专利名称：：用于在梭菌属中进行染色体整合和dna序列替换的方法用于在梭菌属中进行染色体整合和DNA序列替换的方法
背景技术：
：梭菌属(C/o^Wa)是革兰氏阳性、厌氧、低GC的细菌，由于它们产生溶剂，特别是丁醇、乙醇和丙酮、还有二醇如1，3-丙二醇、有机酸如乙酸、丁酸或乳酸，以及疫苗等的能力而在工业上得到了广泛使用。重组梭菌属的构建是在本领域中开发的一个重要的部分。对梭菌属菌抹进行基因修饰来改进它们的产业能力。为了进行这些修饰，同源重组是在所有种类的生物中使用最多的技术。本领域中对于数种微生物中的转化和同源重组已经有了详尽的描述。参见例^口(Datsenko禾口Wanner;PNAS,2000)及(Fabret等，MolecularMicrobiology,2002)。梭菌属并不是可天然转化的，现有可用于它们的转化的方法效率不高，而且不能导入多个突变。这一点已经阻碍了该领域的产业开发。梭菌属通常产生胞外DNAse和限制酶，这些酶在外源DNA导入待转化细胞之前或之后会将其降解。基于PCR片段导入的经典方法在许多微生物如大肠杆菌或酵母中行之有效，但在这些生物中不实用，因为待重组的DNA构建体的胞内及胞外半衰期太短，而且重组效率一般不高。在其它生物中，人们利用了能在宿主中复制从而增加重组事件可能性的载体来应付这些难题。然而，在重组事件之后，必须去除掉携带上完整的靶DNA序列的载体。这个问题在乳酸乳球菌(丄actococa^/octo)中通过使用可在非许可(non-permissive)温度下予以去除的温度敏感型复制子而得到了解决(Biswas等，JBacteriol.,1993)。对于梭菌，目前没有具备这些性质的载体可供使用。因此，迄今为止，梭菌属中突变体的构建是非常费力的，而且往往不成功。梭菌属中基因的失活在下列文献中有报道(见表1)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>迄今为止，梭菌属中的基因失活是通过用不能在靶菌林中复制的环状DNA转化来进行的。由于存在于梭菌属中的DNAse和DNA限制性内切核酸酶快速地降解导入的DNA，而且该属中的重組频率通常不是很高，因此突变体的获得是非常费力的。此外，到目前已描述的重组菌抹(见上文)都是对MLS或氯霉素有抗性的，而且在重组事件发生后不能去除相应的标志基因。这就将可能的重组次数限制在这些细菌中可用的抗性标志的数目，最大为3。此外，对于这些细菌的产业应用，不带标志的菌林可能是有用的，以避免将抗性素抗性基因释放到发酵培养基中。此外，这些菌林中的一些通过单重组事件得到的菌抹具有这样的缺点，即它们如果在没有任何选择压力下培养是不稳定的。因此，当前技术仍然需要这样的梭菌属转化方法其具有高效率，具有容易的重组菌抹选择步骤，容许在同一菌林中进行连续的DNA序列替换，从而可获得遗传上稳定的、不含标志的重组梭菌属。本发明涉及在梭菌属中替换或删除DNA序列的新方法，其容易实施并适于在产业水平应用。该方法可用来以常规方式对梭菌属中的数个基因位点进行修饰。该方法是基于可用于高效转化梭菌属的复制型载体。利用这种新方法，通过从基因组中去除抗性盒并将它们重新用于后续轮次的DNA序列替换中，可以将数目不限的突变导入基因组中。向梭菌属中高效导入多个突变将使得工业界能够改善现有的工业用菌才朱并开发新的方法。发明详述.本发明提供在梭菌属中通过同源重组替换靶DNA序列的方法，其包括_用载体转化所述菌林，所述载体包含-允许其在梭菌属中复制的复制起点，和-替换盒，其包含第一标志基因，该标志基因被两个与靶DNA序列周围的选定区域同源的序列所包围，从而允许该盒的重组，和-第二标志基因，-选择已在其基因组中整合了所述盒，并且表达所述第一标志基因的菌抹，-选择已去除了所述载体的不表达所述第二标志基因的菌林。用于实现本发明的所有分子生物学技术都在Sambrook、Fritsch和Maniatis所著的《Molecularcloning:alaboratorymanual》，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989中有完整描述。在本发明的语境中使用时，术语对靶DNA序列的"替换"意思是在靶DNA序列的基因座(locus)导入与原序列不同的序列。根据本发明，DNA序列定义为基因或基因间序列。它们二者都可以包含启动子或调控序列。表述"耙DNA序列"意思是本领域技术人员所选择的任何感兴趣的基因、基因间区域、启动子或调控序列。该表述特别意指编码感兴趣的蛋白质(例如涉及细胞代谢的酶)的基因。被替换上/插入的DNA序列可以是编码的或者非编码的。它可以是靶基因的突变序列、启动子或调控序列、和/或标志如抗生素抗性基因或生色酶(colorgeneratingenzyme)。它可以长于或短于^皮替4灸下的序列，这依赖于两个同源区域之间相隔的距离。作为插入的结果，靶基因的表达常常被干扰、部分或全部抑制、或者白、启动子或调控序列的实际表达。如果靶DNA序列替换的结果导致所述DNA序列被完全去除，则将该基因作为被"删除的"。表述"同源重组，，是指DNA区段被另一具有相同区域(同源)或大体如此的DNA区段替代的事件。这样的事件也称为DNA交换(crossover)。术语"转化"是指细胞纳入外源核酸，这种新基因的获取是暂时性的(如果携带基因的质粒被清除的话)或者永久性的(在外源DNA整合到染色体的情况下)。术语"载体，，是指一种携带基因或盒的染色体外元件(extra-chromosomalelement),其通常是环状双链DNA分子的形式，但也可以是单链DNA分子。术语"载体"和"质粒"可以无区别地使用。根据本发明的载体是复制型载体。其包含至少一个复制起点，优选数个复制起点，从而容许它在不同的物种中是有功能的。特别地，优选的载体可包含两个复制起点-Ori,在大肠杆菌中有功能；-来自在枯草芽孢杆菌(及swto7/"发表的pIM13的RepL，在梭菌属中有功能(Mermelstein等，Biotechnology,1992)。表述"与靶DNA序列同源的序列"是指与靶序列中所选区域具有高序列相似性的序列。术语"标志基因"是指梭菌属中有功能的调控元件的控制下编码标志蛋白的序列。这样的蛋白是本领域公知的。例如，本领域技术人员可使用抗生素抗性基因、焚光或有色标志、或营养缺陷型标志。有用的标志基因的实例将在下文给出。发生同源重组事件之后，当前的质粒携带完整的靶DNA序列，因此必须予以去除。复制型载体的去除通常这样发生连续培养克隆，然后负选择或正选择去除了该载体的克隆。载体的去除也可以是方法中的主动步骤(activestep),使用特异性地切割载体中存在的DNA序列的内切核酸酶。一旦清除了该载体，菌抹不再表达第二标志基因，并可根据该特性加以选择。在本发明的一个具体的实施方案中，第二标志基因是抗生素抗性基因。在有用的抗生素抗性基因中，本领域技术人员将知道哪种是最适合的。例如，可使用下列基因CatP基因，其提供针对氯霉素和曱砜霉素的抗性，或MLSR基因，其提供针对红霉素的抗性。在本发明的一个优选的实施方案中，第二抗性基因是可反选择的(counter-seletable)标、志基因。可反选择的标志是这样的基因，在特定环境下，如存在它的相关底物时，它的存在对宿主生物是致死的。可反选择的标志可用作针对质粒丧失的正选择。优选的是，可反选择的标志基因是这样的基因，它可恢复缺失的或被删除的非必需内源基因的活性。用得最多的可反选择的标志是赋予蔗糖、链霉素、或镰孢菌酸(fUsaricacid)敏感性的基因。它们已被用来在数种细菌菌抹中构建突变体或疫苗林。详情见Reyrat等，1998,InfectionandImmunity中的综述。可在梭菌属中使用的可反选择的标志包括赋予对5-氟-尿嘧啶(5-FU)、Y-谷氨酰肼(GBS)或8-氮杂-2，6-二氨基。票呤(8ADP)的敏感性的基因。在一个优选的实施方案中，可反选择的标志是基因，其编码尿嘧啶磷酸核糖基转移酶，该酶促进5-氟-尿嘧咬(5-FU)转化成毒性产物。具有Upp活性的细胞不能在5-FU培养基上生长。如果被转化的梭菌属是Aupp，并因此在去除载体之后、转化之前能够在含5-FU的培养基上生长，则使用这样的可反选择的标志是特别有用的。可以正向选择去除了所述载体的菌抹。在5-FU存在条件下可能在wpp基因中产生的抑制突变体(suppressormutants)有时可导致关于质粒丧失的错误假定。在本发明的一个优选的实施方案中，所述载体还包含第三标志，优选是抗生素抗性基因，其容许再次选择对该抗生素敏感的菌林。可以在基于基因的正选择之外可使用这样的负选择。在本发明的一个优选的实施方案中，通过在发生重组事件后用内切核酸酶消化来去除载体。优选地，载体包含这样的DNA序列，它们被限制性内切核酸酶所识别，同时不存在于所用的梭菌属物种的基因组中。这样，载体被特异性地破坏而无损于梭菌属基因组的完整性。限制性内切核酸酶是这样的酶，它们能在特异性碱基序列的位置，即限制性内切核酸酶位点切割DNA分子。本领域的专家将能够确定哪些限制性内切核酸酶位点是感兴趣的梭菌属菌抹的基因组中不存在的。可适用于丙酮丁醇^_菌的可能的限制性内切核酸酶有Ascl、F化I、Wort、S/I、5>/1。在另一个实施方案中，可以使用大范围核酸酶(meganucleases),如I-Scel、HO或I-OeI，它们识別大的(12-45bp)DNA靶位点。在本发明的一个优选的实施方案中，待转化的梭菌属菌林在其基因组上包含至少一个编码内切核酸酶的基因，所述核酸酶识别存在于所述载体上的限制性内切核酸酶位点。任选地，所述限制性内切核酸酶的表达处于诱导型启动子的控制之下。诱导型启动子是这样的DNA元件，其允许通过添加相应的诱导物来有条件地表达乾序列。例如，Girbal等，2003，Appl.Env.Microbiol.69:4985-8中描述了本领域专家已知的梭菌属中的诱导型启动子系统。在重组事件发生之后，筛选已去除载体的菌林之前，可以诱导所述限制性内切核酸酶的表达。所述限制性内切核酸酶将切割梭菌属中存在的载体，致使其被去除。任选地，可以在将载体导入菌抹之前，将限制性内切核酸酶编码基因插入到基因组上。在本发明的另一个实施方案中，限制性内切核酸酶编码基因还可以通过增加细胞中线性DNA的量(已知线性DNA的重组好于环状DNA)来增加质粒去除之前的重组频率。在本发明的一个特定的实施方案中，所述第一标志基因是被导入到替换盒中间的抗生素抗性基因。在本发明的一个具体的实施方案中，该第一标志基因可以从被转化的梭菌属菌抹的基因组上除去。特别地，该第一标志基因可以被两个重组酶靶位点所包围，并且在同源重组事件发生之后在重组酶的作用下被去除。在本发明的一个有利的实施方案中，重组酶是由携带相应基因的第二载体所表达的，所述载体是通过转化导入所述梭菌属的。优选地，重组酶耙位点是FRT序列。源自酿酒酵母(5"acc/wramyc"ce"v&Vze)的FLP重组酶对于一种特定的34碱基对DNA序列有活性，该序列称作FRT序列(代表"FLP重组酶耙标")。当存在两个这样的FRT位点时，FLP酶在DNA链中产生双链缺口，将第一FRT的末端与第二靶序列的末端交换，然后将经过交换的链重新连接。该过程导致位于这两个位点之间的DNA被删除。在实施本发明的一个特定的方式中，与靶DNA序列周围的所选区域同源的序列可在构成重组事件所用的DNA片段的多达10%的碱基对中包含突变。在本发明的一个有利的实施方案中，待转化的梭菌属菌抹被删除了编码限制性内切核酸酶的基因。这些菌林的优点在于可以容易地转化它们而无需任何事先的体内质粒曱基化。在本发明的另一个有利的实施方案中，待转化的梭菌属菌林被删除了编码胞外DNAses的基因。在本发明的另一个实施方案中，待转化的梭菌属菌林被删除了叫!p基因。在本发明的另一个有利的实施方案中，待转化的梭菌属菌林选自下组丙西同丁@孚斗炎菌、，早氏才炎菌(C7oWnWwwZ^/ezV/wcA://)、C7ostWWwwsacc/z"ro/e/^M/^/acefow/cwm、丁酸斗炎菌(C7ostn.<i/wwZ^^^/cwm)、酷酸斗炎菌(C7a^nWwm/M/)r/cwm)、产气荚月莫4炎菌、石皮伤风才炎菌(C7os/〃W/wm^to"Z)、生孑包才炎菌(C7ost"'(i/wws/orogewe力、热纟千纟,才炎菌(C/osfn'tZ/wm^zenwoce〃ww)、解糖梭菌(C7oWnV/&m^cc/zara/卢/cww)(现称解糖嗜热厌氣杆菌(T7e缩oa"aeraZ)ac/ersacc/zoro/,'c讓))、热产石屁碌梭菌(C7asfrWwwf/^r附cwM^/^roge"&y)(现^尔SA产石克石黄？普热厌氧斥干菌(77zer附。a"aeroZ)acferthermosulfUrigenes))、戎A石克4匕氢斗炎菌(C7ostnVi/ww//zerwo/zj^/royw^wn'cwm)(J见-尔乙酉孚p耆热厌氧^干菌(77zermoawaeroZw"ere^awo/Zci^XK优选的梭菌属菌株是丙酮丁醇梭菌。在本发明的一个优选的实施方案中，待转化的丙酮丁醇梭菌菌抹是菌抹ACac75，其删除了编码限制性内切核酸酶Cac824I的基因。该菌抹具有这样的优点它可容易地转化而无需任何事先的体内质粒曱基化。在本发明的另一个优选的实施方案中，待转化的丙酮丁醇梭菌菌抹是删除了其w;^基因的菌林，称为Ai^p。结果是，通过用携带upp基因的载体转化该菌林，可以选择对5-FU培养基敏感的菌抹，然后正选择失去了该质粒的不再对5-FU培养基敏感的菌抹。待转化的丙酮丁醇梭菌菌抹也可以是AC"c"Aw/p。该方法可有利地用来在同一梭菌属菌抹中通过同源重组来连续替换两个或更多个靶基因。本发明还涉及易于通过本发明的方法获得的重组梭菌属菌株。有利的是，所述本发明的方法可以用来获得其中c"cl5基因被删除的重组梭菌属菌林(Acacl5菌林)、其中wp;基因被删除的重组梭菌属菌林(Aupp菌抹)、及其中cacl5基因和w;p基因都被删除的重组梭菌属菌株(Acac75AM/;菌株)。本发明还涉及用于转化所述菌株的载体，如上述的载体。图1:pUC18-FRT-MLS2载体的图。图2:pCons2-l载体的图。图3:pCIP2-l载体的图。图4:pCons::UPP载体的图。图5:pCLFl载体的图。图6:用于梭菌属的删除方法的示意图。连续地进行下列步骤A-扩增靶DNA序列周围的两个选定区域；1、2、3、4代表PCR引物；B-将所得的PCR片段克隆到克隆载体pTOPO中C-将标志插入PCR引物中存在的限制性位点中D-将替换盒克隆到pCONS2.1的S"wHI位点构建pREPcloY载体E-用pREPcloY载体转化梭菌属F-在传代培养中通过双交换将替换盒整合到染色体中G-篩选具有EryR和Thiams表型的克隆H-进行PCR分析以检验基因替换和质粒丧失。或者D，-将替换盒克隆到pCONS::UPP的5awHI位点构建pREPcloY:UPP载体E，-用pREPcloY:UPP载体转化4炎菌F，-在传代培养中通过双交换将替换盒整合到染色体中G，-筛选具有EryR和5-FUR(ThiamS)表型的克隆H，-进行PCR分析以检验基因替换和质粒丧失。实施例,滋辦7:戎谬的种建"/"C7S-F灯-MLS2的沟建这种质粒含有MLSr基因，该基因在梭菌属中有功能，其侧翼有两个FRT位点和两个&wl位点；该质粒可用于替换盒的构建。以pKD4作为模板质粒(Datsenko和Wanner，2000)，以寡核苷酸PKD4.1和PKD4.2作为引物，使用PwoDNA聚合酶进行反向聚合酶链式反应(IPCR)来扩增带有FRT位点但不带有Km'标志的质粒区域。然后将该平末端片段与用///"dill消化pETSPO质粒(Harris等，2002，J.Bacteriol)并经Klenow处理后得到的MLSr基因连接。然后将相应的质粒(pKD4-Eryl)用作模板，使用寡核苷酸FRT-MLSR-F和FRT-MLSR-R作为引物，利用PwoDNA聚合酶进行PCR反应，以扩增侧翼具有两个FRT位点和两个位点的MLS""基因。将该片段直接克隆到用Smal消化的pUC18中以得到pUClS-FRT-MLS2质粒(图1)。Per引物PKD4.1(SEQIDN。1):5，-c欲cgccc妙膽鄉c,，膽鄉怨-3，PKD4.2(SEQIDN02):5，-agcccgg5^<3/"a^g"ggag〃c"cgccc-3，FRT-MLSR-F(SEQIDN03):5，-toc"ggcc"g"gcgaH^gtogg"ggagc-3，FRT-MLSR隱R(SEQIDN°4):5，-aacfl欲cc軟g啤加cgcac妙gwagccc-3，7.2/Omy2/的游建这种质粒含有在梭菌属中有功能的pIM13复制起点(滚环复制机制)，可赋予对于曱砜霉素抗性的c^P基因，和一个独有的用于克隆替换盒的iamHI位点。在两步法中从pETSPO质粒(Harris等，2002,J.Bacteriol)构建这种质粒，以去除部分多接头以及一个5awHI位点和一个五coRI位点等等。以pETSPO为模板，寡核苷酸PCONSAccI和PCONSEcoRI为引物，使用PwoDNA聚合酶进行IPCR，并对PCR产物进行磷酸化和连接。转化大肠杆菌后，获得了pCons0质粒。然后将该质粒用SawHI消化以去除spoft4盒，纯化适当的DNA片段并进行连接而得到质粒pCons2-l。pCons2-l的图谱示于图2中。PCR引物:PCONSAccI(SEQIDN。5):5，画ccggggtaccgtcgacctgcagcc-3，PCONSEcoRI(SEQIDN°6):5，画gaattccgcgagctcggtacccggc-3，/.3/C7尸2-7我'沐的沟建在这项构建中，将pCons2-l的pIM13复制起点用pSOLl质粒(一种具有e复制机制的质粒)的复制起点所替代。为此目的，使用丙酮丁醇梭菌的总DNA作为模板，以寡核苷酸ori-3-D和ori-4-R为引物，使用PwoDNA聚合酶PCR扩增pSOLl的复制起点。将该PCR产物克隆到pCR-BluntII-TOPO中并将得到的质粒用五coRI消化，纯化2.2kb片段。类似地，用五coRI消化pCons2.1质粒，纯化2.4kb片段，并与含有pSOLl复制起点的2.2kb五coRI片段连接，得到质粒pCIP2-l(图3)。Per引物ORI-3-D(SEQIDN°7):5，-ccatcgatgggggtcatgcatcaatactatcccc-3'ORI-4-R(SEQIDN。8):5'-gcttecctgttttaatacctttcgg-3，74/Cora:,我雄^一々建将upp基因与其自身的核糖体结合位点(rbs)—起克隆到pCons2.1中紧邻Caf尸基因下游的Bcgl位点处，以构建wp/在Caf尸启动子4空制下表达的人工操纵子。以此方式，没有引入这样的同源区域，所述同源区域使得在使用tz/^基因作为质粒丧失的可反选择的标志的进一步的删除实验中，基因可能整合到Acacl5Aupp菌4朱的染色体中。使用寡核苷酸REP-UPPF和REP-UPPR作为引物从丙酮丁醇梭菌基因组DNAPCR(Pfu)扩增m/;基因及其rbs。将664bp的PCR产物用消化并克隆到用Bcgl消化并用T4DNA聚合酶处理以钝化末端的pCons2.1中。以此方式获得了pCons::UPP(见图4)复制型载体。PCR引物REP-UPPF(SEQIDN09):5，-aaaacagctgggaggaatgaaataatgagtaaagttacac-3，REP-UPPR(SEQIDN°10):5，-aaaacagctgttattttgtaccgaataatctatctccagc-3，A5/CZ^7我傳的沟建将编码FLP重组酶的酿酒酵母FZi37基因克隆到pCons2.1载体中，处于丙酮丁醇梭菌硫解酶0/z/)基因的RBS和启动子的控制之下，以允许在这种生物中的高表达。使用FLP1-D和FLP1-R寡核苦酸为引物，pCP20质粒(Datsenko和Wanner,2000)为模板PCR(Pfu)扩增F丄尸/基因。PCR引物-FLP1-D(SEQIDN。11):5，-aaaaggatccaaaaggagggattaaaatgccacaatttggtatattatgtaaaacaccacct-3,-FLP1-R(SEQIDN°12):5"-3肌tggCgCCgCgt3Cttat3tgCgtCt3tttetgtegg3tg333ggt3-3"FLP1-D具有5'延伸，该延伸包含一个SmwHI位点和A/的RBS序列。FLP1-R在PCR产物的3，引入了一个<S/oI位点。将PCR产物用J5awHI和S/oI消化，并直接克隆到已用同样的酶消化的pSOS95表达载体中，得到pEX-FLPl(6281pb)质粒。将pEX-FLPl的含FLP1表达盒的片段(1585pb)克隆到pCONS2.1的Sa/I位点，得到pCLFl(4878pb)质粒(图5)。:丙薪7"寧炎,*森竭aic&2"艰斜雜Wcfl"5M差厉^浙餘该方法的示意图见图6。使用来自丙酮丁醇梭菌的总DNA作为模板，以特定的两对寡核苷酸为引物(见表2)，使用PwoDNA聚合酶PCR扩增了围绕Cac8241编码基因(CAC1502)的两个DNA片段。使用引物对CAC1B-CAC2和CAC3-CAC4B分别获得了1493bp和999bpDNA片段。引物CAC1B和CAC4B都引入BawHI位点，而引物CAC2和CAC3具有弓1入汾wl位点的互补5'延伸序列。用引物CAC1B和CAC4B在PCR融合实验中连接DNA片段CAC1B-CAC2和CAC3-CAC4B,将所得的片段克隆到pCR4-TOPO-Blunt载体中得到pTOPO:cac15。在pTOPO:cac15的唯一的位点导入pUC18-FRT-MLS2的1372bp5VwI片段，该片段包含两侧均带有FRT序列的抗生素抗性MLSr基因。用BamHI消化所得质粒后，将获得的cac"W替换盒克隆到pCons2-l中的BamHI位点而产生pREPCAC15质粒，且克隆到pCIP2.1中而产生pCIPCAC15。将pREPCAC15和pCIPCAC15质粒在体内曱基化，并用来通过电穿孔转化丙酮丁醇梭菌。在Petri(陪替氏)平板上选择对红霉素(40)ig/ml)具有抗性的克隆后，将各个转化体的一个菌落在含40pg/ml红霉素的液体合成培养基中培养24小时，然后在不含抗生素的液体2YTG培养基中传代培养。将适合的稀释物在含40jug/ml红霉素的加强型梭菌属琼脂(reinforcedClostridiumagar,RCA)上铺板。为了选择已丧失pREPCAC15或pCIPCAC15载体的整合体，将红霉素抗性克隆在含有40Mg/ml红霉素的RCA和含50jig/ml曱砜霉素的RCA上影印平板。pREPCAC15转化体得到了数个具有期望表型的菌落，但pCIPCAC15转化体未得到这样的菌落。这一点表明在促进丙酮丁醇梭菌中的双交换方面，pCIPCAC15的e复制机制不如滚环机制有利。通过PCR分析检验了对红霉素有抗性而对甲砜霉素敏感的克隆的基因型(使用位于CAC15替换盒外部的引物CAC0及CAC5，和位于cac"M内部的引物CACD及CACR)。分离了已丧失pREPCAC15的Acac"::m//菌林。用pCLFl载体转化厶^"5.附//菌抹，该载体表达来自酿酒酵母的编码Flp重组酶的尸Z尸7基因。经过转化并在陪替氏平板上选择对于曱砜霉素(50叫/ml)的抗性后，将一个菌落用含50ng/ml曱砜霉素的合成液体培养基培养，并将合适的稀释物在含50pg/ml曱砜霉素的RCA上铺板。将甲砜霉素抗性克隆在含40pg/ml红霉素的RCA和含50pg/ml曱砜霉素的RCA上影印平板。用引物CAC0和CAC5B通过PCR分析检验了具有红霉素敏感性和曱砜霉素抗性的克隆的基因型。将具有红霉素敏感性和甲砜霉素抗性的菌林进行连续两轮24小时培养以释放(loose)pCLFl。根据其对红霉素和曱砜霉素二者的敏感性分离已丧失了pCLFl的Acac"菌林。将该菌林称为丙酮丁醇梭菌MGCA，/5。表2名称SEQIDN°引物序列CAC1B13aaaggatccatgcacactcataaatttactgtaggaagtctg，CAC214ggggaggcctEiEi犯3ggggggtcccaaateatatttgccat3gt犯cc3ccCAC315ccccctttttaggcctcccctcgaacttattagaatgattaagattccggCAC4B16aaaggatcctcattaaatttcctccattttaagcctgtcCACO17gtgatataattttcctttaaatggaggaggatctgCAC5B18gccgttaatagacattataattccattggcCACD19ga3ttctt犯3犯tatttggatcatt肪gcggCACR20gttgtattggaatctttgttattatttctccc^滋辦3:丙薪7"辱拔霧doic25^薦竭^齊定>#磁>#潜差脊移遊的"/^差西时浙餘使用来自丙酮丁醇梭菌的总DNA作为模板，两对特定的寡核苷酸作为引物(见表3)，使用PwoDNA聚合酶PCR扩增了w;p(C4C2S79)上游和下游的两个DNA片段。使用引物对UPPl-UPP2和UPP3-UPP4，分别得到了1103bp和1105bpDNA片段。引物UPP1和UPP4引入SawHI位点，而引物UPP2和UPP3具有引入5VwI位点的5'延伸序列。使用引物UPP1和UPP4在PCR融合实验中连接DNA片段UPPl-UPP2和UPP3-UPP4,并将所得片段克隆到pCR4-TOPO-Blunt中得到pTOPO:upp。在pTOPO:upp的唯一位点处引入pUC18-FRT-MLS2的1372bp&wl片段，该片段包含两侧均带有FRT序列的抗生素抗性MLSr基因。用BamHI消化所得质粒后，将获得的替换盒克隆到pCons2-l中的Bawffl位点而产生pREPUPP质粒。使用质粒pREPUPP在不经事先体内曱基化的条件下通过电穿孔转化丙酮丁醇梭菌MGCAcgc"。在陪替氏平板上选择对红霉素(40jug/ml)具有抗性的克隆后，将一个菌落在含40ng/ml红霉素的液体合成培养基中培养24小时，然后在不含抗生素的液体2YTG培养基中传代培养。将适合的稀释物在含40|ig/ml红霉素的RCA上铺板。为了选择已丧失pREPUPP载体的整合体，将红霉素抗性克隆在含有40吗/ml红霉素的RCA和含50pg/ml曱砜霉素的RCA上影印平板。通过PCR分析检验了对红霉素有抗性而对曱砜霉素敏感的克隆的基因型(使用位于UPP替换盒外部的引物UPP0及UPP5，和位于t/尸尸内部的引物UPPD及UPPR)。分离了已丧失pREPUPP的Acac"Awp/7.vm//菌林。如前文第一个实施例中所述确认了在先的c"c7502删除。厶<^^"厶";/..:附//菌林对400pM5-FU有抗性，而相比之下Acac"菌抹对50pM5-FU有抗性。用pCLFl载体转化&"("厶^;,:附//菌林，该载体表达来自酿酒酵母的编码Flp重组酶的基因。经过转化并在陪替氏平板上选择对曱砜霉素(50(ig/ml)的抗性后，将一个菌落用含50|ag/ml曱砜霉素的合成液体培养基培养，并将适合的稀释物在含50jtig/ml曱砜霉素的RCA上铺板。将曱砜霉素抗性克隆在含40吗/ml红霉素的RCA和含50pg/ml甲砜霉素的RCA上影印平板。用引物UPP0和UPP5通过PCR分析检验了具有红霉素敏感性和曱砜霉素抗性的克隆的基因型。将具有红霉素敏感性和曱砜霉素抗性的Acac"A^;菌抹进行连续两轮24小时培养以释放pCLFl。通过确定其对红霉素和曱砜霉素二者的敏感性分离了已丧失了pCLFl的Acac/5Aw/p菌抹。16表3名称SEQIDN。引物序列UPP121aaaaggatcctcctgatctattaattcttgatgaacccUPP222ggggaggcctaaaaagggggattgcataaataaaaagggctgaaaaataaatttcagUPP323ccccc加teggcctccccttatttcattcctccattg1^ttttttttctatttgUPP424aaaaggatccgctattatgaataggttaaataagtcagctggUPP025aatecaagcaaagagaataggctatgtgccUPP526犯tsc犯gc犯3gag朋teggctetgtgccUPPD27ggcatatgaagtaacaagagaaatgcagcUPPR28她atctatctcragcatctcc肌gacc#滋辨"』。/;^5-處尿齊定"/^^^粒^^时jH逸举^cflcJ5J5差^辆餘使用来自丙酮丁醇梭菌的总DNA作为沖莫板和两对特定的寡核苷酸(见表4)，使用PwoDNA聚合酶PCR扩增了cac^535基因(其编码丙酮丁醇梭菌的另一个限制性修饰系统)上游和下游的两个DNA片段。使用引物对RMl-RM2和RM3-RM4，分别得到了lkbp和0.9kbp的DNA片段。引物RM1和RM4引入SawHI位点，而引物RM2和RM3具有引入5hJ位点的互补5，-延伸序列。使用引物RM1和RM4在PCR融合实验中连接了DNA片段RMl-RM2和RM3-RM4，将所得片段克隆到pCR4-TOPO-Blunt载体中得到pTOPO:cac3535质粒。在pTOPO:cac3535的唯一位点处引入pUC18-FRT-MLS2的1372bp5VwI片段，该片段包含两侧均带有FRT序列的抗生素抗性MLS"基因。用BamHI消化所得质粒后，将获得的CAC3535替换盒克隆到pCons::upp中的丑awffl位点而产生pREPCAC3535::upp质粒。使用质粒pREPCAC3535::upp通过电穿孔转化丙酮丁醇梭菌MGCAc"c"Awp;菌林。在陪替氏平板上选择对红霉素(40pg/ml)具有抗性的克隆后，将一个菌落在含40pg/ml红霉素的液体合成培养基中培养24小时，并将100(il未稀释的培养物在含40ng/ml红霉素和4005-FU的RCA上铺板。将对红霉素和5-FU二者有抗性的菌落在含40吗/ml红霉素的RCA和含50吗/ml曱砜霉素的RCA上影印平板，以验证5-FU抗性与甲砜霉素敏感性相关。通过PCR分析检验了对红霉素有抗性且对曱砜霉素敏感的克17隆的基因型(使用位于cac3535替换盒外部的引物RM0及RM5，和位于cac3535基因内部的引物RMD及RMR)。以此方式，分离了已丧失pREPCAC3535::upp的Acac75Aw//Acac35::m//菌冲朱。表4名称SEQIDN°引物序列RM129aaaaggatccgcagctttctggaaggactacggcg固230ggggaggcctaaaaagggggcatttacttatggtacggttcacccc固331ccccctttttaggcctccccgtctttaaaaagtaatttatcaaaggcatcaaggc腿432ccccctttttaggcctccccgtctttaaaaagtaatttatcaaaggcatcaaggc腹033cacattgtcatttataaaagtccctaggg腹534gtagtaattccaacttcaactcttgccacRMD35cttagaatagctgatattgcttgcgg脂R36agcatctctcttaatgattctccgg参考文献Be匿ttGN,ScotcherMCBLOCKINGSPORULATIONBYINHIBITINGSPOIIEWO2006007530公开于2006-01-19申请人:RICEUNIVERSITY(US)BiswasI,GrussA,EhrlichSD,MaguinE.High-efficiencygeneinactivationandreplacementsystemforgram-positivebacteria.JBacteriol.1993Jun;175(ll):3628-35.DatsenkoKA,WannerBLOne-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.ProcNatlAcadSciUSA,2000Jim6;97(12):6640-5.18FabretC，EhrlichSD,NoirotP.Anewmutationdeliverysystemforgenome-scaleapproachesinBacillussubtilis.MolMicrobiol.2002Oct;46(l):25隱36.GirbalL,Mortier-BarriereI,RaynaudF,RouanetC,CrouxC,SoucailleP.Developmentofasensitivegeneexpressionreportersystemandaninduciblepromoter-repressorsystemforClostridiumacetobutylicum.ApplEnvironMicrobiol.2003Aug;69(8):4985画8.GreenEM,BennettGN.Inactivationofanaldehyde/alcoholdehydrogenasegenefromClostridiumacetobutylicumATCC824.ApplBiochemBiotechnol.1996Spring;57-58:213画21.GreenEM,BoyntonZL,HarrisLM,RudolphFB,PapoutsakisET,BennettGN.GeneticmanipulationofacidformationpathwaysbygeneinactivationinClostridiumacetobutylicumATCC824.Microbiology.1996Aug;142(Pt8):2079陽86.HarrisLM，WelkerNE，PapoutsakisET.Northern,morphological,andfermentationanalysisofspoOAinactivationandoverexpressioninClostridiumacetobutylicumATCC824.JBacteriol.2002Jul;184(13):3586-97.H腦gIH，WatersM,GrauRR,SarkerMR.Disruptionofthegene(spoOA)encodingsporulationtranscriptionfactorblocksendosporeformationandenterotoxinproductioninenterotoxigenicClostridiumperfringenstypeA.FEMSMicrobiolLett.2004Apr15;233(2):233-40.19MermdsteinLD,WelkerNE,BennettGN，PapoutsakisET.ExpressionofclonedhomologousfermentativegenesinClostridiumacetobutylicumATCC824.Biotechnology(NY).1992Feb;10(2):l卯-5.OhtaniK,HayashiH,ShimizuT.TheluxSgeneisinvolvedincell-cellsignallingfortoxinproductioninClostridiumperfringens.MolMicrobiol.2002Apr;44(l):171-9.ReyratJM,PelicicV,GicquelB,RappuoliR.Counterselectablemarkers:untappedtoolsforbacterialgeneticsandpathogenesis.InfectImmun.1998Sep;66(9):4011-7.Review(综述).SarkerMR,CarmanRJ,McClaneBA.Inactivationofthegene(cpe)encodingClostridiumperfringensenterotoxineliminatestheabilityoftwocpe-positiveC.perfringenstypeAhumangastrointestinaldiseaseisolatestoaffectrabbitilealloops.MolMicrobiol.1999Sep;33(5):946-58.Erratumin:MolMicrobiol2000Jan;35(l):249.VargaJ，StirewaltVL,MelvilleSB.TheCcpAproteinisnecessaryforefficientsporulationandenterotoxingene(cpe)regulationinClostridiumperfringens.JBacteriol.2004Aug;186(16):5221-9.20权利要求1.在梭菌属中通过同源重组替换靶DNA序列的方法，其包括-用载体转化所述菌株，所述载体包含-允许其在梭菌属中复制的复制起点，和-替换盒，其包含第一标志基因，该标志基因被两个与靶DNA序列周围的选定区域同源的序列所包围，从而允许该盒的重组，和-第二标志基因，-选择已在其基因组中整合了所述盒的表达所述第一标志基因的菌株，-选择已去除了所述载体，并且不表达所述第二标志基因的菌株。2.根据权利要求1的方法，其中所述第二标志基因是抗生素抗性基因。3.根据权利要求1的方法，其中所述第二标志基因是可反选择的标志。4.根据权利要求3的方法，其中所述可反选择的标志是能恢复缺失或被删除的非必需基因的活性的基因。5.根据权利要求4的方法，其中所述可反选择的标志是w/p基因。6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述载体包含第三标志，其允许负选择去除了所述载体的菌抹。7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述载体是通过内切核酸酶消化而去除的。8.根据权利要求7的方法，其中所述载体含有这样的DNA序列，所述序列被限制性内切核酸酶识别，且同时不存在于所用的梭菌属菌抹的基因组中。9.根据权利要求7或8的方法，其中所用的梭菌属菌抹在其基因组上含有至少一种内切核酸酶，该酶对存在于所述载体中的限制性位点是特异性的，并且任选地在诱导型启动子的控制下表达。10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述第一标志基因是抗生素抗性基因。11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述第一标志基因被两个重组酶輩巴位点所包围。12.根据权利要求11的方法，其中在所述同源重组事件发生后，所述第一标志基因通过重组酶的作用而被去除。13.根据权利要求11或12中任一项的方法，其中所述重组酶是由导入到所述菌抹中的第二载体所携带的基因表达的。14.根据权利要求11-13中任一项的方法，其中所述重组酶靶位点是FRT序列，且所述重组酶是FLP重组酶。15.根据权利要求1-14中任一项的方法，其中所述与靶DNA序列周围区域同源的序列在多达10°/。的用于同源重组事件的石成基对中包含突变。16.根据权利要求1-15中任一项的方法，其中待转化的梭菌属被删除了限制性内切核酸酶编码基因。17.根据权利要求1-16中任一项的方法，其中待转化的梭菌属被删除了DNAse编码基因。18.根据权利要求1-17中任一项的方法，其中待转化的梭菌属被删除了，/基因。19.根据权利要求1-18中任一项的方法，其中所述梭菌属菌抹选自丙酉同丁酉享才复菌、,早氏才发菌、C7as^7'd/wmsacc/7wy/^^w^/acetom'cwm、丁酸冲炎菌(C7ostn'(i/wm6w(y/z'cww)、酪酸才麦菌(C7oy/n'(i/ww6z^)Wcmw)、产气荚月莫4炎菌、破伤风梭菌、生孢梭菌、热纤维梭菌、解糖梭菌(现称解糖嗜热厌氧杆菌)、热产硫磺梭菌(现称热产硫磺嗜热厌氧杆菌)、热硫化氢梭菌(现称乙醇嗜热厌氧杆菌)。20.根据权利要求19的方法，其中所述梭菌属菌抹是丙酮丁醇梭菌。21.根据权利要求20的方法，其中待转化的丙酮丁醇梭菌菌抹是Acac15。22.根据权利要求20的方法，其中待转化的丙酮丁醇梭菌菌抹是Aupp。23.根据权利要求20的方法，其中待转化的丙酮丁醇梭菌菌株是ACacl5Aupp。24.在同一梭菌属菌林中通过同源重组替换两个或更多个靶基因的方法，其中将根据权利要求1-23中任一项的方法连续进行两次或更多次。25.可通过根据权利要求1-24中任一项的方法获得的重组梭菌属菌抹。26.根据权利要求25的重组梭菌属菌林，其中基因cacl5被删除。27.根据权利要求25的重组梭菌属菌抹，其中基因w;p被删除。28.根据权利要求25的重组梭菌属菌林,其中基因cacl5和w;^都被删除。29.如权利要求1-15中任一项中所定义的载体。全文摘要本发明涉及一种在梭菌属中替换和删除DNA序列的新方法，该方法效率高、易于实施并且适于工业水平应用。该方法可用于以常规方式修饰梭菌属中的数个基因位点。该方法是基于携带至少两个标志基因的复制型载体。文档编号C12N15/87GK101528930SQ200680056007公开日2009年9月9日申请日期2006年10月3日优先权日2006年10月3日发明者克里斯琴·克劳克斯,菲利普·索凯尔,雷纳·菲格申请人:代谢探索者公司