在酵母表达系统中增强重组外源蛋白的分泌效率的方法

专利名称：：在酵母表达系统中增强重组外源蛋白的分泌效率的方法
技术领域：
：本发明涉及在酵母表达系统中提高重组外源蛋白的分泌效率的方法。
背景技术：
：利用微生物大量产生外源蛋白是蛋白质药业中最重要的
技术领域：
。为了回收和纯化期望的产物，重组外源蛋白可被胞内表达，或者另外可被胞外分泌。胞内表达蛋白质时，蛋白质的过表达在许多情况下经常可导致蛋白质以非活性和水不可溶的形式在胞内累积，并可带来产率降低因素的各种劣势，诸如破裂固体微生物的繁琐的过程以及从存在于细胞中的各种宿主蛋白分离期望蛋白的复杂和艰难的纯化过程。然而，期望蛋白的胞外分泌可提供容易的方式来避免与前述胞内表达蛋白质相关的困难和问题。而且，由于胞外蛋白分泌仅在紧接转录过程之后蛋白质的正确折叠和修饰之后才可成功进行，所以经由胞外分泌的蛋白质产生提供了能够获得活性形式的、具有正确的三级结构的可溶蛋白这一益处。因此，可以说，在蛋白质产率以及蛋白质质量调控方面，蛋白质的胞外分泌优于重组外源蛋白的胞内累积系统。然而，在许多情况下，在采用强启动子的重组蛋白表达系统中，胞外蛋白分泌系统经常遭受相比于胞内累积系统显著低的表达和分泌水平。为了克服胞外分泌的这类劣势和问题，已经进行了许多研究，以增强蛋白质的胞外分泌收率。大多数研究集中于直接优化信号序列以有效分泌蛋白或发现新的强分泌信号序列(NucleicAcidsResSuppl.，2003(3):261-2;和BiochemCe謹ol.1993，71:401-5)。作为另一种方法，己经进行了许多研究，以通过使用分子生物学技术，经由诱导有助于蛋白质的折叠和水溶解的蛋白伴侣的过表达，促进相应于过表达重组外源蛋白时的初始限速步骤的蛋白质折叠以及防止可在蛋白的胞外分泌之前发生的不溶性沉淀，而增强期望蛋白的分泌效率(Robinson和Wittrup，5z'o&c/z.iVog".，11:171,1995;Robinsonetal.，5z'ofec/zwo/ogy,12:381-384，1994;以及Wulfing和Plukthun，Mo/.M'tro组12(5):685-692,1995)。半乳糖启动子，传统上被用于诱导外源重组蛋白在酵母中的表达，是一种利用半乳糖作为诱导物的强诱导型启动子。即使蛋白表达的强诱导对于增加外源蛋白的胞内累积或表达水平可以是有利的，这也可导致在期望胞外分泌所需蛋白质时分泌效率下降或者细胞功能异常，原因在于在分泌的早期在细胞中发生不溶性沉淀。这类事件偶尔也在重组表达系统诸如大肠杆菌(￡.co//)表达系统和酵母表达系统中观察到。为了克服这类缺点，进行了各种尝试来降低培养温度(BaneyxF.,CWr.(9;/".A/o&c/mo/.,10:411—421,1999;以及GeorgeGeorgiou禾口Pascal,Cw,t.O//".B/ofec/zw/.，7:1卯画197，1996)。然而，这类降低培养温度的方法具有与重组外源蛋白产生成本增加相关的劣势，原因在于培养期延长。因此，在本领域中对于开发能够通过调节半乳糖诱导型启动子的活性来增强重组外源蛋白的分泌效率而不降低培养温度的方法存在需求。为了这个目的，基于半乳糖诱导型启动子的活性可通过调控宿主中半乳糖的可利用度进行调节这一想法，本发明的发明人已经确认，通过使用缺乏参与半乳糖吸收的半乳糖通透酶基因的突变株，或通过经由共添加--定比例的半乳糖和调节分解代谢物阻抑的葡萄糖进行补料分批培养而培养经转化的酵母菌株，提高重组外源蛋白的分泌效率是可能的。本发明基于这些发现已经得以完成
发明内容技术问题因此，考虑上述问题而做出了本发明，并且本发明的一个目的是提供通过遗传修饰酵母宿主菌株或改变培养条件而提高重组外源蛋白在酵母表达系统中的胞外分泌效率的方法。技术方案根据本发明的一个方面，通过提供提高外源蛋白分泌效率的方法可实现上述目的和其它目的，所述方法包括步骤(a)用重组外源基因构建体转化酵母宿主以构建转化酵母菌株，所述重组外源基因构建体包含半乳糖诱导型启动子、分泌信号序列和编码所述外源蛋白的基因；和(b)在所述半乳糖诱导型启动子的活性受到调控的条件下培养所述转化酵母菌株。有益效果通过经由适度调控作为半乳糖诱导性启动子的诱导物在细胞中起作用的半乳糖的水平，降低基于半乳糖诱导型启动子的常规酵母表达系统所经历的重组外源蛋白的过表达引起的不溶性沉淀，根据本发明的提高外源蛋白分泌效率的方法可实现重组外源蛋白分泌效率的提高。因此，本发明的方法有效提高重组外源蛋白在酵母表达系统中的产率并有效降低生产成本。附图简述通过结合附图进行下面的详细描述，本发明的上述目的和其它目的、特征和其它优势将得到更清楚的理解，其中图1是示意图，其阐述了其中培养基中的半乳糖穿过酵母细胞膜并作用于外源蛋白表达诱导型启动子的过程，以及其中由葡萄糖进行的分解代谢物阻抑在细胞中发生的过程；图2是在本发明中使用的重组LK8蛋白表达载体M5LK8的切割图谱；图3是当除了C^/2基因外各自具有相同遗传背景的两种酵母宿主在作为唯一碳源的半乳糖供应的情况下进行培养时，比较随时间变化的半乳糖消耗速率的曲线图4是照片，其示出了外源基因在转化酵母菌株A中表达后，具有表达诱导期的胞内总外源蛋白的蛋白质印迹分析结果；图5是照片，其示出了转化酵母菌株A中胞内水溶性外源蛋白的蛋白质印迹分析结果；图6是照片，其示出外源基因在转化酵母菌株B中表达后，具有表达诱导期的胞内总外源蛋白的蛋白质印迹分析结果。由此可见，相比于利用具有GL^2基因的酵母菌株A作为宿主表达蛋白质，外源蛋白质的胞内不溶性累积随时间相对下降；图7是曲线图，其比较了通过补料分批培养转化酵母菌株A和B进行外源基因表达后，分泌入培养基中的重组外源蛋白的量与表达诱导期的关系曲线；禾口图8是适于在外源蛋白在酵母中表达后允许半乳糖诱导型蛋白质二硫键异构酶基因(尸D/7)进行共表达的表达载体pMPDIl的切割图谱。实施发明的最佳方式在下文中，本发明将进行更详细的描述。根据本发明提高外源蛋白的分泌效率的方法包括步骤(a)用重组外源基因构建体转化酵母宿主，所述构建体包含半乳糖诱导型启动子、分泌信号序列和编码所述外源蛋白的基因，以构建转化酵母菌株；和(b)在所述半乳糖诱导型启动子的活性受到调控的条件下培养所述转化酵母菌株。在本文中，进行步骤(a)，以用重组外源基因表达构建体转化酵母宿主。对于转化方法无特别限制。优选地，通过将重组外源基因构建体插入(或多重插入)酵母宿主的染色体或者通过将基因构建体插入酵母宿主的细胞质使得它可以以环状载体的形式存在，进行转化。基因构建体参入染色体在使用酵母的转化中被称为"整合"，而基因构建体以环状载体的形式参入酵母细胞质是指附加型表达法，其中外源基因以附加体的形式被引入，以在外源基因表达构建体插入可应用于酵母系统的载体(或质粒)之后表达和分泌外源蛋白。附加体是存在于细胞质中的环状DNA并能够独立于宿主细胞的染色体发挥遗传功能。可用于本发明的半乳糖诱导型启动子的例子可包括任何类型的启动子而无特别限制，只要其通过使用半乳糖作为诱导物在酵母系统中是功能上可操纵的。优选地，可以使用SEQIDNO:1所示的酿酒酵母(5*.cem^/ae)的04丄/启动子、SEQIDNO:2所示的酿酒酵母的04U0启动子、SEQIDN0:3所示的酿酒酵母的O4丄7启动子、或它们的组合或融合。更优选O4ZJ。分泌信号序列可以是在酵母系统中用作分泌信号或者是本领域中常规上已知的任何序列。例如，信号序列可以选自SEQIDNO:4所示的MATct信号、SEQIDNO:5所示的酿酒酵母Kl杀伤毒素信号(Brown，J.L.等,TheKlkillertoxin:molecularandgeneticapplicationstosecretionandcellsurfaceassembly.In:Johnston,J.R.Mo/ecw/。r(7e"幼'cso/y"eas^-aprac".ca/a//raac/z.Thepracticalapproachseries,1994，第217-265页；禾口Tokunaga,M.等，Way.Co/www".，144:613-619,1987)、SEQIDNO:6戶万示的酿酒酵母转化酶信号(日本未经审查专利公布1985-041488)、SEQIDNO:7所示的乳酸克鲁维酵母(i:/w，mw^ca/flc他)杀伤毒素信号(Sugisaki,Y.等，五,乂历ocAew.,141:241-245,1984)、SEQIDNO:8所示的尸/c/n'aacac/ae杀伤毒素信号(美国专利6,1,07,057)、葡萄有孢汉逊酵母(//araem'a^oram^rww)杀伤毒素信号(Radler，F.等，v^c/.M/cto^o/.,154(2):175-178,1990;和Schmitt,M.J.等，JF/to/.,68(3):1765-1772,1994)、异常毕赤酵母(汉逊酵母属)(/Vc/w》(7/"/wem/A3^"wcw"/a)杀j劳毒素《言号、及其j壬l可纟且合。此外，为了增加蛋白质或肽的分泌效率，分泌信号序列可进一步包括前肽序列，还进一步包括信号肽酶的识别位点，例如KEX1(用于杀伤表达l)或KEX2(美国专利4,929,553)。信号肽酶的识别位点的例子可包括Pro-Met-Tyr。同时，其中所述半乳糖诱导型启动子的活性受到调控的条件可以使用各种方法诸如遗传工程技术和培养技术加以建立。对建立所期望的培养条件的这类技术无特别限制，只要它可能调控半乳糖诱导型启动子的活性。优选地，半乳糖诱导型启动子的活性可通过降低半乳糖从培养基进入转化酵母菌株的转运速率加以调控。就此而论，包括基于遗传工程的菌株改造技术和培养技术在内的任何方法可被用于降低半乳糖的胞内转运速率，只要它可能降低半乳糖向细胞内的输送。例如，各种遗传工程技术可被用于使作为靶标的转化酵母半乳糖通透酶基因成为非功能性的。优选地，通过使半乳糖通透酶基因缺损或使之部分破坏从而成为非功能性的是首选的。对缺陷引入或基因破坏的方法无特别限制，只要它们旨在(部分或完全地)使半乳糖通透酶的功能失效。例如，使用本领域中常规己知的各种遗传工程技术，进行基因的缺陷(缺失)或部分(或完全)破坏。此外，可在本发明中使用的半乳糖通透酶缺陷型菌株不被特别限制。例如，酿酒酵母(Sacc/wram少c^cerev&^)BJ3501(ATCC208280)是通常已知的。优选地，在步骤a)中调节半乳糖诱导型启动子活性的条件是在细胞培养期间以一定比例向培养液共添加半乳糖和葡萄糖。对培养方法无特别限制，包括分批培养、连续培养、分批补料培养等。优选分批补料培养。此外，对半乳糖和葡萄糖的比例无特别限制，只要葡萄糖分解代谢物阻抑致使半乳糖的胞内转运得到抑制，同时半乳糖进行的诱导不受抑制。优选地，半乳糖和葡萄糖的比例在4:1至1:1的范围内。在通过用包含半乳糖诱导型启动子、分泌信号序列和编码外源蛋白的基因的重组外源基因构建体转化酵母宿主来构建转化酵母菌株中，酵母宿主优选用含有蛋白质二硫键异构酶编码基因的重组外源构建体转化，所述蛋白质二硫键异构酶编码基因在半乳糖诱导型启动子的调控下进行表达。优选地，提高外源蛋白的分泌效率的方法在步骤(a)和(b)之间进一步包括步骤(a-l):用含有在半乳糖诱导型启动子调控下表达的蛋白质二硫键异构酶编码基因的重组外源基因构建体进一步转化步骤(a)的转化酵母菌株。前述另外的步骤(a-l)是指酵母菌株用编码蛋白质二硫键异构酶的基因再转化，蛋白质二硫键异构酶对在细胞内产生的蛋白质的胞外分泌施加优异的影响。蛋白质二硫键异构酶编码基因转化酵母菌株，可以在经由用包含半乳糖诱导型启动子、分泌信号序列和编码外源蛋白的基因的重组外源基因构建体转化酵母宿主来构建转化酵母的步骤(a)之前，通过前述用蛋白质二硫键异构酶编码基因转化酵母菌株来进行，或者可以在步骤(a)之后另外通过利用蛋白质二硫键异构酶编码基因的转化酵母菌株的另外的转化步骤(a-l)来进行。可用于本发明的蛋白质二硫键异构酶编码基因不被特别限制于来自某些物种的具体序列，只要它们可进行二硫键异构化。优选地，蛋白质二硫键异构酶基因选自SEQIDNO:9所示的酿酒酵母(Tachikawa,H."a/.，乂肠c/7匿,110(2):306-313,1991)、SEQIDNO:10所示的织锦芋螺(Co謹toch7e)PD/(美国专利申请US2004/0203132Al)、SEQIDNO:11所示的线虫(C.e/egfl"s)尸D/(Page,A.P"DiVJCe〃5/o/.'16(11):1335-1343,1997)、SEQIDNO:12所示的人胰腺尸D/基因(Desilva,M.G.Wa/.,DNACe//所o/.,15(1):9-16，1997)、SEQIDNO:13所示的米曲霉(A;e/^'〃wsor;;zae)尸D/(WO95/00636)、SEQIDNO:14所示的博伊丁假丝酵母(Omfi^aZ^Ww7)尸D/(美国专利5,965,426)、SEQIDNO:15所示的特异腐质霉(/ww'co/"/rao/era)户Z)/(美国专利5,700，659)及其任何组合。编码蛋白质二硫键异构酶的基因构建体不被特别限制于具体载体或其等价物。优选的是具有图8所示的切割图谱的pMPDI。在酵母表达系统中，半乳糖诱导型启动子被广泛应用，其具有强表达强度。在细胞内存在作为诱导物的半乳糖时，半乳糖诱导型启动子被激活，然后导致基因在上述半乳糖诱导型启动子调控下进行高丰度表达。由于这类可诱导性，半乳糖诱导型启动子被用作在酵母中表达外源重组蛋白的有用手段。然而，如以前所讨论，本发明人观察到，在外源蛋白质的分泌发生之前，外源蛋白质的不可溶沉淀在表达早期在细胞中发生(见图4)。本发明人已经进行了各种广泛和深入的研究和实验来解决上述问题以及提高外源蛋白的胞外分泌。为了这个目的，基于这样的事实——由于在细胞中半乳糖的过丰度导致的半乳糖诱导型启动子过活化是外源蛋白在其分泌之前发生胞内不溶性沉淀的主要原因，本发明人进行了研究，以确认通过调控被用作半乳糖诱导型启动子的表达诱导物的半乳糖的胞内流入，重组外源蛋白的分泌效率是否得到提高。首先，经半乳糖的胞内摄取途径分析，半乳糖的胞内转化可经由各种途径发生。半乳糖转化的主要途径是半乳糖通透酶(Gal2)，其作为半乳糖操纵子的组成，在半乳糖的存在下得到表达，并表现出对半乳糖的最高亲和性。然而，甚至当宿主细胞是半乳糖通透酶(Gal2)活性缺陷时，半乳糖转运也未被完全阻断。相反，这样的Gal2-缺陷型宿主细胞可通过另外的方法实现半乳糖的胞内转运，例如通过在细胞膜上存在的各种己糖转运蛋白，例如HXT1、HXT9、HXT11和HXT14(WieczorkeR.efa/.,Le仏464(3):123-128，1999)，即使其它己糖转运蛋白对于半乳糖具有相对低的亲和性。因此，至少操纵GAL启动子所必需的最小量的半乳糖可被转运入细胞(见图1)。图1是概念图，其说明了其中在培养基中的半乳糖穿过酵母细胞膜然后作用于诱导外源蛋白表达的启动子这一过程以及其中葡萄糖在细胞中导致分解代谢物阻抑这一过程。基于在图1中所示的该图解，本发明人考虑了通过使用编码Ga12——一种主要的半乳糖转运蛋白——的基因(Ga/2)缺陷的酵母宿主来最小化半乳糖的胞内转运是可能的。为了这个目的，首先，在半乳糖诱导型启动子的调控下表达外源基因的重组外源基因构建体被引入作为宿主的、具有Ga/2基因缺陷的酿酒酵母BJ3501(ATCC208280)(下文称为"酵母宿主B")，从而构建转化酵母(下文称为"转化酵母宿主B")，并且如此转化的酵母菌株在含半乳糖的培养基中培养。之后，将在转化酵母菌株B中重组外源蛋白的分泌效率与作为宿主的另一转化酵母菌株(下文称为"转化酵母宿主A")进行比较，该另一转化酵母菌株通过不具有Gfl/2基因缺陷的正常酵母菌株(酿酒酵母2805，下文称为"酵母宿主A")的转化而获得。如图3所示，当除了G^/2基因外各自具有相同遗传背景的酵母宿主A和B在含有半乳糖作为唯一碳源的培养基中培养并且培养基中半乳糖随时间的浓度被测定并在两组之间进行比较时，确认了半乳糖进入细胞的流入速率根据GW2基因的存在/不存在而显著变化。而且，使用外源蛋白的抗体，通过蛋白质印迹分析，确认了相比于当酵母宿主A被用作外源蛋白表达的宿主时(见图4和5)，当酵母菌株B——由于C^/2基因的无操作，其半乳糖进入细胞的流入速率低——被用作外源蛋白表达的宿主时(见图6)，由外源蛋白在半乳糖诱导型启动子调控下过表达引起的外源蛋白的胞内不溶性沉淀相对下降。此外，还通过分泌入培养基中的外源蛋白的HPLC分析，确认了在外源蛋白的不溶性沉淀在实践培养条件下降低的同时，外源蛋白的胞外分泌和分泌效率的增加——本发明的最终目的——也被实现(见图7)。在本发明的一个实施方式中，即使具有半乳糖通透酶基因缺失的酵母菌株被用于降低半乳糖的胞内流入，抑制半乳糖通透酶基因功能的反义、siRNA、抗体、拮抗剂等也可被用于同一目的。对于合适地调节半乳糖的胞内可用性，本发明人已经采取了这样的策略，其中导致分解代谢物阻抑(当葡萄糖是细胞的培养基环境中的主要碳源时，促进葡萄糖利用的某些糖代谢基因的表达的抑制)的葡萄糖和用作半乳糖诱导型启动子的诱导物的半乳糖被"共给料"入分批补料培养基，以诱导两种糖的同步消耗，使得外源蛋白的过表达依靠一部分包含在培养基中的葡萄糖，由分解代谢物阻抑适当调节。图1是示意性图表，其说明了半乳糖和葡萄糖对细胞中半乳糖诱导型启动子的诱导和抑制的两种相反的作用(K.-D.Entian和H.-J.Schuller,GlucoseRepressioninYeast.In:7"eos/Swg<arMetoZ)o/&m,F.K.Zimmermann，K.-D.Entian.,eds.pp.409-434.TechnomicPublishingAG,Bassel,Switzerland1997)。就此而论，经由适于维持培养基中葡萄糖浓度低于0.1g/L的葡萄糖限制型分批补料培养，通过加入混合碳源，防止了葡萄糖对半乳糖诱导型启动子的完全抑制。本发明人将上述方法称为混合碳源补料策略。在本发明中，细胞在含有各种比例的葡萄糖/半乳糖的分批补料培养基中培养，并且对于每一种情况，人工调控外源蛋白的分泌。此外，在不同比例的葡萄糖/半乳糖下，所分泌的外源蛋白的量进行了比较，从而确认在具有不同的半乳糖转化能力的酵母宿主菌株中外源蛋白分泌所需的最适葡萄糖/半乳糖比(见下文的表1禾口2)。相比于仅使用半乳糖作为唯一碳源的常规表达诱导法，当本发明所设计的混合碳源补料方法被用于酵母宿主A和B时，每细胞的外源蛋白产率以及每诱导物的外源蛋白产率分别增加了105%(表l)和85%(表2)。此外，当前述的转化酵母菌株A和B通过应用所述混合碳源补料方法分别进行分批补料培养时，揭示了存在不同的最适葡萄糖/半乳糖浓度。具有相对高的半乳糖胞内流入和消耗速率的转化酵母菌株A对于外源蛋白的最适分泌表现出大约1:1葡萄糖/半乳糖比的混合碳源，而由于半乳糖通透酶的无操作而具有降低的半乳糖转运能力的转化酵母菌株B表现出12大约2:3的最适比的混合碳源(葡萄糖/半乳糖)，从而相比于转化酵母菌株A需要培养基中相对高比例的半乳糖(见表1和2)。结果间接证明了在使用半乳糖诱导型启动子的外源蛋白表达系统中半乳糖转运能力和混合碳源对外源蛋白表达的影响与本发明的目的很好地一致。另一方面，本发明人进行了研究，以确认通过用编码被称为蛋白质折叠助手的蛋白质二硫键异构酶的基因(PD/7)连同在半乳糖诱导型启动子调控下表达的外源基因构建体转化宿主细胞，蛋白质分泌效率是否得到提高。首先，含有SEQIDNO:9所示的酿酒酵母蛋白质二硫键异构酶基因(尸Z^)的表达载体pMPDIl被构建，并且所得到的表达载体连同外源基因构建体被分别转化入酵母宿主菌株A和B。然后，转化酵母菌株在含半乳糖的培养基中培养，并测定蛋白质分泌效率(见表3).结果，可以看出，用外源基因构建体和pMPDIl载体转化酵母宿主A相对于对照组(未参入尸D/7基因的酵母宿主A)在蛋白质分泌效率上表现出30%的增加，而使用酵母宿主B的转化相对于对照组在蛋白质分泌效率上表现出72%的增加。如上文所详细描述，根据本发明提高外源蛋白的分泌效率的方法使得能够经由适度调控细胞中作为半乳糖诱导型启动子的诱导物发挥作用的半乳糖的水平，通过降低在基于半乳糖诱导型启动子的常规酵母表达系统中遇到的外源蛋白质的过表达引起的不溶性沉淀，提高重组外源蛋白的分泌效率。因此，本发明的方法可有效地用于提高重组外源蛋白在酵母表达系统中的产率并降低生产成本。发明方式实施例现在，将参考下列实施例，更详细地描述本发明。这些实施例仅仅被提供来阐述本发明，并且不应该被解释成限制本发明的范围和精神。实施例1:在酵母宿主A和B之间胞内半乳糖转运能力的比较酵母宿主A(酿酒酵母2805，基因型M47bpep(v//^3;rW-J7.d^his3-雄0ura3-52GAL2canl,Sohn,J.H.尸亂所oc/亂，30:653-660,1995;和Kim,T.H.&a/."/ofec/2"0/.丄故.24:279-286，2002)和酵母宿主B(酿酒酵母BJ3501，基因型MATa;ep(:///513A67/nW-zl200wra_5-52ga/2ca"7，ATCC208280，USA)在YPD琼脂板上划线，并在30。C下置于培养箱中约18小时，以及分离集落。酵母宿主A和B的每一集落被接种入单独的YPG[酵母提取物1%(w/v)、蛋白胨2%(w/v)和半乳糖2%(w/v)]液体培养基并在3(TC下在培养箱中振荡培养约80小时。为了测定半乳糖随吋间的消耗，通过经由3,5-二硝基水杨酸(DNS)分析定量还原糖，测定培养基中的残留半乳糖浓度(Mohun，A.F.和Cook,I.J.,J.C//".尸fl〃w/.，15:169-180，1962,见图3)。图3是当除了Ga/2基因缺陷外各自具有相同遗传背景的两种酵母宿主在作为唯一碳源的半乳糖供应的情况下进行培养时，比较随时间变化的半乳糖消耗速率的曲线图。由图3可见，相比于其中G^/2基因正常发挥功能的酵母宿主A，GW2基因缺陷型酵母宿主B表现出每单位时间的半乳糖消耗速率下降得到了确认。实施例2:使用酵母宿主A和B构建分泌外源蛋白的酵母转化体2-1.使用酵母宿主A，构建分泌外源蛋白的酵母转化体酿酒酵母2805/M5LK8使用被本发明人用来在巴斯德毕赤酵母(/^/n'apwto&)中产生重组LK8的表达载体pMBRI-LK8(韩国专利公布特许公开2004-0069840)，进行ot-因子分泌信号和LK8cDNA的共分离。该申请通过引用以其全部内容并入本文。pMBRI-LK8载体用￡coRI处理7小时，并使用PCR纯化试剂盒(Qiagen,USA)进行洗涤。然后，该载体用万awHI处理7小时，而DNA通过凝胶电泳进行分离。使用凝胶提取试剂盒(Qiagen,USA)，获得DNA片段，其具有a-因子分泌信号SEQIDNO:4和LK8cDNA序列SEQIDNO:16。如此获得的DNA片段被插入p426GALl(ATCC87833,USA)载体的启动子和CYC1终止子之间，从而构建表达载体pMCLK8(6.9kb)，其可被用于在酵母中产生重组LK8。所产生的载体pMCLK8含有启动子，其因此允许通过半乳糖诱导蛋白表达。在酵母转化之后，使用t/W3标记作为选择标记，在选择培养基中选择转化体。之后，为了将由a-因子分泌信号序列和LK8cDNA组成的表达盒插入酵母染色体中，该表达盒被插入含有S序列和用来如下选择插入的载体的新霉素抗性基因(")的p5neo载体(Lee，F.W.和DaSilva,N.A.，^p/.M/cra&o/.B/ofec/mo/.，48:339，1997)，以便确保期望的基因可被插入5序列——位于酵母染色体中的转座元件之首先，分别使用切割启动子和Crc7终止子两端的限制酶&cI禾口X/wI，由pMCLK8载体分离LK8表达盒。在本文中，由于LK8表达盒和pSneo载体的序列都含有5"a/1限制性位点并且在pSneo载体上存在的SWI限制性位点基本上是将该载体整合入酵母染色体所必需的，所以DNA平端试剂盒(DNAbluntingkit(Takara，Japan))被用来除去在LK8表达盒上存在的1限制性位点。另一方面，因为p5neo载体不含有I限制性位点，上述的DNA平端试剂盒被用来将pSneo载体的I限制性位点和分离的LK8表达盒的Xp/7I限制性位点都转化成平端。然后，如此平端化的LK8表达盒和p5neo载体用连接酶连接，以构建重组载体，其被命名为M5LK8重组表达载体(图2)。图2是用于本发明的重组LK8蛋白表达载体的切割图谱。.之后，使用AlkaliCationYeastTransformationKit(Q-BIOgene，Canada)，用上述重组M5LK8表达载体转化酿酒酵母2805(Sohn，J.H."a/.Proc.5/oc/化附.，30:653-660,1995;禾口Kim，T.H.&a/"历0,ec/2w0/.丄e仏，24:279-286,2002)。使用含有抗生素G418硫酸盐(antibioticG418sulfate)的YPD板[2%(w/v)蛋白胨、1%(w/v)酵母提取物、2。/。(w/v)葡萄糖和2%(w/v)琼脂]，选择用M5LK8重组表达载体转化酵母菌株。G418硫酸盐的浓度被分别调节到5g/L、10g/L和15g/L，从而选择最高抗生素抗性的酵母菌株，其被命名为酿酒酵母2805/M5LK8。在下文中，为了简洁和方便，该酵母菌株将被称为"转化酵母A"。2-2:使用酵母宿主B，构建分泌外源蛋白的酵母转化体酿酒酵母BJ3501扁LK8根据如实施例2-1相同的方式，酿酒酵母BJ3501(ATCC208280,USA)——除了(^4丄2基因缺陷外其具有与酿酒酵母2805相同的基因型——用实施例2-l中构建的重组表达载体MSLK8进行转化。然后，进行集落筛选，以选择具有最高分泌效率的克隆，其最终被命名为酿酒酵母BJ3501/MSLK8#36，并保藏于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(KRIBB，Daejon，Korea),保藏号为KCTC10582BP(保藏于2004年1月13日)。在下文，为了简洁和方便起见，该转化体菌株将被称为"转化酵母菌株B"。实施例3:使用半乳糖作为碳源，比较在分批补料培养中转化酵母菌株A和B的外源蛋白分泌能力在使用半乳糖分批补料培养实施例2中的酵母转化体A和B的情况下，进行下列的分析，以比较外源蛋白的分泌效率。首先，作为主种子的转化酵母菌株在1至3vvm的空气和200至1000rpm下，在添加有2%(w/v)葡萄糖的YPD[酵母提取物1%(w/v)和蛋白胨2%(w/v)]培养基中进行种子培养24小时，使得可以获得期望的细胞量和活性(20-倍稀释，00600=0.8至1.2)。在YPD培养基中进行种子培养之后，种子培养溶液被接种入起始培养基。首先，分批培养阶段是细胞生长期以及对被用作外源蛋白LK8的表达诱导物的半乳糖的适应期。为了这个目的，细胞被给予半乳糖适应期，同时通过接种超过1%(v/v)的种子培养溶液和供应作为碳源的葡萄糖和半乳糖，使得细胞发生增殖。在本文中，起始培养基由2n/。(w/v)葡萄糖、3%(w/v)半乳糖、4。/。(w/v)酵母提取物、0.5。/。(w/v)酪蛋白氨基酸、0.5g/L尿嘧啶和0.5g/L组氨酸组成。在分批培养阶段，供应给起始培养基的碳源耗尽后，细胞的呼吸作用(氧消耗)下降，这通过由提供于发酵器上溶解氧探针表征的溶解氧水平的急剧增加而得到确认。从该时间点，使用DO-stat补料策略，加入含有半乳糖作为唯一碳源的培养基，进行分批补料培养。进行该分批补料培养，以进一步增加细胞浓度，并进一步持续维持外源蛋白的表达诱导期，从而提高外源蛋白的产率。具体而言，由50。/。(w/v)半乳糖、30g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、1g/L尿嘧啶和2g/L组氨酸组成的分批补料培养基被使用(分批补料培养基I)。为了诱导外源蛋白LK8的高水平分泌，通过以1mL/h至30mL/h的速率补给半乳糖，在培养基中残留半乳糖的量被维持在5%(w/v)以下。通过测定培养基中半乳糖的残留浓度并基于如此得到的值加入合适量的半乳糖从而维持残留半乳糖的水平在合适的值，进行半乳糖补料。通过调控半乳糖的添加，LK8的表达和分泌可以被持续增强，同时在整个期中维持发酵器中残留半乳糖的浓度在5%(w/v)以下。分批补料培养法在相同培养条件下被应用于在实施例2构建的转化酵母菌株A和B，并且，在两个酵母组之间就酵母的半乳糖转运能力方面比较外源蛋白的表达和分泌曲线。首先，为了比较在酵母细胞中累积的外源蛋白的分布曲线，对在给定培养时间点下从两组酵母组收集的培养样品进行使用抗-LK8抗体的蛋白质印迹分析。为了这个目的，在培养期间周期性收集的每一转化酵母菌株被调节至相同的量，在相同体积的样品缓冲液中煮沸，并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，以展开胞内蛋白质。如此展开的蛋白质被转移至硝化纤维素膜。为了进行印迹，硝化纤维素膜被放入添加了含有0.1%(v/v)Tween2(f和5%(w/v)脱脂乳的PBS缓冲液的溶液，其在室温下温和搅拌2小时。之后，将兔抗LK8Ab加至同一溶液，然后该溶液在室温下温和搅拌1小时，并用含有0.1%(v/v)Tween20@的PBS缓冲液重复洗涤五次。接下来，抗兔IgG-HRP(抗兔IgG-辣根过氧化物酶，Sigma，USA)被加入添加了含有0.1%(v/v)Tween2(f和5%(w/v)脱脂乳的PBS缓冲液的溶液，并且如此处理的硝化纤维素膜被浸入其中抗兔IgG-HRP被加入的溶液中，并在室温下温和搅拌1小时。然后，膜用含有0.1。/c)(v/v)Tween2(f的PBS缓冲液重复洗涤五次。取出膜，并使其在加入检测溶液的化学发光检测试剂盒(SuperSignalTMWestPicokit,Pierce,USA)中经历发光反应，并固定在感光膜上。检查膜上的阴影(见图4、5和6)。图4是照片，其示出了外源基因在转化酵母菌株A中表达后，具有表达诱导期的胞内总外源蛋白的蛋白质印迹分析结果；图5是照片，其示出了转化酵母菌株A中胞内水溶性外源蛋白的蛋白质印迹分析结果；以及图6是照片，其示出外源基因在转化酵母菌株B中表达后，具有表达诱导期的胞内总外源蛋白的蛋白质印迹分析结果。如图4中所示，可以看出，当半乳糖转运能力由于04丄2基因的正常操作而处于正常时，诱导外源基因表达的分批补料培养的持续导致了较高的外源蛋白胞内累积。然而，如图5中所示，可以看出，当蛋白质印迹仅进行来分析细胞中的水溶性蛋白质时，外源蛋白质随着时间的过去主要是17不可溶蛋白质的形式，而不是可溶蛋白质的形式。另一方面，如图6所示，可以看出，由于基因缺陷而具有降低的半乳糖转运能力的酵母菌株B在表达期内表现出外源蛋白的胞内累积下降。为了确认图6的结果是由于具有(^/2基因缺陷的转化酵母菌株B中外源蛋白的分泌效率增加所致，还是由于蛋白质表达水平的总体下降所致，在实施例2中构建的转化酵母菌株A和B在相同的培养条件下进行分批补料培养，并且对细胞培养物进行高效液相色谱(HPLC)分析，以量化分泌的外源蛋白。首先，离心细胞培养物，并通过0.2，的过滤器过滤所得到的上清液。然后，在HPLC中在214nm的波长下，使100W的过滤样品经历吸光度(OD)测定。通过反相分离柱(VydacTMc18柱，GraceVydac,USA)，使用展开剂"~例如含1%(w/v)三氟乙酸(TCA)的乙腈和含1%(w/v)TCA的水^作为流动相，分离外源蛋白LK8。在本文中，流动相由从25%(Wv)开始至40%(v/v)的乙腈梯度组成，从而能够利用疏水相互作用分离具有单峰的纯外源蛋白质。此外，在通过二辛可宁酸(bicinchoninicacid,BCA)分析测定作为标准物的高纯度外源蛋白后，可以获得HPLC中的面积积分以及外源蛋白浓度的校准曲线。使用如此得到的校准曲线，使该无细胞培养上清液进行HPLC分析，从而计算积分面积，并且所得到的值被应用于使用标准样品(LK8)的校准曲线，从而量化培养上清液中的外源蛋白(图7)。图7是曲线图，其比较了通过补料分批培养转化酵母菌株A和B进行外源基因表达后，在表达诱导期内分泌入培养基中的重组外源蛋白的量。在该曲线图中，实心圆(-i)表示在转化酵母菌株A(酿酒酵母2805/M5LK8)中重组外源蛋白的胞外分泌，而空心正方形(-口-)表示转化酵母菌株B(酿酒酵母BJ3501/M5LK8)中重组外源蛋白的胞外分泌。如图7所示，可以看出，相比于半乳糖转运功能正常的转化酵母菌株A的蛋白质胞外分泌，半乳糖转运降低的转化酵母菌株B的蛋白质胞外分泌表现出2倍以上的增加。实施例4:混合碳源补料对转化酵母菌株A中半乳糖诱导型启动子活性阻抑的影响以及外源蛋白分泌收率的比较储存于-70。C下的实施例2-1的转化酵母菌株A以5至10%(v/v)的浓度接种在10mLYPD培养基上，并在30。C和180rpm下在振荡培养箱中进行种子培养24小时(第一种子培养期)。然后，培养的细胞在200mLYPD培养基中传代，并在相同的培养条件下进行种子培养24小时(第二种子培养期)。在由4。/。(w/v)酵母提取物、3%(w/v)酪蛋白氨基酸、0.05%(w/v)组氨酸、0.05%(w/v)尿嘧啶、2%(w/v)葡萄糖和3。/。(w/v)半乳糖组成的培养基中进行分批培养，同时分别调节培养条件至30°C、600rpm和pH5.0。通过根据溶解氧的量改变搅拌器的速度，调控所述分批培养。在分批培养的后期，溶解氧下降，原因在于细胞呼吸旺盛。为了防止溶解氧的下降，调控空气供应和搅拌速度，以使溶解氧保持高于最大溶解氧的40%，直至分批培养完成。之后，在由3%(w/v)酵母提取物(Difco，USA)、2%(w/v)蛋白胨(Difco，USA)、0.2%(w/v)组氨酸(Sigma,USA)和0.1%(w/v)尿嘧啶(Sigma,USA)组成的培养基中进行分批补料培养。作为对照组，半乳糖的浓度被调节至50。/。(w/v)。对于葡萄糖和半乳糖之比为l:4的实验组，葡萄糖和半乳糖被分别加至10%(w/v)葡萄糖和40。/。(w/v)半乳糖的浓度。对于葡萄糖和半乳糖之比为1:1的实验组，葡萄糖和半乳糖被分别加至25。/。(w/v)葡萄糖和25%(w/v)半乳糖的浓度。对于葡萄糖和半乳糖之比为4:1的实验组，葡萄糖和半乳糖被分别加至40%(w/v)葡萄糖和10%(w/v)半乳糖的浓度。通过调控液体培养基的供应速度以确保溶解氧被维持在最大溶解氧的20至80%的水平、培养基中剩余总还原糖(半乳糖+葡萄糖)的浓度被维持在0.5至5%(w/v)的水平以及葡萄糖浓度被维持在0.1g/L以下，进行分批补料培养。在分批培养和分批补料培养期间，样品被定期收集，并进行在600nm处的OD测定、碳源测定和分泌外源蛋白(LK8)的量化(表l)。通过测量培养基中葡萄糖和半乳糖的残留量，进行碳源测定。首先，通过使用葡萄糖分析试剂盒(Glucose-EKit,目录号BC103-E，Young-DongPharm.,Seoul,Korea)的酶促方法，如下进行葡萄糖浓度的测定。收集的样品在12,000ipm下离心，并取出所得到的上清液。混合包含在使用所述酶促法的上述分析试剂盒中的lOOmL稀释的PGO酶粉(过氧化物酶10011+葡萄糖氧化酶500U)、以及100mL的缓冲液，以制备显色试剂。20W的葡萄糖标准样品被加入3mL的显色试剂。根据如上所述的相同方法，20W的分析样品也被加入该显色试剂。所得到的混合物在37C下反应5min，并在505nm的波长下测定每一样品的吸光度(OD)。葡萄糖标准样品和分析样品的吸光度值被应用于给定的方程，并计算培养基中残留葡萄糖的量。通过测量总还原当量的DNS(3，5-二硝基水杨酸)分析，测定培养基中的总碳源。葡萄糖和半乳糖都是还原糖，并对相同当量的DNS显色试剂都表现出相同的应答。100W的分析样品被加至1mL的DNS试剂，其中基于总共300mL的该DNS试剂，2M氢氧化钠、0.25g3，5-二硝基水杨酸和75g酒石酸钠钾被加入。随后煮沸该混合物约5分钟，并测量550nm下的吸光度，以测定培养基中剩余的总碳源。以与实施例3中相同的方式，通过HPLC分析，测定分泌入培养基中的外源蛋白的量。表l在不同比例的半乳糖和葡萄糖下分批补料培养转化酵母菌株A后的每细胞产率和每诱导物产率培养基中葡萄糖:半乳糖消耗的总分泌的细胞生长Yp/i1)Yp/x2)的重量比半乳糖LK8(OD600)(mg/g)(mg/L/OD)(g)(mg/L)对照(仅半乳糖)2701001200.370.831:42001141000.571,141:1190」150880.791.704:17844770.560.57"Yp/i:每诱导物产率(诱导物产率)，单位每表达诱导物(半乳糖)的分泌外源蛋白量2)Yp/x:每细胞产率(产品产率)，单位每细胞的分泌外源蛋白量当在完成分批培养之后在仅半乳糖作为碳源的情况下以及在具有不同比例的半乳糖和葡萄糖的情况下进行分批补料培养时，分别比较细胞生长、碳源消耗和外源蛋白分泌。如表1所示，相比于其它实验组，仅使用半乳糖作为唯一碳源的分批补料培养表现出可达约100mg/L的浓度的外源蛋白(LK8)胞外分泌，并显示出最高的细胞生长(OD600=120)。当细胞在1:4的葡萄糖和半乳糖下分批补料培养时，外源蛋白的分泌表现出可达114mg/L的水平，而每添加的表达诱导物(半乳糖)的外源蛋白分泌增加40%。添加的葡萄糖在进行分批培养的24小时内被完全消耗，并且在分批补料培养期间加入的葡萄糖也被立即消耗，以保持0.1g/L以下的残留浓度。相比于其它实验组，经在1:1的葡萄糖和半乳糖下分批补料培养，LK8的分泌显示出可达约150mg/L的最大值。此夕卜，确认了相比于对照组，胞外分泌增加50%，并且每细胞产率(Yp/x:mg/L/OD纖)和每诱导物产率(Yp/i，mg/g)分别增加104%和114%，从而确认了外源蛋白分泌效率的增加。经在4:1的葡萄糖和半乳糖下分批补料培养，外源蛋白的表达和分泌受到抑制，原因在于高比例的葡萄糖，从而仅表现出约44mg/L的最大分泌。实施例5:混合碳源补料对转化酵母菌株B中半乳糖诱导型启动子活性阻抑的影响以及外源蛋白分泌收率的比较除了实施例2-2中构建的转化酵母菌株B被用作菌株之外，分别比较当在仅半乳糖作为碳源的情况下以及在具有不同比例的半乳糖和葡萄糖的情况下进行转化酵母菌株B的分批补料培养时，细胞生长、碳源消耗和外源蛋白分泌(见表2)。表2在不同比例的半乳糖和葡萄糖下分批补料培养转化酵母菌株B后的每细胞产率和每诱导物产率<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>"Yp/i:每诱导物产率(诱导物产率)，单位每表达诱导物(半乳糖)的分泌外源蛋白量2)Yp/x:每细胞产率(产品产率)，单位每细胞的分泌外源蛋白量如表2所示，仅使用半乳糖作为唯一碳源的分批补料培养表现出约250mg/L的浓度的外源蛋白(LK8)胞外分泌。当在1:4的葡萄糖和半乳糖下进行分批补料培养时，外源蛋白的分泌表现出可达300mg/L的水平。此外，葡萄糖在进行分批培养的24小时内被完全消耗，并且在分批补料培养期间加入的葡萄糖也被立即消耗。经在2:3的葡萄糖和半乳糖下分批补料培养，LK8的最大分泌出现在160小吋的时间点，并且反应细胞生长的吸光度为OD6。(^47。与糖累积有关，还确认了葡萄糖和半乳糖都被用作碳源。外源蛋白的最大分泌量是约350mg/L，从而表明达到该最大分泌量的时间相比于其它实验组最短。此夕卜，确认了相比于对照组，外源蛋白分泌增加40%，并且每细胞产率(Yp/x:mg/L/OD6o。)和每诱导物产率(Yp/i,mg/g)分别增加293%和85%，从而确认了外源蛋白分泌效率的显著增加。相比于其它实验组，经在1:1的葡萄糖和半乳糖下分批补料培养，细胞生长最活跃。此外，LK8的分泌量显示出显著高的可达约350mg/L的值。然而，经与显示出相似的最大分泌量、使用2:3的葡萄糖和半乳糖的实验比较，使用1:1的葡萄糖和半乳糖的实验经过大约380小时来达到350mg/L的分泌量，这表明需要大约2.5-倍长的培养期来达到外源蛋白的同一最大分泌水平。经在3:2的葡萄糖和半乳糖下分批补料培养，细胞生长相对高，而糖消耗也活跃。然而，外源蛋白的表达和分泌受到抑制，原因在于高比例的葡萄糖，从而仅表现出约140mg/L的最大分泌。实施例6:在酵母菌株A和B中经由P2>/7基因的过表达来增加外源蛋白的分泌效率6-1.PD/7-共表达菌株的构建6-1-1.尸D/7表达载体的构建为了确保可通过半乳糖诱导表达蛋白质二硫键异构酶(PDI)，根据下列方法，编码蛋白质二硫键异构酶的尸D/7基因被插入含有a4U0启动子的表达载体首先，为了除去2p酵母复制原点，用M""I和S加BI切割pESC-URA(Stratagene,USA),并用DNA聚合酶(Klenow片段，NewEnglandBiolabs，USA)处理，从而使所得到的5.9-kb平末端DNA片段再连接，以获得优化的载体pMK71。使用得到的载体pMK71、作为模板的酿酒酵母2805-衍生染色体、以及两个引物PDI1F:5'-ATAAGAATGCGGCCGCCATACATCTATCCCGTTATGAAG-3'(SEQIDNO:17)禾口PDI1R:5'國GGACTAGTTTACAATTCATCGTGAATGGCATC-3'(SEQIDNO:18)，进行PCR，以获得含有尸D/7基因的1.7-kbDNA片段，所述尸Z)//基因具有M/IA尔eI限制性切割位点并如SEQIDNO:9所示。然后，线性化的pMK71和1.7-kbDNA片段分别用MfI和I切割，而切割的产物互相连接，以构建尸D/7基因表达载体，其被命名为pMPDIl(图8)。图8是pMPDIl表达载体的切割图谱，所述pMPDIl表达载体适于在外源蛋白在酵母中表达后允许通过半乳糖进行蛋白质二硫键异构酶(尸D/"共表达。6-1-2.PZ)/7-共表达LK8生产菌株的构建转化酵母菌株A和B分别用在实施例6-1-1中构建的载体pMPDIl转化。"f吏用AlkaliCationYeastTransformationKit(Q-BIOgene,Canada),禾艮据生产商的说明，进行转化。如此转化酵母菌株分别被称为酿酒酵母2805/MSLK8/PDI和酿酒酵母BJ3501/MSLK8/PDI。6-2.尸￡>/7对外源蛋白分泌的共表达效应以及酵母菌株A和B之间的比较为了比较基因对外源蛋白分泌的共表达效应，转化酵母菌株A和B以及pMPDIl-转化酵母菌株A和B(酿酒酵母2805/M5LK8/PDI和酿酒酵母BJ3501/M5LK8/PDI)在-7(TC储藏下取出，然后以与实施例3相同的方式进行分批补料培养，以诱导外源蛋白质的表达和分泌(见表3)。表3在存在或不存在P"i7基因共表达的情况下，在转化酵母菌株A和B中外源蛋白的最大胞外分泌之比较<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>"对照无PD/;的共表达由表3可见，酿酒酵母2805/M5LK8表现出100mg/L的LK8分泌，而酿酒酵母2805/M5LK8/尸Di7表现出130mg/L的LK8分泌，因此表明，在酿酒酵母2805/M5LK8/尸D/7中实现了更高的外源蛋白分泌。此外，另一酵母菌株酿酒酵母BJ3501/M5LK8表现出250mg/L的LK8分泌，而酿酒酵母8)3501/1^31^8/尸1)//表现出43011^/1^的1^8分泌，从而进一歩表明在具有尸D/7共表达的酵母菌株中，外源蛋白的分泌更高。也就是说，在两种不同的菌株，具有户D//共表达的酵母菌株表现出比无尸D//共表达的酵母菌株更高的LK8分泌量。尽管为了说明的目的，已经公开了本发明的优选实施方式，但本领域普通技术人员将理解，不背离如所附权利要求所公开的发明的范围和精神，各种变化、添加和替换是可能的。序列表序列表以电子形式附上24<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>权利要求1.一种提高外源蛋白的分泌效率的方法，其包括步骤(a)用重组外源基因构建体转化酵母宿主，所述构建体包含半乳糖诱导型启动子、分泌信号序列和编码外源蛋白的基因，以构建转化酵母菌株；和(b)在所述半乳糖诱导型启动子的活性受到调控的条件下培养所述转化酵母菌株。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过将重组外源基因构建体插入所述酵母宿主的染色体或者通过将所述重组外源基因构建体以环状载体的形式引入所述酵母宿主的细胞质，进行步骤(a)的所述转化。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述半乳糖诱导型启动子是SEQIDNO:1所示的启动子、SEQIDNO:2所示的G14丄川启动子、或SEQIDNO:3所示的04丄7启动子。4.根据权利要求1所述的方法，其中通过降低半乳糖从培养基进入所述转化酵母菌株的转运速率对步骤(b)中所述半乳糖诱导型启动子活性进行调控。5.根据权利要求4所述的方法，其中通过使所述转化酵母的半乳糖通透酶基因缺陷或部分破坏从而使其成为非功能性的来降低半乳糖从培养基进入所述转化酵母菌株的转运速率。6.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中所述半乳糖诱导型启动子的活性受到调控的条件是在培养时向所述培养基以给定比例共添加半乳糖和葡萄糖。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述培养通过分批补料培养进行。8.根据权利要求6所述的方法，其中所述半乳糖和葡萄糖的比例在4:1至1:1的范围内。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述酵母宿主用重组外源基因构建体转化，所述重组外源基因构建体含有在半乳糖诱导型启动子的调控下表达的蛋白质二硫键异构酶编码基因。10.根据权利要求1所述的方法，进一步在步骤(a)和(b)之间包括步骤(a-l):用含有在半乳糖诱导型启动子的调控下表达的蛋白质二硫键异构酶编码基因的重组外源基因构建体进一步转化步骤(a)的转化酵母菌株。11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述含有编码蛋白质二硫键异构酶的基因的构建体是具有图8所示的切割图谱的pMPDI。全文摘要提供了提高重组外源蛋白在酵母表达系统中的分泌效率的方法。该方法包括用重组外源基因构建体转化酵母宿主以构建转化的酵母菌株，所述重组外源基因构建体包含半乳糖诱导型启动子、分泌信号序列和编码所述外源蛋白的基因；和在所述半乳糖诱导型启动子的活性受到调控的条件下培养所述转化酵母菌株。通过经由适度调控作为半乳糖诱导性启动子的诱导物在细胞中起作用的半乳糖的水平，降低基于半乳糖诱导型启动子的常规酵母表达系统所经历的重组外源蛋白的过表达引起的不溶性沉淀，可以实现重组外源蛋白分泌效率的提高。由于重组外源蛋白分泌效率的提高，本发明有助于提高重组外源蛋白在酵母表达系统中的产率以及降低生产成本。文档编号C12N15/10GK101473035SQ200680055047公开日2009年7月1日申请日期2006年6月20日优先权日2006年6月20日发明者林滢权,金圣根申请人:财团法人牧岩生命工学研究所