专利名称：一种土壤dna样品制备试剂盒及其制备方法
一种土壤DNA样品制备试剂盒及其制备方法技术领蜮本发明涉及一种土壤DM样品制备试剂盒及其制备方法，用于变 性梯度凝胶电泳分析土壤细菌多样性的DM样品的制备，属于DNA分 析技术领域.背景技术目前，变性梯度凝胶电泳是使用最为广泛的土壤细菌多样性分析 方法，用于变性梯度凝胶电泳的DM样品制备过程包括土壤总DNA的 提取、纯化以及目标DNA的扩增。然而土壤DM提取和纯化工艺复杂， 途径多样，扩增难度大，制备过程费时费力，结果可比性差。发明内容本发诉的发明目的是为了提供一种土壤DNA样品制备试剂盒及其 制备方法，以克服现有DNA样品制备工艺复杂、难度大、费时费力的本发明的发明目的可以通过以下技术方案来实现。 一种土攘DM样品制备试剂盒，包括盒体和隔板；盛有溶液I的试剂瓶A，盛有溶液n的试剂瓶B,盛有溶液in的试剂瓶c,盛有溶液IV的试剂瓶D,盛有悬液V的试剂瓶E,内含酸洗玻璃珠的离心管F， 微型过滤器G， PCR (链式聚合酶反应)管H。其中，溶液I为120mmo1/1的磷酸盐缓冲液；溶液II的配比组成 为Tris HC1 (三羟甲基氨基甲烷 盐酸)1Ommo1/1, EDTA (乙二 胺四乙酸)lramo1/1， CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)0. 2%， pH8. 0; 溶液III为5扱o1/1的醋酸铵；溶液IV为异丙醇(纯品)；悬液V的配比 组成是Sephadex G75 2% (质量体积比)；酸洗玻璃珠0. 5g,直径约 0. 2mm; PCR管H的体积为200 ju 1 ，内盛有DNA引物各0. 25/a mol ， Taq酶2U， 4种dNTP (脱氧核糖核酸)各200 ia mol ， lxPCR反应缓 冲液100ul，冷冻干燥所得。离心管F为2ml的离心管。所有试剂与耗材均经无菌处理。所述的异丙醇保存在棕色试剂瓶中。土壤關A样品制备步骤如下a) 选择用于实验的环境土壤样品；b) 将用于步骤a)中的农田土壤经细胞裂解液裂解后，获得土壤中的 所有傲生物的基因组DNA;c) 将步骤b)获得的基因组DNA纯化后作为PCR扩增的模板；d) 选择一般用于原核生物16SrRNA ( 16S核糖体核糖核酸)基因扩 增的通用引物对；e) 在步骤d錄择的通用引物对的正向引物的一端加上GC发卡结构；f) 按照设计的PCR反应条件进行PCR扩增g)将步骤f)所述的PCR扩增产物作为样品保存备用。通过本发明技术方案设计而成的试剂盒，具有使用简便、结果稳 定，可有效地节省使用者时间和成本的优点。附围说明图i为试劉盒组成示意图； 图2为试刺盒操作步骤示意图。
具体实施方式
下面结合附图
与具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。1. 称取待处理的干燥分散(如含水量高，10000g离心2分钟，取 沉淀物备用)土壤样品0.5g的至离心管F中，加入lml溶液I (A), 轻微旋涡震荡混匀，2000g离心l 2min，去除上清液，重复操作一次；2. 取800ul溶液I1 (B)(注如果溶液II凝固，请置于60。C水浴 中加热溶解)至离心管F中，剧烈旋涡震荡2 5分钟，10000g离心l 2 分钟；3. 移取上清液400ul至洁净无菌的1.5ml离心管(自备)中，加入 400ul溶液m (C) , 4'C保温20分钟，10000g离心5 10分钟；4. 尽量吸取上清液至2ml离心管中(自备)，加入800ul溶液IV(D), 颠倒混合均匀，-20匸保温20分钟，10000g离心5 10分钟；5. 弃上清液，加入200ulTE (Tris-EDTA)溶液(或无菌水)悬 浮沉淀物，得溶液②；6. 移取潘液②至凝胶过滤柱①中，1000g离心l分钟，得到滤液③；7. 加入98ul无菌超纯水至PCR管(H)中，加入2ul溶液③，盖紧 盖子(注如果所用PCR仪没有热盖，再添加10ul无菌液体石蜡)；8. 将PCR管(H)放入PCR仪中，反应温度循环设置如下(1) 94匸变性10分钟；(2)以下是10个循环，94。C变性l分钟，65°C~55 'C复性1分钟，复性温度每个循环降低rC, 72。C延长l分钟；(3)以 下是20个循环，94。C l分钟，55°C l分钟，72°C l分钟；(4)72 'C延长8分钟，4'C保温。9. 得到DNA样品④备用，-20C保存。
权利要求
1. 一种土壤DNA样品制备试剂盒，包括盒体和隔板，其特征在于盛有溶液I的试剂瓶A，盛有溶液II的试剂瓶B，盛有溶液III的试剂瓶C，盛有溶液IV的试剂瓶D，盛有悬液V的试剂瓶E，内含酸洗玻璃珠的离心管F，微型过滤器G，PCR(链式聚合酶反应)管H。
2、 根据权利要求1所述的一种土壤DM样品制备试剂盒，其特 征在于溶液I为120mmo1/1的磷酸盐缓冲液；溶液II的配比组成为 Tris . HC1 1Ommo1/1， EDTA lmmo1/1， CTAB 0.2%, pH8. 0;溶液 III为5mo1/1的醋酸铵；溶液IV为异丙醇；悬液V的配比组成是质量 体积比为2%的SephadexG75;酸洗玻璃珠0. 5g,直径约0. 2mm; PCR 管H的体积为200 Ml，内盛有DM引物各O. 25jamo1, Taq酶2U， 4 种dNTP各200jamo1， 1 x PCR反应缓冲液100ul，冷冻干燥所得。
3、 根据权利要求1所述的一种土壤DNA样品制备试剂盒，其特 征在于离心管F为2ml的离心管。
4、 根据权利要求1所述的一种土壤DM样品制备试剂盒，其特 征在于所有试剂与耗材均经无菌处理。
5、 根裙权利要求1所述的一种土壤DNA样品制备试剂盒，其特征在于所述的异丙醇保存在棕色试剂瓶中。
6、 土壤DM样品制备步骤如下A) 选择用于实验的环境土壤样品；B) 将用于步骤A)中的农田土壤经细胞裂解液裂解后，获得土壤 中的所有微生物的基因组DNA;C) 将步骤B)获得的基因组DNA纯化后作为PCR扩增的模板；D) 选择一般用于原核生物16SrRNA (16S核糖体核糖核酸)基 因扩增的通用引物对；E) 在步骤D)选择的通用引物对的正向引物的一端加上GC发卡结构；F) 按照设计的PCR反应条件进行PCR扩增；G) 将步骤F)所述的PCR扩增产物作为样品保存备用。
全文摘要
本发明公开了一种土壤DNA样品制备试剂盒及其制备方法，包括盒体和隔板；盛有溶液I的试剂瓶A，盛有溶液II的试剂瓶B，盛有溶液III的试剂瓶C，盛有溶液IV的试剂瓶D，盛有悬液V的试剂瓶E，内含酸洗玻璃珠的离心管F，微型过滤器G，PCR(链式聚合酶反应)管H。通过本发明技术方案设计而成的试剂盒，具有使用简便、结果稳定，可有效地节省使用者时间和成本的优点。
文档编号C12M1/34GK101235350SQ200710037850
公开日2008年8月6日 申请日期2007年3月6日 优先权日2007年3月6日
发明者周海花, 梁丹涛, 沈根祥, 胡双庆, 赵庆节, 郭春霞, 钱晓雍, 顾海蓉, 黄丽华 申请人:上海市环境科学研究院