将理解的是这种等价的实施例没有脱离在权利要求中提到的本发明的精神和范围。权利要求1、一种用于癌症诊断的遗传标记，所述遗传标记包括从由RABGEF1、STAG、CHGB、TNFRSF14、SERPINB5、ANGPTL7、TFF2、BGLAP、MSLN、DDX53、MAGEA2、VDR、ST14、CDKN2A、MYBPC2、RUNX3、RUNX2、MLH1和PTEN组成的组中选择的一个或多个转变区，其中，RABGEF1是RAB鸟嘌呤核苷酸交换因子1；STAG是间质抗原；CHGB是嗜铬粒蛋白B；TNFRSF14是肿瘤坏死因子受体超家族14；SERPINB5是丝氨酸蛋白酶抑制因子，进化枝B，成员5；ANGPTL7是血管生成素样7；TFF2是三叶因子2；BGLAP是骨γ羧基谷氨酸蛋白；MSLN是间皮素；DDX53是DEAD盒多肽53；MAGEA2是黑色素瘤抗原家族A；VDR是维生素D受体，其中，维生素D是1，25-二羟基维生素D3；ST14是致肿瘤性抑制14；CDKN2A是周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A；MYBPC2是肌球蛋白结合蛋白C，快型；RUNX3是矮小相关转录因子3；RUNX2是矮小相关转录因子2；MLH1是MutLDNA错配修复蛋白；PTEN是10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物。2、一种用于诊断癌症和预测转移或预后的方法，所述方法包含测量转变区曱基化的步骤。3、根据权利要求2所述的方法，其中，转变区是从由RABGEF1、STAG、CHGB、TNFRSF14、SERP聽5、ANGPTL7、TFF2、BGLAP、MSLN、DDX53、MAGEA2、VDR、ST14、CDKN2A、MYBPC2、RUNX3、RUNX2、MLH1和PTEN组成的组中选4奪的一个区或多个区。4、一种用于检测转变区曱基化的引物。5、根据权利要求4所述的引物，其中，所述引物是从由SEQ.ID.NO:1NO:160表示的序列组成的组中选择的成对的正向引物和反向引物。6、一种用于癌症的诊断套组，所述诊断套组包含如权利要求4所述的引物。7、一种简单重复序列标记组，所述标记组适用于测量杂合性丟失和染色体不稳定性的等级。8、根据权利要求7所述的标记组，其中，所述标记组是从由SEQ.ID.NO:161NO:240表示的序列组成的组中选择的成对的正向引物和反向引物。9、一种用于癌症的诊断套组，所述诊断套组包含如权利要求7所述的标记组。10、根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法另外包括测量杂合性丢失等级的步骤。11、根据权利要求6所述的用于癌症的诊断套组，其中，所述诊断套组另外包括如权利要求7所述的标记组。全文摘要本发明涉及一种通过测量转变区的甲基化来诊断癌症和预测转移或预后的方法，以及一种用于检测甲基化的引物。根据本发明，理解了新的转变区，提供了一种用于检测该区域的甲基化的引物，这表明本发明通过同时测量转变区的甲基化和染色体丢失而有助于提高癌症预测的准确性和可靠性。文档编号C12Q1/68GK101490274SQ200680055233公开日2009年7月22日申请日期2006年8月19日优先权日2006年7月5日发明者柳文干,洪承辰,郑有採,金永浩申请人:生物杰诺米克斯公司;韩国加图立大学产学协力团