专利名称：新的破囊壶菌kjs-1、聚酵素芽孢杆菌kjs-2以及包含它们的鱼饲料添加剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及新樣i生物破嚢壶菌(7Tzraws/oc/^Www s/x)KJS-1和聚酵素芽孢杆菌(5flc/〃tw; o/少/erme""c^)KJS-2,以及包含所述新孩i生物和地衣芽孢杆菌(Bflc/〃w //c/zem/orm/力的渔业水产飼料添加剂。
背景技术：
渔业水产詞料添加剂业已用于多种用途，包括提供鱼类细菌抗性和渔业卫生的防治。同样，报道了施用DHA(二十二碳六烯酸)的浮游生物用于提供DHA给鱼类。已养殖卤虫或轮虫作为鱼类尤其是鱼苗的水产饲料。
当鱼类缺乏DHA(—种必需的营养成分)时，已知它们会患上生长停滞和免疫缺陷的疾病。因此，水产祠料中缺乏DHA导致水产养殖鱼类劣化。 一般地，通过从金枪鱼眼或鱿鱼皮中抽提获得用于水产饲料的DHA,并且该DHA被非强制性选择地加工用作々司泮牛i^力口剂。
韩国专利第10-338193号披露了裂殖壶菌CSc/2/zoc/y浙/wm s; .)S兀-2用于提供DHA作为饲料添加剂。该新微生物裂殖壶菌(一种真核生物)被提供作为轮虫饲料，然后饲养轮虫并用于提供DHA给水产养殖鱼苗。第6,566,123号美国专利披露了 一种在低氯化物浓度
发明内容
本发明的一个目的是提供产生高DHA含量的新微生物破囊壶菌KJS-1和对广谱细菌具高抑制活性的新微生物聚酵素芽孢杆菌KJS-2。
本发明的另一个目的是提供一种渔业水产伺料添加剂，其能提供必需的营养成分DHA给鱼类并显示抗细菌和抗真菌活性，从而阻止细菌或真菌病引起的鱼类大量死亡。
根据本发明的一个方面，提供了 一种产生二十二碳六烯酸(DHA)的，保藏于韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms)(KCCM)，保藏编号为KCCM 10667P的新微生物破嚢壶菌(TTznawWoc/^^v.wm s/ .)KJS誦1 。
根据本发明的另 一个方面，提供了 一种具有抗细菌和抗真菌活性的，保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM),保藏编号为KCCM10769P的新微生物聚酵素芽孢杆菌(5ac/〃w ; 0/3;/wme""cw力KJS墨2。
根据本发明的又一个方面，提供了 一种渔业水产饲料添加剂，包含以预定重量比存在的冻干的破囊壶菌KJS-1 、冻干的聚酵素芽孢杆菌KJS-2和难干的地衣芽孢杆菌的混合物。
在 一 个优选的变型中，混合物由5:1:2.6重量比的冻干的破嚢壶菌KJS-l:冻干的聚酵素芽孢杆菌KJS-2:冻干的地衣芽孢杆菌组成。
在另一个优选的变型中，冻干的聚酵素芽孢杆菌KJS-2和冻干的地衣芽孢杆菌各自每克包含1x10'g个菌体，以及冻干的破囊壶菌KJS-1每克包含77 mg 二十二碳六烯酸(DHA)。
包含本发明新微生物破嚢壶菌KJS-1和聚酵素芽孢杆菌KJS-2以及地衣芽孢杆菌的混合物的根据本发明的渔业水产祠料添加剂不仅提供给鱼类必需的营养成分，而且显示抗细菌和抗真菌活性，从而防止养殖鱼类因疾病而死亡。
图1是新的海洋微藻破嚢壶菌KJS-1的系统发生图。
图2显示了新微生物聚酵素芽孢杆菌KJS-2的16S rRNA的碱基序列，以及三个同种(AY9473、 DQ597146和BS)的16S rRNA
的碱基序列。
图3是新的聚酵素芽孢杆菌KJS-2的系统发生图。
图4是破囊壶菌KJS-1的生长曲线。
图5是聚酵素芽孢杆菌KJS-2的生长曲线。
图6是地衣芽孢杆菌的生长曲线。
图7显示了其中破嚢壶菌KJS-1的生长收率对温度和盐浓度作图的线图。
具体实施例方式
本发明人深入研究发现了存在于韩国海洋南部的新微生物，其能产生不饱和脂肪酸。在这些微生物中，选定一种高产不饱和脂肪酸的微生物。通过遗传分析确定了其分类。18SrRNA分析显示该新微生物属于破嚢壶菌(一种微藻)。该新微藻被命名为破嚢壶菌KJS-1(以下简称'T-1，)并于2005年8月IO日保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏编号为KCCM 10667P。
可按如下抽提并定量分析微藻T-l产生的胞内DHA。首先，在105。C下干燥固体样品3小时，然后添加10 ml抽提溶剂到1 g样品中。2:1的氯仿曱醇混合物用作抽提溶剂。将所得到的溶液真空浓缩，用5 ml的3.4%盐酸和曱醇酯化浓缩物。用20ml己火克抽提，继之以真空浓缩。将溶于2 ml乙醇的浓缩物溶液用作样品用于气相色谱分析。结果，查明微藻T-l胞内DHA含量平均为其 干重的7.7%。为了该分析，在含有l升海水、lg酵母抽提物、 0,5 g聚胨和50 g葡萄糖，pH为6~6.5的培养基中于25 。C以45 rpm 搅拌培养微藻72小时。使用结晶紫染色观察到了真核细胞所特有 的具区别性的细胞核。由于施于营养时微藻T-l在尺寸和形态学 上具有变化，因此其难以与一般细菌相区分。然而，当其被染色 时，在显微镜下微藻T-1明显不同于细菌。冻干的T-1释放出録 鱼气味，据信对鱼类具有吸引力。
在37。C下于肉汤中培养的聚酵素芽孢杆菌(以下简称'BP-1，)
作为饲料添加剂的应用披露于授予本发明人的韩国专利第 10-458487号中。根据该专利，使乳酸杆菌发酵并以孢子形式饲喂 动物。
此外，本发明人发现了一种新的聚酵素芽孢杆菌，其对细菌 具有高活性且能与用于本发明中的其他两种微生物共生。该新微 生物被命名为聚酵素芽孢杆菌KJS-2(以下简称'BP-2，)并于2005 年8月16日保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM),保藏编号为 KCCM 10769P。观察BP-1和BP-2，发现彼此在菌落形态上具有 区别。BP-1菌落具有特有的扩散外观并呈浅黄色，而BP-2菌落 则是透明、呈圓形且较BP-1颜色稍深。BP-2具有36.9 min的增 代时间，较显示47 min增代时间的BP-1生长得更快。地衣芽孢 杆菌(以下简称"BL，，)具有32 min的增代时间，短于BPJ(参见 图5和图6)。 BP-2和BP-1具有类似的抗细菌活性谱。然而，BP-2 显示针对才各氏乳；求菌(丄actococc"s gwv/eae)的抑制活性，{旦BP -1无该 活性。
BL与这两种根据本发明的新细菌细胞系共生，显示抗细菌活 性特别是针对BP-2无法抑制其生长的海洋病原体。因此，组合使用BL和BP-2扩展了抗细菌活性范围，从而具有巨大的商业价值。 BL容易发现于可食用的发酵大豆中并且广泛地用作产生蛋白酶 的宿主。在韩国，该乳酸杆菌在市场上以"Jung Jang Sang"商标名 (A Ju Pharmaceuticals, Korea制造)流通，作为肠健康药物。根据诸多韩 国研究报告，用BL制备的发酵大豆具有有益健康的降血压活性。
可按照一般培养方法培养BP-2和BL。用于这些细菌的培养 基包含3%葡萄糖、1%水溶性葡萄糖、3。/。蛋白胨和矿物M9。矿物 M9由0.002%硫酸铁、0.002%硫酸锌、0.001%硫酸铜、0.002%硫 酸锰、0.03%硫酸镁、0.2%硫酸铵、0.1%氯化钓、3%磷酸氢二钾 和3%磷酸二氬钾组成。在该培养基中，BP-2和BL均在37°C下以 200 rpm搅拌培养65小时。进行冷冻干燥以旨在稳定地贮藏它们。
在本发明中，将能共生且扩宽抗细菌活性谱的BP-2和BL与 富含DHA的海洋微藻T-l组合用于渔业水产伺料添加剂。
根据下列实施例可获得对本发明的更好理解，所列实施例旨 在举例说明，不被认为是对本发明的限制。
在下列实施例中，将提供BP-2和BL每种细胞系的特性和共 生关系以及抗细菌活性的试验数据。在韩国统营Sebo Fisheries进行 现场试验。
实施例1
在每升海水包含1 g酵母抽提物、0.5 g聚胨和50 g葡萄糖， pH为6 6.5的培养基中以45 rpm搅拌培养T-l 72小时。在不同 的温度下进行培养以确定最适温度。当在25。C下培养时，T-l生 长最佳，因为其冻千物质为每升8g。由于T-l是一种海洋微生物， 因此盐浓度是决定其生长的一个重要因素。尽管海水具有3%(海 水浓度IOO)的盐浓度，但T-l在从1.5%(海水浓度50)到6%(海水 浓度200)的盐浓度范围内均同样生长良好，每升产生约8 g的冻干物质。冻干的T-l呈浅黄色，释放出类似于S是鱼的特殊气味。
为了测定T-l的DNA含量，在有机溶剂中对冻干物质进行初步抽 提，然后用曱醇酯化。用己烷进行二次抽提，然后进行真空浓缩。 将浓缩物溶解于乙醇中并用于气相色谱分析。发现冻干的T-l的 DHA含量平均为7.7%。 实施例2
在包含3%葡萄糖、1%水溶性淀粉、3%蛋白胨和矿物M9的 典型培养基中分别培养BP-2和BL。该矿物M9包含0.002%硫酸 亚铁、0.002%硫酸锌、0.001%硫酸铜、0.002%硫酸锰、0.03%硫酸 镁、0.03%硫酸铵、0.1%氯化钾、3%磷酸二氢钾和3%磷酸氬二钾。 它们在37。C下以200 rpm搅拌培养65小时，然后冻干。每种冻干 细菌的质量为2.2-2.31 g。
实施例3
检测新微生物BP-2和BL的抗细菌活性。在浸没于其中已培 养了 BP-2或BL的胰酶解酪蛋白大豆肉汤之后，用无菌线环划一 条横跨胰酶解酪蛋白大豆琼脂(TSA)的线，然后温育16小时。将 10 ml含500^1海洋有害微生物的TSA培养基倒在琼脂上并在室温 下固化，然后温育过夜。由于BP-2或BL产生的代谢物抑制了有 害微生物的生长，因此可用肉眼观察到BP-2和BL的抗细菌活性。 详细结果如下。
BP-2和BL均显示针对聚团屈挠杆菌(Ftec/Z)flc^" Zm"w犯s)、格 氏乳球菌(丄actococcw5 gflrv/e—、 奥氏弧菌onia〃/)和创伤弧菌 (m〃'o vw/w折cw力的高4中制活性。4十3于海月豕链3求菌(S^"e/ tococc^ z'm'ae), 发现BP-2具低抑制活性，而BL则显示高抗细菌活性。对于哈氏 弧菌(/zarve;;/), B P - 2具抑制性而B L不具抑制性。与此相反， 副乳房链J求菌(S&eptococcws / flrawZ er/s)的生长被BL抑制， <旦不#皮BP-2抑制。因此，BP-2和BL可以彼此互补的方式起作用以赋予 针对微生物谱的抗细菌活性。此外，以上述相同方式检测1:1的 BP-2:BL混合物，发现具有针对全部被测试的有害海洋微生物的 抗细菌活性。 实施例4
在该实施例中，现场试验饲料添加剂对鱼类病原体的治疗和 吸引作用。将全部冻干的0.75 g T-l、 0.15 g BP-2和0.39 g BL (5:1:2.6,重量比)混合，然后将混合物添加到72 g鱼苗饲料中(相 应于约1.8%的詞料总重量)。将饲料以相同的等分量每天三次饲喂 200尾幼鱼持续六天。冻干的BP-2和BL各自每克包含lxl0"个 菌体。T-l每克包含约77 mg DHA(参看实施例1)。将200尾在海 水鱼类养殖笼中伺养的已用病原体感染 一 段时间的鱼(黑鲷
G4cflW/wpagr^ scWegeZ/))转移到鱼种场(FRP池)中。在第1天，当包 含根据本发明的祠料添加剂的饲料以上述方式饲喂时，8尾鱼死 亡。在第2天和第3天有5尾和2尾鱼死亡。然而，此后再也没 有发现死鱼。将该试验按比例放大，在29吨的鱼种场中将饲料詞 喂给20,000尾鱼。获得类似结果，在铜料饲喂3天后没有发现死 鱼。此外，当使用包含本发明的饲料添加剂的饲料时，观察到吸 引作用，但当使用仅包含BP-2和BL的饲料时，没有观察到吸引 作用，由此得出T-l所特有的气味吸引鱼类的结论。 实施例5
在其中发现红色真菌的豚鱼孵化场中检测根据本发明的水产 飼料添加剂的抗真菌活性。作为对照，使用市售产品如INVE Aquaticus Health制造并以"Pro-W"商标名销售的产品。根据厂商 提供的实验方案进行测试，其量为200 ppm。在提供对照3天后， 没有检测到真菌。以与实施例2中相同方式使用本发明的水产詞料添加剂，在添加剂饲喂1.5天后，没有观察到真菌。这些数据连 同来自针对真菌米曲霉(A; erg/〃ws oo;加e)测试的结果(参见实施例 3),证实了根据本发明的水产饲料添加剂具有抗真菌活性。
工业实用性
如到目前为止所述，包含本发明的新微生物破嚢壶菌KJS-1 和聚酵素芽孢杆菌KJS-2以及地衣芽孢杆菌的混合物的根据本发 明的渔业水产伺料添加剂不仅提供了鱼类必需的营养成分，而且 显示抗细菌和抗真菌活性，从而在渔业中具有广泛的实用性。
权利要求
1. 一种产生二十二碳六烯酸(DHA)的，保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏编号为KCCM 10667P的新微生物破囊壶菌KJS-1。
2. —种具有抗细菌和抗真菌活性的，保藏于韩国微生物保藏中 心(KCCM),保藏编号为KCCM 10769P的新微生物聚酵素芽孢杆 菌KJS-2。
3. —种渔业水产饲料添加剂，包含以预定重量比存在的冻干的 破嚢壶菌KJS-1、冻干的聚酵素芽孢杆菌KJS-2和冻干的地衣芽孢 杆菌的混合物。
4. 根据权利要求3的水产饲料添加剂，其中该混合物由5:1:2.6 重量比的冻干的破嚢壶菌KJS-1:冻干的聚酵素芽孢杆菌KJS-2:冻 干的地衣芽孢杆菌组成。
5. 根据权利要求3的水产伺料添加剂，其中冻干的聚酵素芽孢 杆菌KJS-2和冻干的地衣芽孢杆菌各自每克包含lxl0"个菌体， 以及冻干的破嚢壶菌KJS-1每克包含77 mg 二十二碳六烯酸 (DHA)。
全文摘要
在此披露了新微生物破囊壶菌KJS-1和聚酵素芽孢杆菌KJS-2。还提供了用于渔业的水产饲料添加剂，其包含冻干的破囊壶菌KJS-1、冻干的聚酵素芽孢杆菌KJS-2和冻干的地衣芽孢杆菌。除提供DHA(一种鱼类必需的营养成分)之外，该水产饲料添加剂显示抗细菌和抗真菌活性，从而防止鱼类死于细菌和真菌病。
文档编号C12N1/20GK101511992SQ200680055995
公开日2009年8月19日 申请日期2006年12月8日 优先权日2006年10月2日
发明者姜在璿, 朴宥秀, 李东景, 李柱韩, 李进英, 白才英, 郑泰盛, 金东勋, 金东熙, 金天圭, 金江民 申请人:仁济大学校产学协力团;柳英制药株式会社;姜在璿