专利名称：鉴别和选择定向分化为特异类型的干细胞以获得均质干细胞群的制作方法
鉴别和选择定向分化为特异类型的干细胞 以获得均质干细胞群
本发明涉及经修饰的干细胞，定向分化为相同特异性干细胞表型 的经修饰的均质干细胞群，涉及用于生产定向分化为特异性表型的单 一的可鉴别干细胞的方法以及涉及鉴别和选择定向分化为特异细胞型 的胚胎干细胞、胎儿干细胞或成体干细胞以获得均质干细胞群的方法。
目前，在不同细胞样品中的干细胞只能够被分离为异质细胞群， 即作为具有分化为不同类型细胞的潜力的很多细胞的库(例如，来自
骨髓抽出物、脐带血或血样的造血和非造血细胞)。有些"粗糙的"
选择或富集可以通过使用识别存在于这些异质细胞群(例如CD34或 CD133)中某些上的细胞表面抗原的抗体来进行。 一旦这些抗体与所述 细胞反应，这些细胞(定义为CD34或CD133阳性细胞)就能够通过 FACS(所述抗体具有焚光标记)或通过磁选择(使用来自Miltenyi Biotec的MACS技术)分离。然而，由于这些抗原(其与CD34或CD133 抗体反应)存在于不同的细胞上的事实，这类方法也导致异质千细胞 群，尽管在这些方法之后实现了部分富集(或选择)。
就这一点而言，本发明旨在提供改善的方法。本发明基于提供干 细胞的目的，所述干细胞允许在干细胞群中修饰该干细胞，以便鉴定质群。
本发明釆用表现权利要求1的特征的可以从其它干细胞中鉴别和 分离的干细胞以及采用用于获得表现权利要求36的特征的基本均质 的千细胞群的方法解决了所提出的问题。
本发明实现的一个优点基本上将从以下事实上看出，即由于本发 明的干细胞，定向分化为相同类型的所述干细胞群可以在体外获得并 可以在体内用于靼向应用。本文中采用的所有科技术语应该理解为具有以下含义 本文中采用的"引入，，是指将外源遗传物质(DNA)转导或转染入 细胞中并鉴别病毒转导和/或非病毒转染/转化。
"细胞DNA"是指原始干细胞DNA,即细胞天然包含的DNA。 "转录因子蛋白"是指在细胞中调控转录活化的蛋白。转录因子 蛋白通过直接结合于DNA上或通过结合其它DNA结合蛋白而定位于启 动子区和增强子序列单元。转录因子蛋白的功能为结合特异性DNA序 列和作为结合的结果调控在基因表达(也称为转录)的变化；
"特异性DNA-蛋白相互作用"是指依赖于核苷酸序列的DNA-蛋 白相互作用。
"特异序列"或"特异性序列"是指允许只与"特异性"蛋白相 互作用的核苷酸序列，所述"特异性，，蛋白即是注定与该核苷酸序列 相互作用的蛋白；
"细胞分化"是指使细胞变为特异类型的过程。
"转录"是指使用DNA模板合成RNA的过程，由此将遗传信息从 DNA转移到RNA。
"翻译"是指将包含在RNA的核苷酸序列中的信息转化为由遗传
密码特定的多肽的相应的氨基酸序列。
"启动子"是指RM聚合酶结合的、启动转录的DNA序列；和 "报道基因，，是指编码可容易地鉴定的蛋白的质粒或DNA构建体。
其用于证实在细胞群内具体DNA序列或具体DNA结合蛋白的存在。 在本发明的具体实施方案中，蛋白质分子为提高与变化为特异性
表型相关的基因的表达的转录因子蛋白。通常通过称为转录因子蛋白
的单一因子控制基因家族。该蛋白质结合特异性DNA序列并提高与变
化为特异性表型相关的基因的表达。由于转录因子蛋白为早表达的基 因并且只在将变为与该特异性转录因子蛋白有关的特异性表型的细胞 内表达(即各种转录因子蛋白存在于被刺激变为只对转录因子蛋白特 异性的表型的干细胞中)。所述蛋白质分子也倾向于借助与人工引入 的DNA-分子的结合位点序列的相互作用而启动编码人工引入的DNA-200680055596.9
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分子的指示分子的DNA序列的转录，并因此所述蛋白质启动指示分子 的合成。
在进一步的实施方案中，将人工引入的DNA-分子的结合位点序列 定位以便其通过最小启动子序列驱动编码指示分子的DNA序列的表 达。
在还进一步的实施方案中，最小启动子序列排列在位于结合位点 序列与编码指示分子的DNA序列之间的人工引入的DNA-分子中。
细胞表型取决于由非定向干细胞接受的刺激。 一旦被刺激，细胞 就通过关闭某些基因而开启其它基因改变其表型。这类刺激可以是物 理、化学或生物化学刺激。物理刺激的实例为在软骨细胞分化期间使 用接种于支架中的细胞的机械载荷(加压和剪切)。化学刺激的实例 为地塞米松作为成骨介质存在。生物化学刺激的实例为在软骨形成介 质中的TGFP 。
在进一步的实施方案中，指示分子具有允许从千细胞样品中选择 和去除包含指示分子的干细胞的特性。允许鉴定和/或选择指示分子的 所述指示分子的特性可以是化学、生物化学或物理特性。
在另一个实施方案中，指示分子为相对天然干细胞群是外源的细 胞表面表达的蛋白质，其在干细胞中的存在也是可鉴定的。
在进一步的实施方案中，指示分子具有铁磁性的特性。术语"铁 磁性，，在本文中用于可以显示暂时的磁化的任何材料在无外部磁场 的情况下的净磁时刻。
在另一个实施方案中，人工引入的DNA-分子的DM序列为编码绿 色荧光蛋白(GFP)的序列，所述GFP为当暴露于蓝光中时发绿色荧光 的来自7JC母Jeg"orea r/"or/a的蛋白质。也可以使用获自GFP基因 的颜色突变体，特别是青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。作 为以上提及的荧光指示分子的替代，可以使用对细胞无毒性并可以引 入细胞中且释放可被任何信号检测装置检测到的任何光线/能量的任 何指示分子。
当使用荧光指示分子时，例如绿色荧光蛋白(GFP)，所述细胞可以以单层使用荧光显微术或以单一细胞的悬浮液使用荧光激活细胞分
类术(FACS)鉴定。
当使用磁性指示分子例如铁蛋白时，可以使用磁性捕捉系统分离 所述细胞。
当使用相对天然干细胞群是外源的、细胞表面表达的蛋白时，所 述细胞可以使用针对引入的蛋白质的荧光标记的抗体鉴定并通过 FACS分离。可替代地所述细胞可以使用微珠捕捉系统例如DYNAL微珠 分离，其中对新表位反应性的抗体首先与DYNAL微珠结合，然后使用 微珠捕捉感兴趣的细胞。
引入的DNA-分子已经例如借助病毒转导或借助非病毒转染被引 入千细胞中。将引入的DNA-分子引入干细胞中但是并不引入所述干细 胞的原始细胞DNA中，使得引入的DNA不通过细胞分裂而复制并将只 存在于子细胞中的一个细胞中。这种实施方案的优点可以在分离和 (多)细胞分裂后包含引入的DNA-分子的干细胞可以从获得的干细胞 群中分离以便获得未经修饰的干细胞的干细胞群的事实中看出。
在进一步的实施方案中，人工引入的DM-分子包含至少两个DM 序列，其各编码不同的指示分子。
在人工引入的包含至少两个各编码不同的指示分子的DNA序列的 DNA-分子的这种实施方案中，该DNA可以包含能够与蛋白质分子相互 作用的一个结合位点序列， 一个最小启动子序列和各编码不同的指示 分子的两个DNA序列，其中这些MA序列彼此连接。
在将干细胞定向分化为特异性表型的情况下，所述特异性表型对 应能够与人工引入的DNA-分子的结合位点序列相互作用的蛋白质分 子(特异性表型和蛋白质分子之间的关联在图4中展示)，蛋白质分 子存在于所述细胞中并与人工引入的DNA序列的结合位点序列相互作 用，以便合成由这些DNA序列编码的两种不同的指示分子。这种实施 方案的优点可以在以下事实中看出，即指示分子之一是可选择的以便 满足较好的鉴别可能性标准且另一种指示分子是可选择的以便满足较 好的选择可能性标准。在进一步的实施方案中，人工引入的DNA-分子包含各编码不同的 指示分子的两个序列，该DM可以包含两个或更多个序列片段，所述 序列片段各包含能够与蛋白质分子相互作用的一个结合位点序列，一 个最小启动子序列和一个编码指示分子的DNA序列，其中两个DNA-序列编码两种不同的指示分子并且两个结合位点序列都能够与相同的 蛋白质分子相互作用。该实施方案也允许以下的可能性，即指示分子 之一是可选择的以便满足较好的鉴定可能性标准且另一种指示分子是 可选择的以便满足较好的选择可能性标准。
在另一个实施方案中，人工引入的DNA-分子包含各编码不同的指 示分子的两个序列，该DM包含两个或更多个序列片段，所述序列片 段各包含能够与蛋白质分子相互作用的一个结合位点序列(UBS)， 一 个最小启动子序列(MP)和一个编码指示分子的DNA序列，其中两个 DNA -序列编码两种不同的指示分子并且所述结合位点能够与两个不 同的蛋白质分子相互作用，其中这些不同的蛋白质分子对应两种不同 的细胞表型。这种实施方案的优点可以从以下事实中看出，包含定向
可以从千细胞样品中鉴定和分离。如果希望如此，那么以后可以将这 些混合在一起。
例如将所述序列片段可以以下顺序一起物理接合在相同的DNA-分子上
UBS(例如成骨细胞)-MP-指示分子(绿色)-UBS(例如软骨细 胞)-MP-指示分子(蓝色)。
在进一步的实施方案中，这类序列片段的数量可以任选地增加， 其中由DNA序列编码的各个不同的指示分子应该对应一个特异性结合 位点序列。这种实施方案的优点可以从以下事实中看出，即应该将仅 一个DNA-分子人工引入所获得的干细胞样品的各个细胞中并且通过
足够数量的这种序列片段所获得的千细胞样品的基本上所有细胞都可 以从异质干细胞样品中分离为定向分化为相同的特异性干细胞表型的
多个均质干细胞群。在另一个实施方案中，各个干细胞包含至少两个引入的DNA-分子，各包含编码指示分子的DNA序列，其中引入的DNA-分子的DNA序列(40)编码不同的指示分子。此外，不同的指示分子可具有不同的特性。这种实施方案允许以下优点，即允许更好地鉴别和选择地将具有不同特性的两种指示分子结合。这也允许同时选择多种细胞类型，以及提供研究分化途径的研究工具。
引入的DNA-分子也可以包含
-经突变的最小启动子序列，以便防止非特异性转录因子蛋白与DNA相互作用，其消除由其它转录因子引起的任何少量表达。
-至少一个额外的结合位点序列(A)。该实施方案的优点可以从以下事实看出，即通过进一步添加相同的序列更多的转录因子可以与DNA-序列相互作用，使得基因表达可以额外提高。这也增加了指示分子的数量并使得所希望的细胞易于鉴定。
未遗传修饰的均质群以及包含部分遗传修饰的子代干细胞以及未修饰的子代干细胞的均质群可以用于组织工程目的。所述群可应用于所有已知的干细胞应用中，并与现有技术应用形成对照，显示均质群的优点。骨組织工程可以通过将经分离的、未经修饰的干细胞群接种到生物学相容的支架材料上并将构建体植入骨质缺损中而实现。所述构建体在植入之前可以或可以不经过体外培养阶段。
可替代地，在肌肉的情况下，可以将经分离并纯化的细胞群直接注射入缺损中，允许细胞移行到损害点并实现修复。
可以将用于体内治疗组织疾病的、使用定向分化为相同的特异性干细胞表型的均质千细胞群制备的试剂，联合其它添加剂例如激素、维生素、生长因子、其它蛋白质、其它酶或其组合给予。
在进一步的实施方案中，所述干细胞用于鉴别在所述干细胞中存在所述的蛋白质分子。
在进一步的实施方案中，所述干细胞用于选择包含蛋白质分子的千细胞。
本发明的其它实施方案包括基本均质的定向分化为相同的特异性干细胞表型的干细胞群，所述群可通过以下步骤获得
A) 收集包含干细胞的干细胞样品，所述干细胞各包括包含多个编码不同基因的序列和允许DNA-蛋白质-相互作用的启动子的细胞丽；
B )向干细胞样品的多个干细胞中人工引入至少 一个DNA-分子，生产经修饰的干细胞样品；
其中引入的DNA-分子包含
I) 至少一个倾向于与蛋白质分子相互作用的结合位点序列；
II) 至少一个编码指示分子的DNA-序列，所述指示分子具有允
许其鉴别的特性；和
III) 至少一个最小启动子序列，允许指示分子的基因表达；
C) 向经修饰的干细胞样品中添加培养基；
D) 向经修饰的干细胞样品施加特异性刺激，其中特异性刺激在经修饰的干细胞样品的至少一个干细胞中产生蛋白质分子；
E) 通过借助指示分子的特性鉴别指示分子存在而在干细胞中鉴别包含蛋白质分子的干细胞；
F) 其中所述的指示分子通过借助所述蛋白质分子和引入的DM
生产；
G)借助指示分子的特性将经鉴定的干细胞选择为所述基本均质
的干细胞群。
然而，本发明的其它实施方案包含基本均质的干细胞群，其包含
定向分化为相同的特异性干细胞表型的干细胞，其中各个干细胞包含
A) 包含多个编码不同基因的序列和允许DNA-蛋白质-相互作用的启动子的细胞DNA;
B) 至少一种借助特异性刺激产生的蛋白质分子；和
C) 至少一个人工引入干细胞中的DNA-分子，其中引入的DM-分子包含
I)至少一个倾向于与蛋白质分子相互作用的结合位点序列；II) 至少一个编码指示分子的DNA序列；和
III) 至少一个最小启动子序列，允许指示分子的基因表达和
D)至少一种由DNA序列的合成生产的指示分子，所述的DNA序列编码引入的DNA-分子的指示分子；其中E )所述指示分子具有用于其鉴别的特性。
根据所述群的一个实施方案，指示分子具有允许选择包含所述指示分子的干细胞的特性。
本发明的再另一个实施方案包含基本均质的未经修饰的干细胞群，所述干细胞群定向分化为相同的特异性干细胞表型，其通过以下步骤可获得
A)收集包含干细胞的千细胞样品，所述干细胞各包括包含多个编码不同基因的序列和允许DM-蛋白质-相互作用的启动子的细胞DM;
B ) 向干细胞样品的多个干细胞中人工引入至少 一个DNA-分子，生产经修饰的干细胞样品；
其中引入的DNA-分子包含
i )至少一个倾向于与蛋白质分子相互作用的结合位点序列；
ii) 至少一个编码指示分子的DNA-序列，所迷指示分子具有允许其鉴别和选择的特性；和
iii) 至少一个最小启动子序列，其允许指示分子的基因表达；C )向经修饰的干细胞样品中添加培养基；
D) 向经修饰的干细胞样品施加特异性刺激，其中特异性刺激在经修饰的干细胞样品的至少一个干细胞中产生蛋白质分子；
E) 通过借助指示分子的特性鉴别千细胞中指示分子的存在而鉴别包含蛋白质分子的干细胞；
F) 其中所述的指示分子通过借助蛋白质分子和引入的DNA-分子的结合位点序列(A)之间的相互作用启动的DM序列的合成来生产；
G) 借助指示分子的特性将经鉴定的千细胞选择为基本均质的群；H)通过借助指示分子的特性鉴别指示分子的存在而鉴别在天然细胞分裂之后包含人工引入的DNA-分子的子代干细胞；
I )从在所述细胞分裂后获得的群中选择并去除经鉴定的子代干细胞，用于获得基本均质的定向分化为相同的特异性表型的未经修饰的干细胞群。
根据所述群的进一步的实施方案，所述蛋白质分子为提高与变为特异性表型相关的基因的表达的转录因子蛋白。
根据所述群的另一个实施方案，最小启动子序列排列在位于结合位点序列和编码指示分子的DNA-序列之间的人工引入的DNA-分子中。
根据所述群的进一步的实施方案，特异性刺激为物理、生物化学或化学刺激。
根据所述群的再另一个的实施方案，允许鉴别和/或选择所述指示分子的指示分子的特性为化学、生物化学或物理特性。
根据所述群的进一步的实施方案，引入的DNA-分子包含至少两个各编码不同的指示分子的DNA序列。
根据所述群的还另一个实施方案，所述群的各个干细胞包含至少两个引入的DNA-分子，各包含编码指示分子的DNA序列，其中引入的DNA-分子的DNA序列编码不同的指示分子。
根据所述群的另一个实施方案，不同的指示分子具有不同的特性。
根据所述群的进一步的实施方案，引入的DNA-分子包括编码具有铁磁性分子特性的指示分子的序列。
根据所述干细胞的进一步的实施方案，引入的DNA-分子包括相对天然干细胞群是异源的编码细胞表面表达的蛋白质的序列。
本发明的另一个目的为未修饰的群用于组织工程目的的用途。
本发明的进一步的目的为所述群制备用于体内治疗组织和血液疾病的试剂的用途。
本发明的还进一步的目的为所述群制备用于体外治疗组织和血液疾病，特别是白血病的试剂的用途。
本发明的还另一个目的为所述群的用途，其中将所述试剂与其它添加剂联合给予。
本发明的还另一个目的为所述群的用途，其中添加剂为激素、维生素、生长因子、其它蛋白质、其它酶或其组合。
用于获得基本均质的定向分化为相同的特异性表型的干细胞群方
法的进一步的实施方案包括以下步骤
A) 收集包含干细胞的干细胞样品，所述干细胞各包括包含多个编码不同基因的序列和允许DNA-蛋白质-相互作用的启动子的细胞歸；
B) 向干细胞样品的多个千细胞中人工引入至少一个DNA-分子，生产经修饰的干细胞样品，
其中引入的DNA-分子包含
I) 至少一个倾向于与蛋白质分子相互作用的结合位点序列；
II) 至少一个编码指示分子的DNA-序列，所述指示分子具有允
许其鉴别的特性；和
III) 至少一个最小启动子序列，允许指示分子的基因表达；
C) 向经修饰的干细胞样品中添加培养基；
D) 向经修饰的干细胞样品施加特异性刺激，其中特异性刺激在经
修饰的千细胞样品的至少一个干细胞中产生蛋白质分子；
E) 通过借助指示分子的特性鉴别在干细胞中指示分子的存在而鉴
别包含蛋白质分子的干细胞；
F )其中所述的指示分子通过借助蛋白质分子和引入的DNA -分子的结合位点序列之间的相互作用启动的DNA序列的合成来生产；
G)借助指示分子的特性将经鉴定的干细胞选择为基本均质的干细胞群；
在上述方法的另一个实施方案中，所述蛋白质分子为提高与变化为特异性表型相关的基因的表达的转录因子蛋白。
在上述方法的进一步的实施方案中，最小启动子序列排列在结合位点序列和编码指示分子的DNA序列之间的人工引入的DNA-分子中。
在上述方法还另一个实施方案中特异性刺激为物理、生物化学、或化学刺激。
在上述方法的再另 一个实施方案中，允许鉴别和/或选择所述指示分子的指示分子的特性为化学、生物化学或物理特性。
在上述方法的进一步的实施方案中，指示分子为相对天然干细胞群为异源的细胞表面表达的蛋白质。
在上述方法的另一个实施方案中，指示分子具有铁磁性的特性。
在所述方法的还另一个实施方案中，引入的DNA-分子的DNA序列为编码下组的指示分子的序列绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)或黄色荧光蛋白(YFP)。
在上述方法的还进一步的实施方案中引入的DNA-分子包含至少两个DNA序列，其各编码不同的指示分子。
在上述方法的另一个实施方案中，将至少两个引入的DNA-分子(各包含至少一个编码指示分子的DNA序列)人工引入干细胞样品的多个干细胞中，其中引入的DNA-分子的DNA序列编码不同的指示分子。
在上述方法的还另一个实施方案中，不同的指示分子具有不同的特性。
在上述借助细胞DNA和蛋白质分子之间的特异性相互作用用于获
法的还另一个实施方案中，包括以下的附加步骤
H)在细胞分裂后通过借助指示分子的特性鉴别所述指示分子的
存在，而鉴别包含引入的DNA-分子的子代干细胞；
I )从所述群中选择和去除经鉴定的子代干细胞。在本发明的进一步的实施方案中，异质干细胞群包含定向分化为
至少两种不同的特异性干细胞表型的干细胞，其中各个干细胞包含
A) 包含多个编码不同基因的序列和允许DNA-蛋白质-相互作用的启动子的细胞DNA;和
B) 将至少两个不同的DNA-分子人工引入干细胞样品的多个细胞中，
其中引入的DNA-分子各包含a) 至少一个倾向于与蛋白质分子相互作用的结合位点序列；
b) 至少一个编码指示分子的DNA序列，所述指示分子具有允许其鉴别的特性；和
c) 至少一个最小启动子序列，允许指示分子的基因表达；其中
d) 不同的引入的DNA-分子包含编码两种不同的指示分子的两个不同的DNA-序列;
和
C) 至少一种指示分子，所迷指示分子具有允许鉴别由引入的DNA-分子的DNA序列的合成产生的指示分子的特性，其中
D) 定向分化为相同的特异性干细胞表型的干细胞包含相同的指示分子。
在还另一个实施方案中，本发明包括两个不同的含有定向分化为至少两种不同干细胞表型的干细胞群，其中所述干细胞各包含
A) 包含多个编码不同基因的序列和允许DNA-蛋白质相互作用的启动子的细胞DNA;和
B) 至少一个DNA-分子，各人工引入千细胞样品的多个细胞中，其中引入的DNA-分子各包含
a) 至少一个倾向于与蛋白质分子相互作用的结合位点序列；
b) 至少一个编码指示分子的DNA序列，所述指示分子具有允许
其鉴别的特性；和
c) 至少一个最小启动子序列，允许指示分子的基因表达；其中
d) 不同的引入的DNA-分子包含编码两种不同的指示分子的两个不同的DNA序列;
和
C) 至少一种指示分子，所述指示分子具有允许鉴别由引入的DNA-分子的DNA序列的合成生产的指示分子的特性，其中
D) 定向分化为相同的特异性干细胞表型的干细胞包含相同的指示分子。
在两种不同的干细胞群的另一个实施方案中至少一种DNA-分子各在步骤B)下人工引入所述干细胞样品的所有干细胞中。
在上述群的还进一步的实施方案中，不同的指示分子具有不同的特性。
参考不同的实施方案的部分图解说明更详细的解释本发明和本发明的附加结构。
图1.图解说明待人工引入干细胞中的DNA-分子；
图2.图解说明进入千细胞中的过程，用于生产根据本发明在权利要求1中定义的干细胞；
图3A-3E图解说明用于获得基本均质的定向分化为相同的特异类型的干细胞群的本发明方法的体外过程；和
图4展示了描述特异性刺激、特异性刺激的决定性添加剂、在经
子蛋白之间的关联的表格。一 一 '
图1图解说明待人工引入干细胞中的DNA-分子6，其中该DNA-分子6是以质粒形式并包含能够与特异性蛋白质分子3相互作用的结合位点序列30、允许基因表达的最小启动子序列50和编码指示分子5(未在图1中展示)的DM序列40。结合位点序列30是只能够与特异性蛋白分子3相互作用的特异序列并因此应该根据所希望的存在的干细胞的表型选择(细胞表型和结合位点序列的依存关系在以下提供)。最小启动子序列50是启动子序列的最小片段并允许由编码指示分子5的DNA序列40编码的基因被表达。在具有与结合位点序列30相互作用的特性的蛋白质分子3存在的情况下，蛋白质分子3结合于结合序列位点30上，以便编码指示分子5的DNA序列40的表达被最小启动子序列50启动并合成指示分子5。在蛋白质分子3不与结合位点序列30相互作用的情况下(只有能够与引入的DNA-分子6的结合位点序列30相互作用的蛋白质分子3在干细胞中不存在才可能发生的情况)编码指示分子5的DNA序列40不能被表达使得不能合成指示分子，使得在干细胞中存在蛋白质分子3被在干细胞中存在指示分子5而证实。代替一个结合位点序列30, —个最小启动子序列50和一个编码 指示分子的DNA序列40，引入的DNA-分子6可以包含例如编码其它指 示分子5的其它的DNA序列30或提高基因表达的其它的结合位点序列 (30)。
图2展示了包含细胞DNA2和包含结合位点序列30、最小启动子 序列和编码指示分子5 (在图3C+ 3D中展示)的DNA序列40的人工 引入的DNA-分子6的干细胞1，所述指示分子5具有允许其鉴别和选 择的特性。可以通过病毒转导或非病毒转染将人工引入的DNA-分子6 引入干细胞l中。使用病毒转导使构建体穿梭进入细胞中暗示着构建 体将将被插入腺病毒DNA中并且通过使用腺病毒的常规方法细胞将被 感染。可替代地，腺病毒系统是相关腺病毒或反转录病毒以及慢病毒 属。也可以使用任何商购可得的非病毒系统，例如脂质体(例如 Lipofectamine )或AMAXA技术以及以前建立的方法例如磷酸钾转染或 电穿孔。
除了细胞DNA2以及人工引入的DNA-分子6以外，千细胞1还包 含多个蛋白质分子3。在千细胞1中存在蛋白质分子3通过向干细胞1 中施加特异性刺激12而引起。
干细胞1为能够被诱导而生产很多细胞类型的多能细胞。生产的 细胞的表型取决于非定向干细胞接受的刺激12。 一旦被刺激，千细胞 1通过关闭某些基因而开启其它基因来改变其表型。蛋白质分子3是 对干细胞的仅一种表型特异性的早期表达的基因，使得蛋白质分子3 的存在由所述千细胞的表型和由对干细胞1施加特异性刺激12引起。
在施加特异性刺激12后，蛋白质分子3被生产，其结合于倾向于 与蛋白质分子3相互作用的序列上并提高基因的表达。蛋白质分子3 也结合于结合位点序列30上，借助所述结合引起编码指示分子5的 DNA序列40的表达并引起指示分子5的合成。
图3A图解说明包含多个千细胞的干细胞样品10,所述干细胞包 含细胞DNA2。将各包含倾向于与蛋白质分子3相互作用的结合位点序 列30、最小启动子序列50和编码指示分子5的DNA序列40的DNA-分子6 (所述指示分子5具有允许其鉴别和选择的特性)人工引入干 细胞样品10的各个干细胞中以便生产经修饰的干细胞样品11。
在将DNA-分子6人工引入干细胞样品10的各个干细胞中之后， 向经修饰的干细胞样品11施加特异性刺激12 (在图2中展示)。将 所述特异性刺激12施加到经修饰的干细胞样品11中，所述特异性刺 激12产生使经修饰的千细胞样品11的部分千细胞由多能性变化至特 异性干细胞表型。在向经修饰的干细胞样品11施加特异性刺激12后， 部分干细胞被刺激变为对应特异性刺激12的特异性千细胞表型。这些 干细胞1也包括至少一种生产的蛋白质分子3 (图3B)。由于特异性 刺激12,所获得的蛋白质分子3为早表达基因的蛋白质并具有转录因 子功能，即倾向于与对应的特异性DNA序列相互作用。
作为以上评论的方法的结果，干细胞样品10转化为千细胞样品 11，其包含各包含人工引入的DNA-分子6的经修饰的干细胞，其中经 修饰的干细胞样品11包含两组干细胞
组A:经刺激变为特异性干细胞表型的干细胞，其中对该表型特 异性的蛋白质分子倾向于与人工引入的DNA-分子6的结合位点序列30 相互作用；和
组B:经刺激未变为特异性表型干细胞(即对该表型特异性的蛋 白质分子不倾向与人工引入的DM-分子6的结合位点序列30相互作 用，因为所述DM-分子6所述细胞内不存在)。
图3C图解展示了组A的干细胞1借助特异性刺激12刺激变为特 异类型并包含蛋白质分子3，其倾向于与人工引入的DNA-分子6的结 合位点序列30相互作用。
在将DNA-分子6人工引入干细胞1中并且通过对干细胞样品10 施加特异性刺激12而进行干细胞1的刺激之后，产生的蛋白质分子3 与细胞DNA2的特异序列相互作用以便一方面提高对干细胞1的表型特 异性的基因的自然表达并且另一方面与人工引入的DNA-分子6的结合 位点序列30相互作用，其中在自然基因表达期间，结合位点序列30 和与蛋白质分子3相互作用的细胞DNA2的特异序列是相同的。由于蛋白质分子3与细胞DNA2之间的相互作用，对蛋白质分子3 特异性的自然基因表达在进行。由于蛋白质分子3与结合位点序列30 之间的相互作用，编码指示分子5的DNA序列40的表达通过最小启动 子序列50启动并且合成指示分子5。
作为在图3C中说明的方法的结果，组A的干细胞以存在指示分子 5不同于组B的干细胞，所述指示分子5具有允许将其从干细胞样品 IO中鉴别和选择的特性。
图3D说明了将异质干细胞群的干细胞鉴别和选择为只包含定向 分化为相同的特异性表型的均质干细胞群17和另一个包含残余的干 细胞的异质千细胞群18。目标干细胞1的鉴别和选择可以借助任何检 测仪器实现，借此，由于指示分子5的特性，可以观察到在干细胞1 中存在指示干细胞1的特异性表型的指示分子5。在以上提及数个检 测4义器的实例。
当使用腺病毒或任何非整合型病毒系统时，将人工引入的DNA-分 子6引入干细胞中但是未连接到细胞DNA2上。因此在自然细胞分裂期 间，人工引入的DNA-分子6将不复制，使得各个千细胞1的子细胞中 的仅一个将包含引入的DNA-分子6而其它子细胞将保持未修饰。图3E 说明了群17的千细胞l的自然细胞分裂过程，其产生包含子代干细胞 20的干细胞群(所迷子细胞20包含人工引入的DNA-分子6)和多个 定向分化为相同的特异性表型的未经修饰的干细胞。经修饰的子细胞 (即包含人工引入的DNA-分子6的子细胞)可以根据上述的鉴别和选 择方法从干细胞的均质干细胞群17鉴定和选择，以便获得只包含未经 修饰的干细胞的均质的未修饰干细胞群19。
类似于在图3A- 3E展示的过程，干细胞的任何干细胞样品都可以 被分离为任何数量的不同的均质群，其包含定向分化为相同的特异性 表型的干细胞，其中应该制备许多DNA-分子6 (对应希望选择为均质 群的细胞表型的数量)，以便各个DNA-分子6将包含结合位点序列30、 最小启动子序列50和编码指示分子5的DNA序列40，其中各个不同 的DNA-分子6的结合位点序列30应该对应希望被鉴定的不同的细胞表型，且各个不同的DM-分子6的编码指示分子5的DNA序列40应 该编码不同的指示分子5的序列。在克隆后，应该将生产的各类DNA-分子6引入所述干细胞的各个干细胞中。通过以上方法获得的干细胞 样品包含定向分化为许多不同的特异性表型的多个干细胞1，其中所 述细胞的各种表型可以通过不同的指示分子5的不同特性来鉴定。可 替代地，DNA-分子6可以包含多个结合序列30、最小启动子序列50 和编码指示分子5的DNA序列40,其以这样的方式排列，即一个DNA-分子能够与蛋白质分子3的不同类型结合，各个蛋白质分子3导致生 产特定的指示分子5。
对于上述DNA序列的引入，针对非病毒转染的以下实例是适合的。 将定向分化为成骨细胞的间质干细胞用作实例；应该转染编码绿色荧 光蛋白(GFP)的序列。
在以下的描述中，Runx2 DNA报道构建体是指人工引入的DNA-分 子，包含至少
i )Runx2结合位点(即影响人工引入的DNA-分子和Runx2蛋白质 之间的相互作用的序列)；
ii) 影响启动DNA的转录的最小启动子；和
iii) 编码绿色荧光分子(GFP)的序列(即指示分子，其具有允许 鉴别和选择所述指示分子的化学、物理或生物化学特性)。
将DNA报道构建体(其中GFP表达通过Runx2转录因子蛋白的结 合而驱动)使用标准分子克隆技术克隆至质粒。精确的方法取决于使 用的质粒。将在重悬于小体积的緩冲液之前，质粒/报道构建体用乙醇 沉淀，以使DNA清洁和灭菌。将分离后的干细胞平铺于96孔板上，并 制备一系列的稀释液以便产生包含单一细胞群的孔。使细胞在包含 10% FCS(胎牛血清)的DMEM培养基(Dulbecco/Vogt Modified Eagle's Minimal Essential Medium)中于37"C下在5 %的0)2培养器中生长过 夜。在24小时的生长之后将DNA稀释为3. 84 ml不含血清的DMEM， 简短地涡旋并添加脂质体试剂。需要针对各种脂质体和细胞类型优化 DNA和脂质体的值，但是常规值为Vg DM和10 pl脂质体试剂每ml不含血清的培养基。将完全培养基从细胞中抽吸出来并将细胞用不含
血清的培养基洗涤一次。然后在每个孔中添加40 pi不含血清的培养 基中的DNA。将细胞在37C下于5%的0)2中培养3小时。然后每孔添 加200 |nl完全培养基并使细胞再生长16至24小时。去除培养基并 且每孑L的替代用250 pl IMDM (Iscove， s Modified Dulbecco， s Medium、 10%FCS、非必需氨基酸、0. lmM抗坏血酸-2-磷酸盐和10mMp-甘油磷酸用10nM地塞米松(成骨介质))。现在将所述细胞连续监控绿 色荧光(其指示存在绿色荧光蛋白并因此存在Runx2)。
可以将单一的绿色细胞分离并进一步扩增，导致所有细胞都定向
变为成骨细胞的细胞群。
在以下的应用实施例中更详细地解释本发明和本发明的进一步的 改进方案。
实施例1:
该实施例更精确地解释了用于获得根据本发明的基本均质的间质 干细胞群的方法并仅是说明性实施例而不应该将本发明局限于该实施 例。所述实施例是指用于获得只分化为成骨细胞的干细胞的方法，其 中绿色荧光蛋白(GFP)用作指示分子。
材料
经灭菌的磷酸盐緩沖的盐溶液(PBS)、 pH 7.2、 Ficoll、亚曱蓝。 培养基
DMEM (Dulbecco/Vogt Modified Eagle's Minimal Essential Medium:粉末，用于1L培养基中，添加0. 11 g/L丙酮酸钠和3. 7 g/L 碳酸氢钠，10。"v/v) FCS (胎牛血清)抗生素/抗真菌溶液(100X)(液体， 向各IOO mL培养基中添加lmL)， T-摇瓶75cm7250mL。
方法
将从髂嵴获得的人骨髓抽吸物用4 niL DMEM/WFCS每lmL抽吸物 稀释。然后将样品以lOOOrpm离心分离5分钟。去除脂肪层和上清液， 并将残余的沉淀物重悬于4mL DMEM/5%FCS中。
将2. 6mL的室温Ficoll每l mL未稀释的抽吸物置于50mL-Falcon管中并在Ficoll的上部非常小心地吸移抽吸物/DMEM。然后将样品以 800g在室温下以最低等级的加速/减速精确地离心分离20分钟。单核 细胞形成使用注射器或移液管收集的界面。将5 mL的DMEM/5% FCS 添加到每mL收集的界面中，小心混合并以400g于室温下离心分离15 分钟。抽吸上清液并重复洗涤步骤。
将最终的细胞沉淀物重悬于10ml培养基中。将4x 106个细胞每 75cm2-摇瓶置于15 mL培养基中，使其在37C下，5% C02， 95%的湿度 下静置2-3天使细胞附着于摇瓶底部。
根据以上方法分离的间质干细胞也视为代表(在添加适当的刺激 后能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等)间质干 细胞。
通过以下的步骤从获得的间质干细胞库中分离出定向分化为成骨 细胞的千细胞
将Runx2 DNA报道构建体使用标准分子克隆技术克隆至pShuttle 载体(来自Statagene的pAdEasy腺病毒构建体试剂盒的部分)。将包 含驱动绿色荧光蛋白(GFP)的Runx2报道基因的pShuttle栽体通过热 激转化法(heat shock transformation)添加到细菌中。使用感受态 细菌(能接受DNA质粒的细菌)XL-10 Gold 。将100微升冷后的细菌 置于1.5 ml的Eppendorf管中并添加4pl的^-巯基乙醇并小心混 合。然后将所述细胞在水上培养10分钟并添加0. 1-50 ng包含Runx2 驱动的GFP的报道基因的pShuttle载体。然后将所述细胞在冰上培养 30分钟且然后于42X:的水浴中放置30秒。在冰上再培养2分钟后， 添加O. 9 ml经预热的(42X:) NZY+培养基(NZY+为众所周知的细菌生 长用培养基)并将所述管在摇动下于37C培养。然后将样品平铺到包 含卡那霉素抗生素的Luria Broth琼脂板上并在37C下放置过夜。只 有包含所述质粒的细菌才能抵抗抗生素并形成菌落。在~36小时后， 采集单个的菌落并在10 mlLB-卡那霉素肉汤中生长过夜。在生长24 小时后，接着使用标准质粒小量制备技术从细菌中分离质粒。
将分离后的质粒用Pmel限制酶线性化，再纯化并然后用碱性磷酸酶于37匸下处理30分钟。然后将线性化的、去磷酸的质粒通过琼脂 糖凝胶电泳纯化并以1 |iig/|Lil的浓度重悬于灭菌dH20中。
为了制备腺病毒载体，将4(V1冷后的BJ5183细菌置于冷后的1. 5 ml离心管中，添加1 pi (1 pg)线性化的、去磷酸的在pShuttle中 的Runx2 DNA报道构建体和ljal (100 ng/pl) pAdEasy-1载体(来自 Statagene的pAdEasy腺病毒构建体试剂盒的部分)并小心混合。将该 混合物转移到冷后的电穿孔小池中并在以下的设置下用电流脉沖作用 一次200欧姆、2. 5 kV、 25pF。在电穿孔后立即添加1 ml灭菌Luria 肉汤。然后将混合物添加到LB-卡那霉素琼脂糖平板上并在37C下培 养过夜。在生长 24小时后，采集平板上的10个最小菌落并在5ml的 LB-卡那霉素肉汤中37t:于摇动下生长过夜。最小菌落可能是其中通 过重组Runx2 DNA才艮道构建体从pShuttle载体转移到pAdEAsy载体中 的那些。在生长~24小时后使用标准质粒小量制备技术从细菌中分离 重组载体(包含Runx2 DNA报道构建体的pAdEasy)。通过测序和Pacl
消化研究质粒以确保已经制备出适合的重组体。
然后将包含Runx2 DNA报道构建体的pAdEasy腺病毒载体转化至 XL-10 gold细菌(如先前对pShuttle所述)。
然后使用AD-293哺乳动物细胞由包含Runx2 DNA报道构建体的 pAdEasy DNA载体生产腺病毒。将AD-293细胞以7xl()5个细胞每盘平 铺于6(Hnm組织培养皿上并在包含10% FCS的DMEM培养基中生长。 当细胞70°/。汇合时，将它们用PBS洗涤两次并添加包含25pm氯喹和 7%的经修饰的牛血清的4ml DMEM。将所述细胞在37C下于5% 0)2培 养器中培养30分钟。当培养细胞的时候，将5ngPacI消化的包含Runx2 DNA报道构建体的重组腺病毒栽体在dH20中重悬为225 pl的终体积。 将来自virapack的转染试剂盒(Stratagene)的25^1溶液I和250jnl 溶液2添加到225^1 DNA悬浮液中，将其小心混合并在室温下培养10 分钟。然后将小心混合的DNA悬浮液在培养基温和涡流的情况下逐滴 添加到所述细胞中。将DM与细胞在37X:下于C02培养器中培养3小 时。去除培养基并用4 ml包含25pM氯喹的培养基小心替代。在去除培养基并用正常的完全培养基替代之前，将所述细胞在37X:下于co2 培养器中再培养6小时。
在7-10天后细胞出现溶胀。去除培养基并添加0. 5ml PBS。将 细胞用细胞刮刀刮除并转移到1. 7ml的管中。在4次冷冻-融化过程 后，将细胞以12, 000 g在室温下离心分离IO分钟并将上清液等分。 在-80t:下储存粗制病毒原液。
在前一夜，将待用腺病毒载体感染的干细胞在平铺于96孔中。制 备一系列稀释液以便产生包含单细胞群的孔。在感染日将所述病毒与 40 pl不含血清的培养基混合为每孔100 MOI的终浓度。添加的体积 应该是正好覆盖所述孔的基底所需要的最少量。将培养基从间质千细 胞中去除并小心添加病毒悬浮液混合物。将病毒混合物在37t:下于C02 培养器中培养3小时。将200 pl DMEM培养基在37C下照常添加到 C02培养器中。在24小时之后，培养基的替代用250 pl每孔IMDM、 10% FCS、非必需氨基酸、0. lmM抗坏血酸-2-磷酸盐和10mM p-甘油 磷酸用10nM地塞米松代替(成骨介质)。将细胞连续用绿色荧光(其 指示存在绿色荧光蛋白并因此存在Runx2)监控。
将单一的绿色细胞分离并进一步扩增，导致所有细胞都定向变为 成骨细胞的细胞群。
在单层扩增期间，GFP表达载体丢失。这留下未遗传修饰的细胞群。
如果需要的表型优选三维诱导例如软骨细胞，可以将间质干细胞 以低密度接种于水凝胶例如藻酸盐中。然后可以将通过指示分子的存 在鉴定的细胞稍后从凝胶内的混合群中分离。
实施例2-5
可替代地，可通过上述方法获得任何定向分化为相同的特异性表 型的其它均质干细胞群。根据图4的表格说明数个特异性刺激和这些 刺激的决定性添加剂的实例，其可以用于获得定向分化为特异性表型 的干细胞群以及对所述干细胞的表型特异性的对应转录因子。
权利要求
1. 干细胞(1)，其包含A)包含多个编码不同基因的序列和允许DNA-蛋白质相互作用的启动子的细胞DNA(2)；B)至少一种借助特异性刺激(12)产生的蛋白质分子(3)；C)至少一个人工引入干细胞(1)中的DNA-分子(6)其中人工引入的DNA-分子(6)包含I)至少一个倾向于与蛋白质分子(3)相互作用的结合位点序列(30)；II)至少一个编码指示分子(5)的DNA序列(40)；和III)至少一个允许所述指示分子(5)的基因表达的最小启动子序列(50)和D)至少一个通过人工引入的DNA-分子(6)的编码指示分子(5)的DNA序列(40)的合成生产的指示分子(5)；其中E)指示分子(5)具有允许其鉴别的特性。
2. 根据权利要求1的干细胞(1 )，其中蛋白质分子(3 )为提高 与变化为特异性表型相关的基因的表达的转录因子蛋白。
3. 根据权利要求1或2的干细胞(1)，其中蛋白质分子(3)借 助与人工引入的DNA-分子(6)的结合位点序列(30)的相互作用倾 向于启动人工引入的DNA-分子的DM-序列(40)的转录。
4. 根据权利要求1-3之一的千细胞(l)，其中在人工引入的 DNA-分子(6)中的结合位点序列(30)被这样定位，以使得其通过最 小启动子序列(50 )驱动编码指示分子(5 )的DNA序列(40 )的表达。
5. 根据权利要求1-4之一的干细胞U)，其中最小启动子序列 (50)排列在位于结合位点序列(30)和编码指示分子(5)的DNA序列(40)之间的人工引入的DNA-分子(6)中。
6. 根据权利要求l-5之一的干细胞(1)，其中特异性刺激(12)为物理、化学或生物化学刺激。
7. 根据权利要求1 - 6之一的干细胞(1)，其中指示分子(5 ) 具有允许选择包含所述的指示分子(5)的干细胞(1)的特性。
8. 根据权利要求l-7之一的干细胞(1),其中允许鉴别和/或 选择所述指示分子(5)的指示分子(5)的特性为化学、生物化学或 物理特性。
9. 根据权利要求1 - 8之一的干细胞(1 )，其中指示分子(5 ) 为相对天然干细胞群是异源的细胞表面表达的蛋白质。
10. 根据权利要求l-9之一的干细胞(1),其中指示分子(5) 具有铁磁性的特性。
11. 根据权利要求1-10之一的干细胞(1)，其中人工引入的 DNA-分子(6)的DNA序列(40)为编码下组的指示分子(5)的序列 绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)。
12. 根据权利要求1-11之一的干细胞(1),其中人工引入的 DNA-分子(6)包含至少两个DNA序列(40)，各编码不同的指示分子m 。
13. 根据权利要求12的干细胞(1)，其中指示分子(5，)之一 为绿色指示分子和另一个指示分子(5")为蓝色指示分子。
14. 根据权利要求1-13之一的干细胞(1)，其中千细胞(l) 包含至少两个人工引入的DM-分子(6 )，其各包含编码指示分子(5 ) 的DNA序列(40)，其中引入的DM-分子(6)的DM序列(40)编 码不同的指示分子(5)。
15. 根据权利要求13或14的干细胞(1),其中不同的指示分子 (5)具有不同的特性。
16. 根据权利要求1 - 15之一的干细胞(1)用于鉴别在所述的干 细胞(1)中蛋白质分子(3)的存在的用途。
17. 根据权利要求1 - 15之一的干细胞(1)用于选择包含蛋白质 分子(3)的干细胞1的用途。
18. 根据权利要求1 - 15之一的基本均质的干细胞(1 )的群(17 )，其定向分化为干细胞的相同的特异性表型，其中所述群(17)通过以 下步骤可获得A) 收集包含干细胞的干细胞样品(10)，所述干细胞各包含细胞 DNA(2)，所述细胞DNA(2)包含多个编码不同基因的序列和允许DNA -蛋白质-相互作用的启动子；B) 向干细胞样品(10)的多个干细胞中人工引入至少一个DNA-分子(6)，生产经修饰的干细胞样品(ll);其中引入的DNA-分子(6)包含I) 至少一个倾向于于与蛋白质分子(3)相互作用的结合位点序 列(30);II) 至少一个编码指示分子(5)的DNA-序列(40)，所述指示 分子(5)具有允许其鉴别的特性；和III) 至少一个最小启动子序列(50)，其允许指示分子(5)的基 因表达；C) 向经修饰的干细胞样品(11)中添加培养基；D) 向经修饰的干细胞样品(11)施加特异性刺激(12),其中特异性刺激(12)在经修饰的干细胞样品(11)的至少一个千细胞中产 生蛋白质分子(3);E )通过借助指示分子(5 )的特性鉴别指示分子(5 )在干细胞 (1)中的存在而鉴别包含蛋白质分子(3)的干细胞(1);F) 其中所述的指示分子(5)通过借助蛋白质分子(3)和引入的 DNA-分子(6)的结合位点序列(A)之间的相互作用启动的DNA序列(40)的合成来生产；和G) 借助指示分子(5)的特性将经鉴定的干细胞(1)选择为所述 基本均质的干细胞(1)的群(17)。
19.包含定向分化为相同的特异性干细胞表型的干细胞的基本均 质的干细胞群(17)，其中所述的干细胞各包含A)包含多个编码不同基因的序列和允许DNA-蛋白质相互作用的 启动子的细胞DNA(2);B) 至少一种借助特异性刺激(12)产生的蛋白质分子(3);和C) 至少一个人工引入干细胞(1)中的DNA-分子(6) 其中人工引入的DNA-分子(6)包含I )至少一个倾向于与蛋白质分子(3)相互作用的结合位点序列 (30);II )至少一个编码指示分子(5)的DNA序列(40);和III)至少一个最小启动子序列(50)，其允许指示分子(5)的基 因表达 和D) 至少一个通过人工引入的DNA-分子(6)的DNA序列(40)的 合成生产的指示分子(5)，所述DNA序列(40)编码指示分子(5); 其中E) 指示分子(5)具有允许其鉴别的特性。
20. 根据权利要求18或19的群(17)，其中指示分子(5)具有 允许选择包含所述指示分子(5)的千细胞(1)的特性。
21. 基本均质的未经修饰的干细胞群(19)，其定向分化为相同的特异性干细胞表型，其通过以下步骤可获得A) 收集包含干细胞的干细胞样品(10)，所述干细胞各包含细胞 DNA(2),其包含多个编码不同基因的序列和允许DNA-蛋白质-相 互作用的启动子；B) 向干细胞样品(10)的多个干细胞中人工引入至少一个DNA-分子(6)，生产经修饰的千细胞样品(11);其中引入的DNA-分子(6)包含i )至少一个倾向于与蛋白质分子(3)相互作用的结合位点序列 (30);ii) 至少一个编码指示分子(5)的DNA-序列(40)，所述指示 分子(5)具有允许其鉴别和选择的特性；和iii) 至少一个最小启动子序列(50)，其允许指示分子(5)的 基因表达；C) 向经修饰的干细胞样品(11)中添加培养基；D) 向干细胞样品(11)施加特异性刺激(12)，其中特异性刺激 (12)在经修饰的干细胞样品(11)的至少一个干细胞中产生蛋白质分子(3 );E )借助通过指示分子(5 )的特性鉴别指示分子(5 )在干细胞(1 ) 中的存在而鉴別包含蛋白质分子(3)的干细胞(1);F) 其中所述的指示分子(5)通过借助蛋白质分子(3)和引入的 DNA-分子(6)的结合位点序列(A)之间的相互作用启动的DNA序列(40)的合成来生产；G) 借助指示分子(5)的特性将经鉴定的干细胞(1)选择为所述 基本均质的群(17);H) 通过借助指示分子(5 )的特性鉴别指示分子(5 )的存在而鉴 别在天然细胞分裂之后包含人工引入的DNA-分子(6)的子代干细胞(20);I )从在所述细胞分裂后获得的群中选择并去除经鉴定的子代千细 胞(20)，用于获得基本均质的定向分化为相同的特异性表型的未经 修饰的干细胞群(19)。
22. 根据权利要求18-20之一的群(17)，其中蛋白质分子(3)为提高与变化为特异性表型相关的基因的表达的转录因子蛋白。
23. 根据权利要求18-20之一或22的群(17)，其中最小启动 子序列(50)排列在位于结合位点序列(30)和编码指示分子(5)的 DNA序列4Q之间的人工引入的DNA-分子(6)中。
24. 根据权利要求18-20或22 - 23之一的群(17),其中所述 特异性刺激(12)为物理、生物化学或化学刺激。
25. 根据权利要求18-20和22 - 24之一的群(17)，其中允许 鉴别和/或选择所述指示分子(5 )的指示分子(5 )的特性为化学、生 物化学或物理特性。
26. 根据权利要求18-20和22 - 25之一的群(17)，其中引入 的DM-分子(6)包含至少两个DNA序列(40)，各编码不同的指示分子(5 )。
27. 根据权利要求18-20和22 - 26之一的群(17),其中群(17) 的各个干细胞(1)包含至少两个引入的DNA-分子(6)，其各包含编 码指示分子(5)的DNA序列(40),其中引入的DNA-分子(6)的DNA 序列(40)编码不同的指示分子(5)。
28. 根据权利要求27的群(17)，其中不同的指示分子(5)具 有不同的特性。
29. 根据权利要求18-20和22 - 28的之一的群(17)，其中引 入的DNA-分子(6 )包含编码具有铁磁性分子特性的指示分子的序列。
30. 根据权利要求1 - 15之一的干细胞(1 )，其中引入的DNA-分子(6 )包含相对天然干细胞群是异源的编码细胞表面表达的蛋白质 的序列。
31. 根据权利要求21的未经修饰的群(19 )用于组织工程目的的 用途。
32. 根据权利要求21或31的群(19)在制备用于体内治疗组织 和血液疾病的试剂中的用途。
33. 根据权利要求21或31的群(19 )在制备用于体外治疗組织 和血液疾病的试剂中的用途。
34. 根据权利要求21或31至33之一的群(19)的用途，其中所述试剂与其它添加剂联合给予。
35. 根据权利要求34的群(19)的用途，其中所述的添加剂为激素、维生素、生长因子、其它蛋白质、其它酶或其组合。
36. 用于获得基本均质的定向分化为相同的特异性表型的干细胞 群(17)的方法，其包括以下步骤A) 收集包含干细胞的干细胞样品(10)，所述干细胞各包含细胞 DNA(2)，所述细胞DNA(2)包含多个编码不同基因的序列和允许DNA-蛋白质-相互作用的启动子；B) 向干细胞样品(10)的多个细胞中人工引入至少一个DNA-分 子(6),生产经修饰的干细胞样品(ll);其中引入的DNA-分子(6)包含 I)至少一个倾向于于与蛋白质分子(3 )相互作用的结合位点序 列(30);II)至少一个编码指示分子(5)的DNA-序列(40),所述指示 分子具有允许其鉴别的特性；III )至少一个最小启动子序列(50),其允许指示分子(5)的基 因表达；C) 向经修饰的干细胞样品(11)中添加培养基；D) 向经修饰的干细胞样品(11)施加特异性剌激(12)，其中特 异性刺激(12)在经修饰的干细胞样品(11 )的至少一个干细胞中产 生蛋白质分子(3);E )通过借助指示分子(5 )的特性鉴别指示分子(5 )在干细胞(1 ) 中存在而鉴别包含蛋白质分子(3)的干细胞(1);F) 其中所述的指示分子(5)通过借助蛋白质分子(3)和引入的 DNA-分子(6)的结合位点序列(30)之间的相互作用启动的DM序 列(40)的合成来生产；G) 借助指示分子(5)的特性将经鉴定的干细胞(1)选择为基本 均质的干细胞群(17)。
37. 根据权利要求36的方法，其中蛋白质分子(3)为提高与变化为特异性表型相关的基因的表达的转录因子蛋白。
38. 根据权利要求36或37的方法，其中最小启动子序列(50) 排列在位于结合位点序列(30 )和编码指示分子(5 )的DNA序列(40 ) 之间的人工引入的DNA-分子(6)中。
39. 根据权利要求36 - 38之一的方法，其中特异性刺激(U)为 物理、化学或生物化学刺激。
40. 根据权利要求36 - 39之一的方法，其中允许鉴别和/或选择 所述指示分子(5)的指示分子(5)的特性为化学、生物化学或物理 特性。
41. 根据权利要求36 - 40之一的方法，其中指示分子(5)为相对天然干细胞群是异源的细胞表面表达的蛋白质。
42. 根据权利要求36 - 40之一的方法，其中指示分子(5)具有铁 磁性的特性。
43. 根据权利要求36 - 40之一的方法，其中引入的DNA-分子(6) 的DNA序列(40)为编码下组的指示分子的序列绿色焚光蛋白(GFP)、 青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)。
44. 根据权利要求36 - 43之一的方法，其中引入的DNA-分子(6) 包含至少两个DNA序列(40)，其各编码不同的指示分子(5)。
45. 根据权利要求36 - 44之一的方法，其中将至少两个引入的 DNA-分子(6)人工引入千细胞样品的多个千细胞中，所述的至少两个 引入的DNA-分子(6)各包含至少一个编码指示分子(5)的DM序列(40)，其中引入的DNA-分子(6)的DNA序列(40)编码不同的指 示分子(5)。
46. 根据权利要求45的方法，其中不同的指示分子(5)具有不 同的特性。
47. 根据权利要求36 - 46之一用于获得未经修饰的干细胞的均质 干细胞群的方法，所述干细胞借助细胞DNA (2)和蛋白质分子之间的 特异性相互作用定向分化为特异性干细胞表型，包括以下附加的步骤H) 借助通过指示分子(5)的特性鉴别指示分子(5)的存在而鉴 别在细胞分裂后包含引入的DNA-分子(6)的子代干细胞(20);I) 从群(17)中选择并去除经鉴定的子代干细胞(31)。
48. 包含定向分化为至少两种不同的特异性干细胞表型的干细胞的异质干细胞群，其中所述干细胞各包含A) 包含多个编码不同的基因的序列和允许DNA-蛋白质相互作用 的细胞DNA(2);和B) 至少两个人工引入干细胞样品(IO)的多个细胞中的不同DNA-分子(6)其中引入的DNA-分子(6)各包含a)至少一个倾向于与蛋白质分子(3)相互作用的结合位点序列(30);b) 至少一个编码指示分子(5)的DNA序列(40)，所述指示分子 (5 )具有允许其鉴别的特性；和c) 至少一个最小启动子序列(50)，其允许所述指示分子的基 因表达，其中d) 不同的引入的DNA-分子(6)包含两个不同的编码两个不同 的指示分子(5 )的DNA序列(40 );和C) 至少一个通过引入的DNA-分子(6)的DNA序列(40)的合成 生产的指示分子(5)，其具有允许所述指示分子鉴别的特性，其中D) 定向分化为相同的特异性干细胞表型的干细胞包含相同的指示 分子(5 )。
49.包含定向分化为至少两种不同的特异性干细胞表型的干细胞 的两个不同干细胞群，其中所述干细胞各包含A) 包含多个编码不同基因的序列和允许DNA-蛋白质相互作用的 启动子的细胞DNA (2);B) 至少一个人工引入干细胞样品(10)的多个干细胞中的DNA-分子(6)其中人工引入的DNA-分子(6)各包含a) 至少一个倾向于与蛋白质分子(3)相互作用的结合位点序列 (30);b) 至少一个编码指示分子(5)的DNA序列(40)，所述指示分子 (5)具有允许其鉴别的特性；和c) 至少一个最小启动子序列(50)，其允许所迷指示分子的基 因表达，其中d) 不同的引入的DNA-分子(6)包含编码两种不同的指示分子(5) 的两个不同的DNA序列(40);和C) 至少一个通过引入的DNA-分子(6)的DNA序列(40)的合成 生产的指示分子(5)，其具有允许所述指示分子鉴别的特性，其中D )定向分化为相同的特异性干细胞表型的干细胞包含相同的指示分子(5 )。
50. 根据权利要求49的两种不同的干细胞(1)的群(17),其 中在步骤B)下至少一个DNA-分子(6)各被人工引入千细胞样品(10) 的所有干细胞中。
51. 根据权利要求50的群，其中不同的指示分子(5)具有不同 的特性。
全文摘要
干细胞(1)包含细胞DNA(2)，其包含多个编码不同基因的序列和允许DNA-蛋白质相互作用的启动子，至少一种借助特异性刺激(12)产生的蛋白质分子(3)和至少一个人工引入干细胞(1)中的DNA-分子(6)。人工引入的DNA-分子(6)包含至少一个倾向于与蛋白质分子(3)相互作用的结合位点序列(30)，至少一个编码指示分子(5)的DNA序列(40)和至少一个最小启动子序列(50)，允许所述指示分子(5)的基因表达，其中所述干细胞还包含至少一个指示分子(5)，其具有允许其鉴别的特性并通过编码人工引入的DNA-分子(6)的指示分子(5)的DNA序列(40)的合成而生产。
文档编号C12N5/077GK101506352SQ200680055596
公开日2009年8月12日 申请日期2006年8月11日 优先权日2006年8月11日
发明者A·阿里尼, M·斯图达特 申请人:达沃斯Ao研究所